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1.
本研究旨在对猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)N基因进行克隆构建、表达与其B细胞抗原表位性质的预测。将PEDV的N基因进行PCR扩增,克隆到原核表达载体pET-28a(+)中,经酶切验证获得阳性克隆,将阳性克隆在表达菌E. coli BL21(DE3)中表达。通过对表达条件及纯化条件的优化,获得高纯度表达蛋白。利用生物信息同源模型化软件Swiss-Pdb Viewer建立PEDV-N蛋白的3D结构,并根据生物信息学软件DNA-Star预测PEDV-N蛋白的二级结构、抗原性、亲水性和表面可及性分析,综合分析预测其B细胞抗原表位。经预测PEDV-N蛋白氨基酸序列中存在13个B细胞优势抗原表位区域。研究结果将进一步为PEDV-N蛋白体外表达产物的应用及研制基因工程疫苗提供理论基础。 相似文献
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【目的】研究猪流行性腹泻病毒(PEDV)M蛋白对Ⅰ型干扰素信号通路的影响。【方法】克隆PEDV M基因,构建其真核表达载体pcDNA3.1-Myc-PEDV-M,并转染HEK-293T细胞。采用Western bloting试验检测M蛋白的表达。通过双荧光素酶报告试验检测M蛋白对SeV诱导的干扰素通路活化的影响;通过Real-time PCR分析M蛋白对SeV诱导的IFN-β及干扰素刺激基因ISG54、ISG56、RIG-I mRNA表达的影响。通过过表达试验验证上调表达M蛋白对PEDV复制的影响。【结果】克隆了676 bp的PEDV M基因,成功构建其真核表达载体pcDNA3.1-Myc-PEDV-M,且其可在HEK-293T细胞中表达。PEDV M蛋白可抑制Ⅰ型干扰素信号通路的激活,且M蛋白对SeV诱导的Ⅰ型干扰素通路活化的抑制具有剂量依赖效应;M蛋白能够抑制IFN-β与干扰素诱导基因ISG52、ISG56、RIG-I mRNA的表达,并具有剂量依赖效应。过表达试验表明,M蛋白在抑制Ⅰ型干扰素信号通路激活的同时促进PEDV复制。【结论】PEDVM蛋白能够抑制Ⅰ型干扰素信号通路的激活,并促进PEDV复制。 相似文献
3.
[目的]筛选抗猪流行性腹泻病毒(PEDV)的有效中药单体及其作用节点。[方法]选择3种中药单体进行体外抗病毒试验，通过对病毒3个节点(抑制吸附穿入、直接杀灭、抑制复制)进行药物作用，评价CCK-8法、间接免疫荧光法和Western blot的对抗病毒效果。[结果]黄芩苷和水飞蓟在病毒吸附和穿入阶段抗病毒效果好，而诃子抗病毒效果较差；CCK-8测试显示，黄芩苷和水飞蓟最大抑制率分别为82.34%和78.00%,间接免疫荧光和Western blot进一步验证黄芩苷和水飞蓟能降低绿色荧光强度及抑制病毒N蛋白的表达，且2种药物抗病毒作用均呈现一定的浓度依赖性。[结论]该研究结果可为后续抗PEDV药物的筛选提供科学依据。 相似文献
4.
《浙江农业学报》2020,(5)
Ⅲ型干扰素(IFN-λ)具有较好的广谱抗病毒能力和免疫功能调节能力,一般在肠道等黏膜部位呈现高表达。猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)和猪德尔塔冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)是引起仔猪腹泻的重要肠道病原,严重困扰生猪产业健康发展。研究构建了携带猪PoIFN-λ3基因的重组表达质粒,转化大肠埃希菌Rosetta感受态细胞原核表达后,经SDS-PAGE和Western blotting检测分析,重组PoIFN-λ3蛋白成功表达,大小约为27 ku,且以包涵体形式存在。变性、纯化、复性后的PoIFN-λ3重组蛋白刺激IPEC-J2细胞,ISG-15、OAS1、Mx-1、IFIT1、IFIT3、IFITM1和IFITM3等干扰素刺激基因(ISGs)表达均显著上调,且在12 h达到峰值(P0.001)。IPEC-J2细胞分别感染PEDV和PDCoV病毒时,用PoIFN-λ3重组蛋白预处理、同时处理和感染后处理这3种方式处理后观察病毒增殖情况,与对照组相比,PEDV和PDCoV病毒拷贝数均显著下降(P0.05)。上述结果表明,变性、纯化、复性后的PoIFN-λ3重组原核表达蛋白具有较好的生物活性,不仅可以诱导IPEC-J2细胞免疫刺激基因表达上调,在体外也可以抑制PEDV和PDCoV在IPEC-J2细胞中的复制,为防治仔猪病毒性腹泻提供了基础。 相似文献
5.
