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1.
用基因疫苗pcDNA-H9和纯化H9N2亚型AIV免疫Balb/C小鼠,细胞融合后用HI和ELISA方法筛选出5株抗H9亚型AIV HA的特异性单克隆抗体H9-01(2E6),H9-02(3B1),H9-03(3H11),H9-04(1A4),H9-05(2G9)。各株单抗亚型测定的结果为H9-01,H9-02和H9-05均为IgG2b,H9-03为IgG1,H9-04为IgG2a,轻链的亚型均为kappa链。经特异性和与同型病毒的反应谱检测,它们均是HA特异性单克隆抗体。用制备的抗H9亚型AIV HA的单克隆抗体做成胶体金层析检测试纸条,可以检测到200个EID50的H9亚型AIV,为监测该亚型AIV试剂盒的进一步商品化奠定了基础。 相似文献
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制备抗H5亚型AIV血凝素单克隆抗体;依据淋巴细胞杂交瘤技术,用纯化的H5N1亚型AIV和重组噬菌体T4-H5HA免疫Balb/C小鼠,细胞融合后用ELISA方法筛选特异性单克隆抗体;获得6株抗H5亚型AIVHA的特异性单克隆抗体H5-01（1E6）、H5-02（2C2）、H5-03（2A8）、H5-04（2G6）、H5-05（2E9）和H5-06（3F6）。各株单抗亚型测定的结果为：H5-01、H5-02为IgG1,H5-03、H5-04为IgG2a,H5-05、H5-06为IgG2b,轻链的亚型均为kappa链;经特异性和与同型病毒的反应谱检测,6株均是抗H5亚型AIVHA特异性单克隆抗体,为进一步分析H5N1亚型AIV的结构与功能以及建立监测该亚型AIV的试剂盒奠定了基础。 相似文献
3.
[目的]制备H9亚型禽流感病毒(AIV)血凝素(HA)单克隆抗体,为检测诊断AIV提供技术支持.[方法]以灭活H9亚型AIV广西分离株为免疫原,免疫6~8周BALB/c雌性小鼠,然后取其脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合,经血凝抑制试验(HI)及间接免疫荧光试验(IFA)筛选H9亚型AIV血凝素单克隆抗体的杂交瘤细胞.[结果]经过4次亚克隆,获得3株稳定的H9单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别命名为8A4、1B11和7F1细胞株,其细胞株培养上清液HI效价为27~210,腹水HI效价为216~219;单克隆抗体亚类鉴定结果表明,3株H9单克隆抗体均属于IgG1亚类,其轻链均为K链.3株H9单克隆抗体只与H9亚型AIV发生特异性HI反应,而与其他HA亚型AIV及新城疫病毒(NDV)、减蛋综合症病毒(EDS)、传染性支气管炎病毒(IBV)无交叉反应.3株H9单克隆抗体细胞株的抗体分泌能力稳定性良好.[结论]用灭活H9亚型AIV为免疫原能成功制备针对H9亚型AIV血凝素的单克隆抗体,且具有良好的亚型广谱性和特异性. 相似文献
4.
用纯化的H5亚型禽流感病毒(AIV)抗原免疫Balb/C小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,经筛选,获得9株稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,其中4株能高效分泌血凝素(HA)蛋白特异性的单克隆抗体.特异性试验表明,IE6单克隆抗体仅与试验的H5病毒株反应,而不与新城疫病毒(NDV)、H9亚型AIV和产蛋下降综合症病毒(EDSV)反应.这9株单克隆抗体分别为IgG1、IgG2a、IgG2b、IgM亚类,κ轻链. 相似文献
5.
[目的]制备H9N2亚型禽流感病毒单克隆抗体和鉴定表位。[方法]选取H9N2亚型禽流感病毒(AIV)WD-1株的纯化抗原免疫BALB/c小鼠,对获得2株抗H9N2亚型禽流感病毒的特异性单抗4C10和6E3表位进行鉴定。[结果]单抗4C10和6E3分别属于IgG1和IgG2b亚型,ELISA检测效价分别为1∶10~3和1∶10~5;HI效价分别为2~(15)和2~(14);2株单抗均具有鸡胚中和活性。利用噬菌体展示表位技术对2株单抗的抗原表位进行鉴定,结果显示均为针对HA蛋白的1个线性表位。[结论]该研究为禽流感病毒快速诊断方法的建立提供了依据。 相似文献
6.
