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1.
《畜牧兽医学报》2017,(9)
笔者拟研究环丙沙星诱导对大肠埃希菌临床耐药菌株Y35、J45主动外排基因acrA、acrB、acrD、acrE、acrF、mdtA及外排调控基因marA、robA和soxS mRNA水平的影响。采用微量肉汤稀释法,测定环丙沙星对Y35、J45不同诱导阶段MIC;采用荧光定量PCR检测方法,对Y35、J45及二者诱导至10、20、30代菌株的主动外排及外排调控基因mRNA相对转录量进行测定。结果显示:经过30代诱导,环丙沙星对诱导株MIC均增至原来的2倍,达到256μg·mL~(-1)。Y35耐药株诱导至10和30代时,除了mdtA基因外,其他8个基因转录量介于1.20~96.07,与未诱导株相比差异显著(P0.05或P0.01),acrD基因转录量增加最为明显;至20代时,acrA、acrB、marA与10代诱导株相比,转录量下降,但高于原代菌株转录量;acrE、robA和soxS基因转录量数值介于1.40~3.81,与未诱导株相比差异显著(P0.05或P0.01)。J45耐药株至10代时,acrB、acrF基因转录量增加,转录量分别为原代菌株2.76和1.73倍,其他测定基因转录量下降;至20代时,acrA、acrB、acrE、mdtA基因转录量增加显著,分别为原代菌株的15.35、58.89、31.56、36.50倍,差异极显著(P0.01);至30代时,所有检测基因的转录量均大于原代菌株,acrF基因转录量增加最为明显,是原代菌株的102.54倍。本研究表明,长期使用环丙沙星诱导,能够使临床耐药株对其MIC值增加,耐药性增强;环丙沙星诱导能促使临床耐药菌株主动外排基因mRNA转录量增加,更强的耐药性可能是由主动外排泵介导产生。 相似文献
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《中国兽医学报》2020,(3)
以前期获得的25株猪源耐药大肠杆菌为试验菌株,采用药敏纸片法测定以上分离菌株对氟苯尼考、多西环素、庆大霉素等11种药物的敏感性,并分析其多重耐药表型;采用PCR方法和实时荧光定量PCR方法分别检测25株猪源大肠杆菌中AcrAB-TolC主动外排基因的携带率以及不同耐药数量的多重耐药菌株的外排泵基因arA和acrB的表达量,同时分析其主动外排调控基因marA、soxS、robA和acrR相对表达量的差异,从mRNA水平上探讨外排泵基因表达量和调控因子与大肠杆菌多重耐药性的相关性。结果显示,25株耐药大肠杆菌中acrA、acrB和tolC等3种主动外排基因的携带率分别为68.00%、72.00%和76.00%;acrA、acrB这2种主动外排基因以及调控基因marA和soxS的相对表达量和多重耐药的耐药谱数呈正相关,调控基因acrR的相对表达量和多重耐药的耐药谱数呈负相关;robA调控基因的表达量均低于标准菌株,且与耐药谱数无明显相关性。结果表明,猪源耐药大肠杆菌携带acrA、acrB、tolC等3种基因主动外排基因的携带率较高,且与多重耐药菌株的耐药谱具有相关性;调控因子的表达量亦与多重耐药的耐药谱具有相关性。 相似文献
3.