【目的】猪流行性腹泻是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的一种对养猪业造成巨大损失的高致死率的传染性疫病。CRISPR/Cas13b系统精准切割和编辑RNA的功能提供了一种靶向抑制RNA病毒的策略。本研究尝试利用CRISPR/Cas13b的RNA干扰功能对PEDV的基因组RNA进行切割,以探索一种新型的PEDV病毒抑制策略。【方法】设计了4对靶向PEDV基因组不同区域的CRISPR RNA(crRNA)位点,构建了CRISPR/Cas13b打靶载体,以打靶载体转染Vero细胞,并利用PEDV感染转染细胞,检测PEDV在CRISPR/Cas13b转染细胞内的增殖情况。【结果】CRISPR/Cas13b系统对PEDV在Vero细胞的增殖具有明显的抑制作用。打靶载体U6-crRNA3和U6-crRNA4转染组相较于正常细胞组,病毒免疫荧光试验中荧光团明显减少;定量PCR结果显示,打靶载体转染组在细胞水平抑制50%以上病毒增殖量。【结论】本研究构建的CRISPR/Cas13b系统能有效抑制PEDV增殖,为开发有效的RNA病毒防控手段、建立抗病动物模型提供了新的研究策略。 相似文献
6.
根据已经发表的猪流行性腹泻病毒N基因序列(GenBank:KX016034.1),设计1对特异性引物(上、下游分别插入Bam HⅠ和XhoⅠ酶切位点),通过RT-PCR技术扩增N基因,在测序鉴定正确后经Bam HⅠ和XhoⅠ双酶切,将其克隆至原核表达载体pET-32a上,获得重组表达质粒pET32a-N。表达的蛋白质经纯化后进行Western blotting鉴定分析。以表达的PEDV-N蛋白作为抗原,免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,经间接ELISA筛选及亚克隆,获2株PEDV-N特异性单克隆抗体。对获得的单抗进行Western blotting鉴定和间接免疫荧光试验(IFA)分析,结果显示2株单抗均能与PEDV-N蛋白特异性结合和识别。以上结果表明PEDV-N蛋白在大肠杆菌中成功表达,且成功制备了2株具有生物学活性的特异单抗,为建立PEDV金标试纸诊断方法奠定了基础。 相似文献
7.