H7N9亚型禽流感病毒（AIV）的快速进化与变异使得其逃脱现有抗体的识别,为提供H7亚型AIV鉴别诊断所需重要材料,制备可识别H7亚型AIV HA蛋白的单克隆抗体（mAb）。采用差速离心法纯化的H7N9亚型AIV(A/Chicken/Guangdong/SW154/2015)免疫BALB/c小鼠,利用杂交瘤技术制备杂交瘤细胞,采用血凝抑制（HI）试验、免疫过氧化物酶单层细胞试验（IPMA）和间接ELISA检测方法筛选阳性杂交瘤细胞株。结果显示,获得5株稳定分泌抗H7N9 AIV HA蛋白mAb的杂交瘤细胞,腹水ELISA效价均为1∶1 000 000;其中,4株mAb的重链为IgG1,1株mAb的重链为IgG2b,轻链均为κ链。特异性测定结果显示,5株mAb仅与H7亚型AIV反应,不与其他亚型流感病毒发生反应;广谱性测定结果显示,5株mAb均可与不同年份分离出的H7亚型AIV发生反应;HI结果显示,腹水针对H7-Re3抗原株的HI效价为7 log2～12 log2;MDCK细胞微量中和试验结果显示,5株mAb均具有中和活性;Dot blot检测结果显示,5株mAb均可识别H7-Re2抗... 相似文献
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《江苏农业科学》2016,(6)
H9亚型禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)是危害我国养禽业的主要病毒之一,造成了严重的经济损失。根据H9亚型AIV的HA基因设计了1对引物,建立了H9亚型禽流感病毒的RT-PCR鉴定方法。H9亚型AIV的HA基因预期扩增的目的片断长度为425 bp。对H9N2亚型禽流感病毒不同稀释度的尿囊液进行检测,证实病毒尿囊液的最低检出量为1×10~(4.25)EID_(50)/100μL。建立的RT-PCR检测方法对H9、H3、H4、H5亚型AIV及新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒等进行检测,结果仅有H9N2亚型AIV出现特异性目的条带,其他均未出现目的条带,与其他常见禽病病原无交叉反应;用建立的RT-PCR和病毒分离2种方法同时对10株H9N2亚型AIV和8个病鸡组织的鸡胚尿囊液样品进行检测,结果 2种检测方法的符合率达100%。说明该鉴定方法特异性强,敏感性较高。 相似文献
8.
H9N2亚型禽流感病毒(AIV)变异快、传染性强,由病毒流行株制备而成的灭活疫苗达不到完全保护的效果,导致H9N2亚型禽流感时有发生。为研发具有广谱保护性的H9亚型禽流感疫苗,本研究利用生物信息技术,对H9亚型AIV HA基因序列进行分析,设计获得HA基因序列。将HA基因构建于杆状病毒表达系统,表达的重组HA蛋白血凝效价为1×212,与不同分支H9亚型AIV阳性血清具有良好的交叉反应活性。将重组蛋白制备成疫苗(rHA疫苗)免疫10日龄雏鸡,免疫后28 d将不同亚分支的H9亚型AIV流行毒株115和YZ株分别以1×106EID50(半数鸡胚感染量)感染试验鸡,rHA疫苗组交叉保护效力明显优于商品苗组。本研究结果表明H9亚型禽流感广谱型亚单位疫苗具有较好的应用前景,可以用于防控H9 AIV感染。 相似文献
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[目的]明确广西鸡源H9N2亚型禽流感病毒(AIV)的分子遗传变异规律及其对公共卫生安全的影响,为H9亚型禽流感(AI)的防控提供参考依据.[方法]从广西某肉鸡养殖场采集病料,经SPF鸡胚接种进行病毒分离,对初步鉴定为H9亚型AIV分离株的HA、NA、PB2、PB1、PA、NP、M和NS等8个基因片段进行克隆测定及遗传进化分析,同时对分离毒株的生物学特性进行测定.[结果]从广西发病鸡群中分离获得一株H9N2亚型AIV,命名为A/chicken/Guangxi/BT1/2016(H9N2).分离毒株A/chicken/Guangxi/BT1/2016(H9N2)HA基因的裂解位点为PSRSSR↓GLF,具有典型的低致病性AIV(LPAIV)分子特征,在遗传进化关系上属于4.2.5分支,与国内常用H9N2亚型AIV疫苗株所属的4.2.3分支存在一定差异;其他7个基因也分别来源于不同的AIV亚型.分离毒株A/chicken/Guangxi/BT1/2016 (H9N2)同时具备与α-2,3唾液酸和α-2,6唾液酸受体结合的特性,且具有感染人类的潜在风险;其感染鸡群后病毒分布主要集中在气管、肺脏和脾脏,可通过呼吸道和消化道同时排毒,且在攻毒后第1d即开始排毒,第5d为排毒高峰.[结论]从广西发病鸡群中分离获得的A/chicken/Guangxi/BT1/2016(H9N2)属于LPAIV,是由不同亚型AIV重组产生的H9N2亚型新毒株,可导致鸡群疫苗免疫失败,且具有感染人类的潜在风险. 相似文献