《中国兽医学报》2017,(12):2370-2377
利用Red同源重组技术构建大肠杆菌K12调控基因缺失菌株,探讨耐药发展过程中marRAB和soxRS对大肠杆菌K12外排泵AcrAB-TolC表达的调控作用。在环丙沙星浓度递增的条件下诱导K12及调控基因缺失菌株,分别获得系列突变菌株,测定各菌株对其他药物的MIC,并检测靶位基因突变情况。利用RT-PCR方法检测诱导突变株中外排泵基因、调控基因、膜孔蛋白基因的表达水平。结果表明,K12正向调控基因(marA和soxS)缺失株在环丙沙星选择压力下仅获得环丙沙星敏感性降低的菌株,而负向调控基因(marR和soxR)在环丙沙星选择压力下可获得环丙沙星中介和耐药的菌株,且诱导突变株仅出现与耐药有关的gyrA单突变(Ser83Leu和Asp87His)。正向调控基因marA和soxS缺失后,外排泵基因表达水平变化不明显,而负向调控基因marR和soxR缺失后,marA和soxS的表达水平显著升高,引起外排泵基因表达水平显著升高,最高达到约13倍。当阻遏蛋白SoxR被敲除后,soxS的表达水平没有变化,而marA的表达水平显著升高,外排泵基因acrB表达水平也升高,说明在调控AcrAB-TolC外排泵基因表达方面,marRA与soxRS存在功能上的冗余,即当其中一个调控因子功能缺陷时,另一个调控因子可以发挥互补调控功能。因此,MarA和SoxS对三聚体系统AcrAB-TolC的正向调控作用是通过解除负向调控蛋白MarR和SoxR对其的阻遏作用实现的,MarRA和SoxRS共同调节外排泵AcrAB-TolC的表达水平。 相似文献
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《中国兽医学报》2016,(6):990-994
为探究黄芩苷对耐药大肠杆菌主动外排调控基因marA的mRNA表达水平的影响,利用微量肉汤稀释法确定黄芩苷增敏环丙沙星的最佳浓度,然后对8株耐药菌株采取不加任何药物、单独加32mg/L黄芩苷或4 mg/L环丙沙星、32mg/L黄芩苷和4mg/L环丙沙星联合及16mg/L CCCP和4mg/L环丙沙星联合等5种方式培养,抽提总RNA并反转录成cDNA,荧光定量PCR测定主动外排调控基因marA及管家基因gapA的Ct值,并计算不同培养条件下各个耐药大肠杆菌marA基因mRNA相对表达量。结果显示,标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,相关系数R~2=1.00,溶解曲线特异,marA基因产物Tm值为81.8~82.1℃;黄芩苷与环丙沙星联合培养的耐药菌外排泵基因marA表达量与环丙沙星单独培养相比明显下降,前者0.71~2.06,后者2.27~7.28;以上结果表明黄芩苷可以通过抑制外排泵调控基因marA发挥作用,提示其也许可作为大肠杆菌的外排泵抑制剂应用于临床。 相似文献
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选择11株动物源沙门菌(包括6种血清型)进行环丙沙星耐药性体外诱导.应用变性高效液相色谱(DH-PLC)对11株诱导株不同诱导阶段的靶基因gyrA、gyrB、parC、parE的喹诺酮耐药决定区(QRDR)和mar操纵子基因marO、marR、marA、marB、soxR、soxS及外排泵acrAB的抑制基因acrR(包括启动子区)进行基因突变筛选,并对筛选出的突变基因进行测序确证.结果显示,6种血清型沙门菌在诱导过程中,GyrA突变集中在S83F和/或D87G,marR、soxR、acrR均出现新突变,提示在环丙沙星诱导压力下,因靶基因和调控基因突变使耐药性不断增加. 相似文献
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《中国预防兽医学报》2015,(10)
为研究鼠伤寒沙门菌双组分信号系统的应答调节蛋白基因cpxR对菌株药物敏感性的影响,本研究以p KD4质粒为模板,利用PCR扩增两侧与cpxR基因上下游同源且含有卡那霉素抗性(kanr)基因的线性打靶DNA片段,在p KD46质粒的辅助下进行Red同源重组,利用线性打靶DNA片段替换鼠伤寒沙门菌CVCC541(JS)株的cpxR基因,再利用p CP20质粒消除FRT位点间的kanr基因,构建基因缺失株JS△cpxR。并将重组表达质粒p BAD-cpxR转化于JS△cpxR中,制备回补菌株JS△cpxR/pcpxR。利用微量稀释法测定12种代表性抗菌药物对亲本株JS、JS△cpxR和回补菌株JS△cpxR/pcpxR的最小抑菌浓度(MIC)。结果显示,庆大霉素(GEN)、阿米卡星(AMK)、头孢噻呋(CEF)和头孢曲松(CRO)对亲本株JS的MIC值分别为JS△cpxR的4、4、4和2倍;而随诱导剂L-阿拉伯糖浓度的增高,这4种药物对回补菌株JS△cpxR/pcpxR的MIC值均逐渐恢复到亲本株JS的水平,呈剂量依赖性关系,而且高浓度诱导时4种药物对回补菌株的MIC分别为JS△cpxR的16、8、8和16倍,其他药物的MIC值未出现明显的变化。本研究结果表明:cpxR能够调控鼠伤寒沙门菌对GEN、AMK、CEF和CRO的敏感性。 相似文献
9.