为了探讨中药复方苦芩总生物碱(Total Alkaloids in Kuqin Compound,TAKC)保护F81细胞免受犬细小病毒(Canine Parvovirus,CPV)损伤的作用机理,用CPV感染F81细胞,选择不同浓度的TAKC进行体外抗CPV感染F81细胞试验,采用琥珀酸脱氢酶活力测定法检测TAKC对F81细胞的保护率,用RT-PCR法检测TAKC处理对感染CPV的F81细胞中caspase-3基因mRNA表达水平的影响.结果显示,TAKC对F81细胞有保护作用,其在整个病毒复制过程中(直接灭活作用、阻滞作用、吸附抑制作用、穿入抑制作用和复制抑制作用)均有明显的影响,其中阻滞作用、穿入抑制作用和复制抑制作用效果最明显,对细胞的保护率分别能达到31.19%,20.54%,32.28%.同时使感染CPV的F81细胞的caspase-3基因表达水平显著降低(p0.01),表达水平与模型组的比值为1∶1.818.因此,推测TAKC可通过阻滞抑制、穿入抑制和DNA复制抑制CPV感染F81细胞和降低F81细胞中caspase-3基因表达水平,起到保护F81细胞免受CPV损伤的作用. 相似文献
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Ⅲ型干扰素(IFN-λ)具有较好的广谱抗病毒能力和免疫功能调节能力,一般在肠道等黏膜部位呈现高表达。猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)和猪德尔塔冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)是引起仔猪腹泻的重要肠道病原,严重困扰生猪产业健康发展。研究构建了携带猪PoIFN-λ3基因的重组表达质粒,转化大肠埃希菌Rosetta感受态细胞原核表达后,经SDS-PAGE和Western blotting检测分析,重组PoIFN-λ3蛋白成功表达,大小约为27 ku,且以包涵体形式存在。变性、纯化、复性后的PoIFN-λ3重组蛋白刺激IPEC-J2细胞,ISG-15、OAS1、Mx-1、IFIT1、IFIT3、IFITM1和IFITM3等干扰素刺激基因(ISGs)表达均显著上调,且在12 h达到峰值(P<0.001)。IPEC-J2细胞分别感染PEDV和PDCoV病毒时,用PoIFN-λ3重组蛋白预处理、同时处理和感染后处理这3种方式处理后观察病毒增殖情况,与对照组相比,PEDV和PDCoV病毒拷贝数均显著下降(P<0.05)。上述结果表明,变性、纯化、复性后的PoIFN-λ3重组原核表达蛋白具有较好的生物活性,不仅可以诱导IPEC-J2细胞免疫刺激基因表达上调,在体外也可以抑制PEDV和PDCoV在IPEC-J2细胞中的复制,为防治仔猪病毒性腹泻提供了基础。 相似文献
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病毒依赖宿主细胞代谢以获取复制所需的能量和生物合成分子。为探索葡萄糖和谷氨酰胺在猪瘟病毒增殖中的作用,将剥夺了葡萄糖和谷氨酰胺或加有不同浓度葡萄糖和葡萄糖类似物2-脱氧葡萄糖(2-Deoxy-D-glucose,2-DG)的培养基用于猪瘟病毒感染细胞的培养,感染后24 h收集样品,进行病毒滴度和基因组拷贝数测定,以及病毒蛋白表达的鉴定。结果表明:与正常对照相比,谷氨酰胺剥夺对病毒滴度没有显著影响,而葡萄糖剥夺时病毒滴度和基因组拷贝数分别降低30倍和20倍,同时病毒滴度与葡萄糖的浓度呈正相关。表明葡萄糖是猪瘟病毒增殖的必需营养物质。2-DG处理也能显著抑制猪瘟病毒的增殖。综上,葡萄糖对猪瘟病毒增殖至关重要,缺少葡萄糖则猪瘟病毒无法正常复制,而谷氨酰胺对猪瘟病毒增殖并无影响。 相似文献
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硒蛋氨酸对猪细小病毒体外增殖的抑制作用 总被引：2，自引：1，他引：1