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为了解华东地区H9N2亚型禽流感病毒(AIV)的遗传特点和流行规律,利用RT-PCR方法扩增华东地区2008~2013年分离的17株H9N2亚型AIV血凝素(HA)基因片段,进行序列测定和遗传进化分析,并对HA蛋白质的裂解位点、受体结合位点和潜在的糖基化位点进行分析。结果显示,17株H9N2亚型AIV HA基因核苷酸和推导的氨基酸同源性分别为84.6%~99.3%和86.0%~99.5%,均属于欧亚分支。其中15株鸡源病毒属于Y280-like亚系,2株鸭源病毒属于G1-like亚系。HA裂解位点都是非连续碱性氨基酸,属于低致病力毒株。HA受体结合位点149、150、191、198和234位氨基酸存在变异,尤其是234位氨基酸有14株毒株变为L,表现出人流感病毒受体结合特性。有2株毒株在145位氨基酸出现新的糖基化位点,5个毒株在218位氨基酸缺失1个糖基化位点,13个毒株在313位氨基酸增加了一个新的糖基化位点。研究结果表明华东地区近年来H9N2亚型AIV存在一定的变异,应加强对该类病毒的分子流行病学监测。 相似文献
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禽流感病毒NP蛋白单克隆抗体的研制和鉴定 总被引：1，自引：0，他引：1
应用杂交瘤技术,以低致病性禽流感病毒H9N2亚型(Mildly Pathogenic Avian Influenza Virus,MPAIV)F株作为免疫原,制备出3株稳定分泌特异性单克隆抗体的细胞株C2C5、D3B10和C2H8。对单抗的特异性鉴定结果表明:腹水单抗C2C5、D3B10和C2H8的间接ELISA效价分别为5×214、210、5×212,但均无HI效价。3株单抗的免疫球蛋白亚类均为IgG2a。SDS-PAGE和Western-blot分析结果显示:单抗C2H8和D3B10与AIV H9N2和AIV H5N1均有60 kD的蛋白条带反应,而不与其他条带反应,表明这两株单抗特异性地针对AIV H9和AIV H5的共同抗原成分60 kD NP蛋白。而C2C5不与电泳蛋白条带反应,说明该单抗不是针对线性表位的,而可能是针对空间表位的。 相似文献
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抗A型禽流感病毒核蛋白特异性单克隆抗体研究 总被引：2，自引：4，他引：2
利用禽流感H9亚型病毒(AIV-H9)免疫Balb/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合,经免疫荧光试验(IFA)检测,以研制抗禽流感病毒(AIV)单克隆抗体。结果获得了5株特异性抗AIV核蛋白(NP)的单克隆抗体细胞株,分别命名为AIV-NP-2C3、AIV-NP-6A5、AIV-NP-3H9、AIV-NP-7B4、AIV-NP-2H4。这5株单克隆抗体能与所有试验的AIV-H9病毒反应,Western blotting方法鉴定结果表明,单克隆抗体仅识别60 ku的蛋白抗原,而不与新城疫病毒、禽网状内皮组织增殖症病毒、传染性法氏囊病毒等反应。初步应用结果显示,以这些单克隆抗体建立的间接免疫荧光试验或ELISA方法可迅速检测出禽流感病毒,这些单克隆抗体在禽流感的预防监测中将发挥重要的作用。 相似文献
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抗H5N1型禽流感病毒单克隆抗体的制备与鉴定 总被引：2，自引：2，他引：2
制备抗H5N1型禽流感病毒单克隆抗体并对其进行鉴定.采用纯化抗原免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合,筛选分泌抗AIV-H5N1的单克隆抗体细胞株,将阳性细胞株接种小鼠腹腔制备单克隆抗体腹水并对腹水抗体进行纯化,测定抗体亚类,并对其抗原结合位点进行分析.共获得了5株单克隆抗体杂交瘤细胞株,均为抗AIV-H5N1的特异性单克隆抗体,而且与H9N1型禽流感病毒,H13型禽流感病毒,鸡新城疫病毒,产蛋下降综合征病毒,鸡传染性支气管炎病毒均无交叉反应. 相似文献
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犬瘟热病毒F蛋白单克隆抗体的制备及鉴定 总被引：2，自引：0，他引：2
[目的]获得犬瘟热病毒F蛋白特异性单克隆抗体。[方法]用纯化的大肠杆菌BL21表达的犬瘟热病毒重组F蛋白作为抗原,免疫BALB/c小鼠,采用传统的杂交瘤技术制备单克隆抗体。用ELISAI、FA、Western-blot、细胞中和试验鉴定各株单抗的生物学特性。[结果]获得7株稳定分泌犬瘟热F蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株(2D6,3E10,3A2,5B7,5F6,6H8,9B6);单抗亚类鉴定结果分别为IgG2a,IgG1,IgG2b,IgG1,IgG1,IgG2a和IgG1;细胞中和试验初步证实2株单抗(5B7,9B6)具有中和犬瘟热病毒感染Vero细胞的作用,中和效价分别为1∶320和1∶640;经ELISA相加试验证实7株单抗的作用位点不同,其中2D6,5F6的作用位点非常相近。[结论]该研究成功制备了7株抗犬瘟热F蛋白特异性单抗,为进一步研究犬瘟热病毒F蛋白和临床诊断打下良好的基础。 相似文献