为检测不同耐药水平大肠杆菌的acrA和marA基因转录水平，阐明t耐药大肠杆菌株药物敏感性变化与acrA和marA的mRNA水平之间的关系。用定量RT—PCR的方法比较多重耐药菌株SEMR、单药耐药菌株SEICI和SEICH以及质控株ATCC25922的acrA和marA的mRNA水平。结果表明，acrAmRNA水平，SEMR均是SEICI、SEICH和ATcC25922的16倍；marA mRNA水平，SEMR是SEICH的4倍、SEICl和ATCC25922的8倍；SEICI和SEICH的acrA mRNA和marA mRNA水平与ATCC25922无明显差异；同一菌株acrA mRNA和marA mRNA水平的变化保持了较为稳定的一致性。因此认为，大肠杆菌多重耐药菌株SEMR的acrA mRNA和marA mRNA水平与其耐药水平存在相关性。 相似文献
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《中国兽医学报》2017,(2):303-307
为探讨反义寡核苷酸(ASODN)沉默acrA、marA和acrD基因前后,黄芩苷对临床耐药大肠埃希菌(E.coli)环丙沙星敏感性的影响,设计并合成3个基因的ASODN引物,设置空白对照组、黄芩苷组、ASODN沉默组、ASODN沉默+黄芩苷组,分别转染到临床耐药菌感受态细胞中,涂布于一定浓度环丙沙星平板上,培养观察菌落生长情况并计数。结果发现,相对于空白对照组,黄芩苷组菌落数显著降低;acrA、acrD和marA基因沉默组与空白对照组相比,除了acrD基因沉默1号菌株和marA基因沉默的Y17菌株外,其余菌株在环丙沙星平板上的菌落数也出现不同程度地下降,具有显著性差异;acrA、acrD和marA基因沉默+黄芩苷组与黄芩苷组相比,多数菌株在环丙沙星平板上的菌落数均出现不同程度地下降;acrA基因沉默+黄芩苷组与acrA基因沉默组相比,4株菌株变化差异不显著,Y17号菌株菌落数有所上升,J45号菌株在该基因沉默后,环丙沙星平板上的菌落数出现下降的趋势,差异显著;acrD基因沉默+黄芩苷组与acrD基因沉默组相比,除了1号菌株变化差异不显著外,其余5株菌株变化差异显著,但Y17号菌株菌落数上升;marA基因沉默+黄芩苷组与marA基因沉默组相比,除了Y17、Y35这2株菌株变化差异显著外,其余4株菌株变化差异不显著。以上结果表明,黄芩苷主要通过抑制acrA和marA发挥外排抑制作用,acrD不是其增强环丙沙星敏感性的主要靶点。 相似文献
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marA has been shown to mediate a multiple antimicrobial resistance (MAR) phenotype following induction in some members of the Enterobacteriaceae. When Salmonella Choleraesuis was exposed to inducing agents they displayed higher minimal inhibitory concentrations (MIC) to multiple antimicrobial agents and an increase in marA expression as determined by northern hybridization analysis. The objective of the present study was to determine if mutation of marA vitiated multiple antimicrobial resistance inducibility in S. Choleraesuis. A loss-of-function mutation of marA in a single S. Choleraesuis isolate was created by insertion of the dihydrofolate reductase (DHFR) gene cassette within marA using double homologous recombination. This mutation was complemented with an expression plasmid possessing marA under the control of an IPTG-inducible promoter. Mutation and complementation of marA was verified using polymerase chain reaction, Northern hybridization, and Western blotting assays. Minimum inhibitory concentrations (MICs) of tetracycline, chloramphenicol, nalidixic acid, and rifampin were determined against induced and uninduced wildtype, marA-disrupted and marA-complemented strains using a microbroth dilution assay. Minimum inhibitory concentrations against induced wildtype and marA-complemented strains increased four- to eight-fold for all antimicrobials tested when compared to the uninduced strains while the MICs of the induced marA-disrupted mutant remained the same. However, this increase was abrogated when the cells were grown in the presence of the efflux pump inhibitor compound EPI phe-arg-naphthylamide. The results indicate that a functional marA is solely required for an inducible multiple antimicrobial resistance phenotype in S. Choleraesuis. 相似文献