以PK15细胞为模型,研究不同浓度的硒蛋氨酸对猪细小病毒(PPV)体外复制的抑制作用。结果表明,在2～8μmol·L-1范围内,硒蛋氨酸对细胞生长没有影响,但对猪PPV的体外复制呈现显著的抑制作用(P<0.05),且随着浓度的增加其抑制作用增强。还原型谷胱甘肽和甘露醇均有增强硒蛋氨酸的抑制病毒复制作用,两者同时添加时,其作用更明显。 相似文献
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根据斑马鱼GDF9、BMP15基因的保守序列设计引物,采用RT PCR方法扩增获得日本白鲫GDF9、BMP15基因片段。日本白鲫GDF9基因片段长778 bp,编码145个氨基酸;BMP15基因片段长811 bp,编码270个氨基酸。氨基酸序列分析表明日本白鲫GDF9与斑马鱼的同源性最高,为78%,与其他物种的同源性在58%~78%之间;日本白鲫BMP15与斑马鱼同源性最高,为80%,与其他物种的同源性在30%~80%之间。系统进化树分析显示,鱼类的GDF9基因独立聚成一支,其中日本白鲫的GDF9基因与斑马鱼的GDF9基因聚成一支;鱼类的BMP15基因独立聚成一支,其中日本白鲫的BMP15基因与斑马鱼的BMP15基因聚成一支。半定量PCR结果显示,BMP15 mRNA在脾脏、肝脏、鳃、脑、心脏、肌肉、肾脏、卵巢中均有表达,其中卵巢中表达量最高;GDF9 mRNA在肝脏、脑、心脏、肌肉、卵巢中均有表达,而在脾脏、鳃、肾脏中表达量极低或不表达,在卵巢中表达量最高,为进一步研究日本白鲫GDF9与BMP15基因的结构与功能奠定了基础。 相似文献
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赤眼蜂的生物学特性受到繁育寄主的影响。为探究不同繁育寄主对赤眼蜂品系在梨小食心虫卵的趋性中是否存在差异,本试验通过Y-管行为选择试验研究了米蛾Corcyra cephalonica卵繁育的松毛虫赤眼蜂Trichogramma dendrolimi和玉米螟赤眼蜂Trichogramma ostriniae品系,以及梨小食心虫Grapholita molesta卵繁育的松毛虫赤眼蜂、玉米螟赤眼蜂和本地优势种暗黑赤眼蜂Trichogramma pintoi品系对梨小食心虫卵的选择趋性。松毛虫赤眼蜂米蛾卵品系对米蛾卵和梨小卵均未表现出显著趋性,松毛虫赤眼蜂梨小卵品系在仅有米蛾卵时对米蛾卵表现出了显著趋性,而在仅有梨小卵、以及梨小卵和米蛾卵共存的处理中未表现出对任一寄主卵的趋性;玉米螟赤眼蜂米蛾卵品系和梨小卵品系,以及暗黑赤眼蜂梨小卵品系对米蛾卵和梨小卵均未表现出显著趋性。仅有米蛾卵时,暗黑赤眼蜂梨小卵品系选择时间显著短于除玉米螟赤眼蜂梨小卵品系外的其余三种赤眼蜂品系;而在仅有梨小卵时,暗黑赤眼蜂梨小卵品系选择时间最长,松毛虫赤眼蜂米蛾卵品系选择时间最短;而两种繁育寄主同时存在时,玉米螟赤眼蜂米... 相似文献
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采用同源克隆方法,并结合RACE技术,从甜荞花芽分离得到1个A类MADS-box基因FeMADS1的cDNA全长,GenBank登录号为KM386627,其cDNA全长1 107bp,包括1个编码234个氨基酸、长为705bp的开放阅读框。序列同源比对和分子系统发生分析表明,其蛋白与拟南芥AGL8(FUL)的相似性最高,属A类MADS-box基因亚家族中的euFUL进化系,含MADS、I、K和C末端4个明显的结构域,并且K结构域包含K1、K2和K3共3个保守的富含疏水氨基酸残基的亚结构域,C末端结构域含FUL型基因2个特有的模体:FUL motif和paleoAP1motfi。 相似文献
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干酪乳杆菌对雏鸡十二指肠发育的组织学影响 总被引：1，自引：1，他引：0