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采用高致病性禽流感病毒(HPAIV)H5N1亚型A/Duck/Zhenjiang/11/00(DZJ/1100)毒株作为免疫原,免疫8周龄BALB/C雌性小鼠,三次加强免疫后取脾细胞与SP2/0细胞融合,用表达的重组核蛋白(NP)包被ELISA的方法检测筛选,阳性细胞克隆经有限稀释法克隆培养,最后获得H5亚型特异性的单克隆抗体,抗体亚类检测结果表明该抗体亚类为IgG1型k链抗体。ELISA以及免疫荧光检测表明该抗体有良好的特异性。 相似文献
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LI Na QIN Ai-jian SHAO Hong-xia JIN Wen-jie LIU Yue-long College of Veterinary Medicine Yangzhou University Yangzhou 《（《农业科学与技术》）编辑部》2008,(1)
Five monoclonal antibodies(Mabs)to nuclear protein of avain influenza virus(AIV)were developed by syncretizing SP 2/0 and the spleen cells from BALB of mice immuized with H9 subtype AIV.Specificity of these Mabs were identified by immunofluorescent assay(IFA)and enzyme linked immunosorbent assay(ELISA).These five Mabs which were named as AIV-NP-2C3,AIV-NP-6A5,AIV-NP-3H9,AIV-NP-7B4,AIV-NP-2H4 could react with all viruses of AIV-H9 strains in tests.The result of Western blotting showed that only the 60 ku protein antigen of AIV-H9 could be recognized by the Mabs but never recognized by New castle disease virus,REV and infectious bursa disease virus.The result of preliminary application showed that avian influenza viruses could be dectected by Mabs in IFA and ELISA.All these Mabs will probably play important roles in preventing and monitoring avian influenza viruses. 相似文献
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H9亚型AIV型特异性电化学发光免疫检测方法的建立 总被引：2，自引：0，他引：2
【目的】H9亚型禽流感是重要的人兽共患性传染病,该亚型病毒为H7N9亚型和H10N8亚型流感病毒提供了6个内部基因（PB2、PB1、PA、NP、M、NS）,并且一直处于动态重组过程中。因此,建立针对H9亚型禽流感的型特异性电化学发光免疫的高通量快速检测方法,加强H9亚型流感的监测,具有重要意义。【方法】用钌联吡啶标记H9亚型AIV的单克隆抗体,用MPI-E型电致化学发光分析系统评价钌标单抗标记效率;用生物素标记H9亚型AIV的多克隆抗体,HABA法检测抗体生物素化的效率;待测抗原与钌标单抗作用1 h后,将此抗原-抗体复合物与通过生物素-链霉亲和素系统固定在磁微球表面的多克隆抗体反应,最后加入反应底物三丙胺后即可在电化学分析系统进行发光检测。优化生物素化多抗和钌标单抗最佳工作浓度,确定临界值和反应谱,对所建立的方法进行敏感性、特异性和重复性试验。攻毒后3 d和5 d,采集攻毒组和空白对照组鸡只的88份咽拭子和肛拭子,分别用电化学发光免疫检测方法和鸡胚病毒分离法进行检测和比较。【结果】钌标抗H9亚型AIV单克隆抗体的标记效率为每个单抗IgG分子上结合21个Ru2+,且间接免疫荧光方法证明其仍具有生物活性;生物素化兔抗H9N2亚型AIV多克隆抗体的标记效率为每个IgG分子上结合了6个生物素分子,且Western blotting试验证明其仍保持生物活性;该方法的检测临界值为28.3,可疑区间为23.4-33.2;阴性和阳性变异系数均小于10%;检测限为5×104EID50,能够特异性地检测H9亚型AIV,不与其他亚型流感病毒（H1、H3、H4、H5和H6亚型）和其他类型的禽源病毒（NDV、IBV和IBDV）反应。3 h内即可完成检测,与鸡胚病毒分离法的符合率为86.4%。【结论】所建立的H9亚型AIV型特异性电化学发光免疫检测方法可以用于临床样品检测,对H9亚型禽流感的监测和防控具有重要意义。 相似文献