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主动外排系统介导的大肠杆菌多重耐药性的确证 总被引：9，自引：1，他引：8
为检测和证实主动外排系统(外输泵)在细菌多重耐药机制中的作用，用四环素和水扬酸钠对大肠杆菌质控株进行了体外人工诱导，筛选出多重耐药株，再用能量抑制剂CCCP(Carbongl cyanide m-chloropheyhydrazone)时耐药株和质控株进行了环丙沙星摄取抑制试验。结果：在耐药株，其菌体内环丙沙星稳态浓度明显低于质控株；多重耐药株在有CCCP存在时，菌体内环丙沙星的浓度随时间的延长而递增，而无CCCP的抑制时，菌体内环丙沙星的浓度递增缓慢；在质控株，不论有无CCCP存在，菌体内环丙沙星的浓度都随时间的延长而呈递增趋势，且保持较耐药株明显高的水平。结论：体外诱导多重耐药大肠杆菌多重耐药性的产生，可能主要依赖于菌体外输泵的激活。 相似文献
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大肠杆菌耐药株的体外诱导及其acrA和marA基因分析 总被引：8，自引：1，他引：7
为检测大肠杆菌在某抗菌素的环境压力下耐药性的变化及其与acrA和marA基因突变的关系.分别用四环素、氯霉素和环丙沙星对大肠杆菌质控株ATCC25922进行体外诱导培养,测定诱导前后多种抗菌药的MIC的变化;对各菌株的acrA和marA基因进行克隆和测定.四环素诱导株产生重耐药,氯霉素和环丙沙星的诱导引起单药耐药;四环素诱导株、氯霉素诱导株和环丙沙星诱导株的acrA和marA基因序列均与ATCC25922的一致.四环素、氯霉素和环丙沙星的诱导培养并未引起ATCC25922的acrA和marA基因突变,诱导引起的大肠杆菌耐药性变化是由于其acrA和marA基因突变以外的其他原因所致. 相似文献
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福氏志贺菌外输调节蛋白基因marA的原核表达载体构建及其鉴定 总被引：1，自引：0，他引：1
目的构建志贺菌外输调节蛋白基因marA的原核表达载体并对其表达的蛋白进行鉴定。方法采用PCR从志贺菌基因组DNA中扩增得到志贺菌外输调节蛋白基因marA,并将其定向克隆到原核表达载体pET-30a,构建原核表达重组质粒pET-30a-marA,重组子经限制性内切酶分析、PCR及测序鉴定后,转化宿主菌BL21,IPTG诱导表达,产物进行SDS-PAGE电泳、免疫印迹分析鉴定。结果经鉴定证实原核表达载体pET-30a-marA构建成功,且在大肠杆菌BL21中获得了MarA与His的融合表达,且表达蛋白产物的分子质量大小与预期值一致,并可被特异性抗体所识别。结论MarA在大肠杆菌中获得了高效的表达,为进一步研究其免疫学特性和功能奠定了基础。 相似文献
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M.A. Ospina Barrero P.A.G. Pietralonga D.G.G. Schwarz A. Silva Junior S.O. Paula M.A.S. Moreira 《Research in veterinary science》2014
The multidrug efflux system in bacteria can reduce antibiotic concentration inside the cell, leading to failure in the treatment of bacterial diseases. This study evaluated the influence of two efflux pump inhibitors (EPIs), phenylalanine arginyl ß-naphthylamide (PAßN) and 1-(1-naphthylmethyl)-piperazine (NMP), on the gene expression of three multidrug efflux systems, AcrAB, AcrEF and EmrAB in Escherichia coli bovine mastitis isolates resistant to ampicillin and sulfamethoxazole/trimethoprim simultaneously. Each isolate had at least three multidrug efflux system genes. The acrA and acrB had the lowest expression levels in all treatments, while the emrA or emrB showed the highest expression levels in the presence of ampicillin, sulfamethoxazole/trimethoprim, PAβN and NMP. EPIs also contributed to the decrease in arcF expression when used in combination with ampicillin treatment. Since PAßN showed stronger effects than NMP, it may serve as an alternative to assist in the antimicrobial therapy of mastitis. 相似文献
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