为探究干酪乳杆菌对雏鸡十二指肠黏膜组织结构和功能及发育的影响,采用组织化学和免疫组织化学方法,以450只1日龄SPF健康雏鸡为试验对象,随机分成6个组,每组5个重复,每个重复15只雏鸡。结果表明:1)干酪乳杆菌预防组、治疗组及预防治疗组的肠绒毛高度分别比沙门氏菌攻毒组显著增高了19.04%、10.68%和12.21%;2)与鸡白痢沙门氏菌攻毒组相比,干酪乳杆菌预防组的绒毛高度与隐窝深度的比值(V/C)显著升高23.94%;3)干酪乳杆菌预防组、治疗组的增殖细胞核抗原(PCNA)含量显著高于沙门氏菌攻毒组;4)干酪乳杆菌预防组、治疗组、预防治疗组杯状细胞数量分别比沙门氏菌攻毒组显著升高72.26%、67.74%、65.32%。综上,饲喂干酪乳杆菌进行预防能够显著提高雏鸡十二指肠绒毛高度、V/C值、PCNA含量及杯状细胞数量,提示干酪乳杆菌能有效维护雏鸡肠道健康,减轻鸡白痢沙门氏菌对肠道黏膜组织结构的损害,促进肠道发育。 相似文献
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低分子量谷蛋白亚基(LMW-GS)与小麦品质密切相关。为给宁夏小麦的品质改良提供参考,应用STS分子标记,对宁夏98份小麦品种Glu-A3和Glu-B3位点的等位基因变异类型组成进行检测和分析。结果表明,宁夏98份小麦品种Glu-A3位点存在Glu-A3a(4.0%)、Glu-A3b(2.0%)、Glu-A3c(55.1%)、GluA3d(10.1%)和Glu-A3e(28.5%)5种等位变异;Glu-B3位点存在Glu-B3a(2.0%)、Glu-B3b(8.1%)、Glu-B3c(5.0%)、Glu-B3d(7.1%)、Glu-B3f(21.4%)、Glu-B3g(2.0%)、Glu-B3h(15.3%)和Glu-B3i(13.3%)8种等位变异。宁夏参试品种共存在23种等位变异组合形式,其中引黄灌区存在18种组合类型,Glu-A3c/Glu-B3j(17.7%)和Glu-A3e/Glu-B3f(16.2%)组合类型较为普遍;宁南山区存在13种组合类型,以Glu-A3c/Glu-B3i(20.0%)组合类型为主。在参试的宁夏小麦品种中,对同一地区不同来源品种而言,改良品种的LMW-GS遗传多样性明显较引进品种和地方品种更丰富。 相似文献
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木质素是植物抵御外界环境的重要成分,肉桂醇脱氢酶（cinnamic alcohol dehydrogenase,CAD）是木质素合成途径中的关键酶和限速酶之一。前期数据表明,在灰霉菌侵染下,PpCAD4基因上调表达,但PpCAD4功能尚未明确。本次研究利用同源重组原理构建PpCAD4.1-PTN182-PpCAD4.2敲除载体,从而破坏PpCAD4的alcohol dehydrogenase GroES-like domain（ADH_N）和zinc-binding dehydrogenase（ADH_zinc_N）结构域。利用PGE 6000介导小立碗藓原生质体转化,筛选并鉴定得到敲除PpCAD4突变体植株。qRT-PCR表明,敲除型植株中PpCAD4的表达量相对野生型减少了84%。通过对配子体的形态观察发现,PpCAD4突变株通过增加配子体中拟叶的数量,使得植株生物量增加,这表明CAD4在早期陆生植物的生长发育中起着重要作用。用灰霉菌侵染小立碗藓发现,0.5 d后野生型配子体菌丝入侵率为15%, cad4-ko菌丝入侵率为40%。侵染1 d后,Ppcad4-ko配子体菌丝侵入率是野生型的2倍。表明PpCAD4能够增加小立碗藓对真菌病原菌的抗性。 相似文献
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为观察拟南芥突变体sad2(sensitive to ABA and drought)的微管列阵,以拟南芥突变体sad2-1和sad2-2为母本,转GFP(green fluorescence protein)-α-tubulin野生型拟南芥为父本杂交,并对F2代幼苗进行叶表型分析、卡那霉素抗性筛选和荧光镜检。表型分析显示,拟南芥sad2-2突变体与转GFP-α-tubulin的杂交F2代幼苗叶片出现有毛和无毛2种性状,二者分离比为2.81∶1。卡那霉素抗性筛选显示,部分F2代幼苗在卡那霉素培养基上出现白化死亡,大部分可正常生长。荧光镜检显示,卡那霉素阳性苗的子叶出现GFP绿色荧光。此外,共聚焦显微镜观察显示,拟南芥突变体子叶细胞微管列阵清晰可见,且sad2-1和sad2-2两种突变体的微管比野生型更加致密,但sad2-1和sad2-2两突变体间无明显差异。说明:采用杂交法将GFP-α-tubulin引入突变体来分析微管是一种简便可靠的方法,且sad2基因影响细胞微管列阵,可用于sad2基因与微管功能的进一步研究。 相似文献
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为探究HvnANT1基因在青稞粒色形成过程中的基因表达模式,以紫粒青稞‘涅如姆扎’和白粒青稞‘昆仑10号’为试材,利用简化基因组GBS(Genotyping-by-Sequencing)对青稞紫粒进行基因定位,克隆到HvnANT1基因,对其进行生物信息学分析。结果表明:1)在7H染色体的84.30—86.00 cM获得1个MYB类转录因子,命名为HvnANT1。2)该基因长1 033 bp,其完整开放阅读框为762 bp,编码253个氨基酸。HvnANT1蛋白分子量为27.14 kU,是亲水性的不稳定碱性蛋白且不存在跨膜结构,无信号肽。该蛋白的二级结构主要是由无规卷曲、α-螺旋、延伸链和β-转角组成,具有2个SANT结构域(分别位于第13—第63个;第66—第114个氨基酸)。3)同源比对与系统进化分析表明:青稞HvnANT1蛋白与大麦、乌拉尔图小麦、高梁、玉米、二型花、小米、水稻、土瓶草、车轴草和杨梅10种植物的ANT1蛋白序列相似性分别为100.00%、88.85%、54.64%、60.95%、60.82%、58.46%、57.61%、37.76%、36.05%和36.33%;这些序列都具有2个高度保守的2个SANT结构域;与大麦的亲缘关系最近,其次是与乌拉尔图小麦,与水稻最远。4)亚细胞定位结果表明,该基因定位在细胞核内。5)实时荧光定量PCR(qRT-PCR)结果显示:与籽粒颜色形成的乳熟早期和乳熟晚期相比,软面团期的HvnANT1基因在‘涅如姆扎’中表达量极显著上调,而在‘昆仑10号’中各时期的表达量较低且差异不显著;且软面团期的‘涅如姆扎’籽粒HvnANT1基因的表达量极显著高于‘昆仑10号’(P<0.01)。花青素合成相关的结构基因HvnCHI、HvnANS和HvnDFR与该基因表达量模式相似。综上,青稞HvnANT1蛋白结构中的SANT结构域在物种进化过程中比较保守;该基因定位在细胞核内,符合转录因子特性;HvnANT1基因表达模式与结构基因HvnCHI、HvnANS和HvnDFR相似,在籽粒颜色形成的软面团期表达量极显著升高。 相似文献
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必需脂肪酸亚油酸(18∶2)和亚麻酸(18∶3)在植物中的合成过程一直备受研究者的关注。本研究利用旱金莲中合成亚油酸的油酸脱饱和酶基因TmFAD2及甘蓝型油菜中合成亚麻酸的亚油酸脱饱和酶基因BnFAD3,在pRD400骨架载体的基础上,构建同时表达TmFAD2和BnFAD3的串联双价载体pSFF。通过农杆菌介导的花序浸蘸法完成pSFF对拟南芥哥伦比亚野生型的转化,观察发现转基因植株的第1对真叶有不同程度的畸形。按照畸形程度将其划分为4个等级,气相色谱分析4个等级叶片及其后代种子中脂肪酸的组成及含量,发现随着畸形程度的增高,叶片和种子中亚麻酸C18∶3含量都呈现降低的趋势。 相似文献
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LBD(Lateral organ boundaries domain)是植物中特有的基因家族.前期研究发现灰霉菌处理小立碗藓导致配子体中的PpLBD20上调表达,但PpLBD20的功能尚不明确.因此提取小立碗藓DNA,PCR扩增PpLBD20基因的上下游片段,依次插入PTN182载体,利用同源重组原理构建敲除表达载体,酶切和测序验证插入序列的正确性.通过工作浓度为20％的PGE 6000介导小立碗藓原生质体转化,筛选鉴定得到敲除PpLBD20后的突变体植株,观察到敲除后小立碗藓不形成茎叶体结构且配子体成丝状.结果为深入探究PpLBD20在小立碗藓的形态建成调控病原菌侵染的抗性作用奠定基础. 相似文献