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为了大规模生产猪传染性胃肠炎病毒抗原,试验采用生物反应器及微载体进行ST细胞的培养,待微载体上的ST细胞长满至单层后接种猪传染性胃肠炎病毒(TGEV).共使用生物反应器培养3批TGEV抗原,每批培养过程中分别调节初始细胞密度至2.14×106个/mL、1.83×106个/mL和2.02×106个/mL,微载体浓度为3g/L、6 g/L和9 g/L.结果表明应用生物反应器及微载体培养得到抗原的病毒含量均达到108.0 TCID50/mL,明显高于转瓶培养的病毒含量. 相似文献
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《畜牧与兽医》2015,(8):89-92
为了探索猪流行性腹泻病毒(PEDV)在微载体培养Vero细胞上的增殖效果,采用2 L生物反应器进行微载体培养Vero细胞和PEDV繁殖,并摸索细胞生长和病毒繁殖的最佳条件,检测病毒滴度,与方瓶培养的病毒滴度进行比较。结果显示:当微载体为5 g,种子细胞数约3.05×107个,采用灌注式培养,Vero细胞经72 h长满单层,细胞数约为3.02×109个,此时用滴度为104.45TCID50/m L的PEDV 1 m L感染Vero细胞,培养96 h,微载体上80%细胞脱落时收毒,培养的PEDV具有较高的病毒滴度。相同病毒在微载体系统与方瓶上进行同步传代,经检测病毒滴度均有提高,但在微载体系统上培养的PEDV最高滴度可达到106.05TCID50/m L,明显高于方瓶培养。本试验为研究PEDV能更好适应Vero细胞,提高PEDV产量提供技术支持。 相似文献
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《畜牧与兽医》2017,(8):102-106
为探究猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)LY86株与其他不同来源TGEV毒株之间在分子生物学上的差异及其在猪睾丸(ST)细胞上的增殖特性,分别进行了TGEV LY86株N基因的序列分析,以及病毒株以不同感染复数(MOI)感染ST细胞的毒价测定。结果显示:TGEV LY86株与其他17株TGEV参考毒株核苷酸序列同源性在97.2%~99.8%,特别是与M6、M60、TS、H、H16及JS2012毒株之间均存在很高的同源性;感染复数直接影响TGEV LY86株在ST细胞上的增殖效率,过高或过低的感染复数均可导致较低的TGEV增殖效价;当以MOI=0.001接毒时,感染后48 h所收获的病毒毒价最高,达10~(6.20±0.23)TCID_(50)/0.1 mL。本研究对分析TGEV的遗传变异规律与感染特征、优化疫苗生产工艺等具有重要的参考意义。 相似文献
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《中国兽医杂志》2016,(5)
为了建立高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)的Marc-145微载体细胞悬浮培养工艺以提高HPPRRSV抗原效价,以BC-7L生物反应器微载体悬浮培养Marc-145细胞,对HP-PRRSV接毒时间、接毒剂量、维持液血清浓度、溶氧量参数、病毒增殖温度等工艺参数进行了摸索和优化。通过细胞悬浮培养逐级放大工艺,在BC-100L生物反应器中培养Marc-145细胞,以优化后HP-PRRSV悬浮培养工艺进行3个批次的病毒悬浮培养。结果在Marc-145细胞微载体悬浮培养的第4天按照感染复数(multiplicity of infection,MOI)为0.1的剂量接毒,接毒后以2%新生牛血清的维持液进行维持培养,溶氧参数设置为40%,最佳培养温度为37℃,最佳收获病毒时间为70~74 h。BC-100L生物反应器中培养的3批病毒增殖曲线与BC-7L培养的病毒增殖曲线相近,在接毒后72 h左右达到病毒效价高峰,病毒含量均不低于108.0TCID50/m L。表明HP-PRRSV悬浮培养工艺稳定,可以实现逐级放大、规模化生产。 相似文献
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本试验旨在探讨微载体生物反应器使用不同PK15细胞密度培养猪圆环病毒2型的效果,对比不同细胞密度培养出的抗原效价,从而选择最佳细胞密度培养猪圆环病毒2型,提升猪圆环病毒2型抗原效价。在生物反应器细胞上罐时分别按每个微载体20、30、40、50个细胞的细胞密度接种至4台相同的生物反应器罐中进行培养,每罐均按相同的条件培养,在分别培养4 h、24 h、48 h、96 h时取样观察细胞的生长状态并统计细胞密度,当大部分载体细胞脱落70%时收获抗原,并留样检测其抗原效价。结果显示:每个微载体40个细胞的细胞密度上罐培养的效果最好,表现在4 h时细胞贴附微载体较均匀,24 h时90%微载体长满单层细胞,48 h时细胞生长致密,细胞密度增长8倍,72 h时细胞增长7倍,最终收获抗原效价最高达到107.5TCID50/m L。结果表明:每个微载体40个细胞的接种密度上罐,培养效果最好,效价最高。因此,在微载体生物反应器上培养猪圆环病毒2型时,选择合适的细胞密度接种是保证培养高效价病毒的一个重要前提。 相似文献
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本文主要研究了利用生物反应器Tide-Cell微载体培养的BHK-21细胞生产狂犬病毒Flury株工艺。总数为1×1010个BHK-21细胞接入装有500 g BioNOCTMⅡ型载体的Tide-Cell培养系统,最适条件下培养120 h。当细胞培养系统中葡萄糖消耗量达到8 g/(L·h)左右,细胞数达到4×1011时,按照MOI为1接入Flury株病毒。一批至少可以收获10次(50 L/次)毒价高于107.5TCID50/mL的抗原液,其中包含5次毒价为108.0TCID50/mL的抗原液。提高抗原液病毒含量有助于提升狂犬病灭活疫苗效价,从而降低生产成本。 相似文献
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《中国兽医杂志》2019,(4)
研究表明,PCV2仅在PK15等少数哺乳动物细胞上增殖,但由于PCV2毒力弱,且不产生细胞病变,获得高滴度病毒难度较大~([1])。因此,PCV2的培养滴度高低已成为制约现有疫苗质量的关键瓶颈之一。为建立在生物反应器内微载体逐级放大培养PK-15细胞和增殖PCV2技术,本研究以德国Sartorius14 L生物反应器微载体悬浮培养PK-15细胞,对PK-15细胞初始接种密度、搅拌转速、微载体浓度、PCV2接毒时间、接毒剂量、收毒时间等工艺参数进行了摸索和优化~([2-3])。结果表明:3 g/L的微载体和60 r/min的搅拌转速下,采用0.5×10~6cells/mL的初始接种密度操作工艺可获得最佳PK-15细胞生长效能。细胞生长后6 h接毒,采用感染复数(MOI)为0.5的接毒比例,细胞接毒后在微载体上生长96 h可获得最高的PCV2增殖滴度10~(8.5)TCID_(50)/mL,利用该工艺,经过消化转移将PK-15细胞从14 L反应器放大至42 L反应器,微载体上细胞贴附均匀、生长旺盛,42 L反应器中培养72 h细胞密度可达39.0×10~5 cells/mL,病毒滴度10~(8.3)TCID_(50)/mL,应用生物反应器培养PCV2滴度较常规转瓶培养工艺提高了近10倍。进一步表明PCV2悬浮培养放大与接毒工艺稳定,为下一步实现工业级规模化生产奠定基础。 相似文献
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悬浮培养工艺与转瓶培养工艺的比较分析 总被引：2，自引：1，他引：1
采用反应器全悬浮培养BHK21细胞生产口蹄疫病毒与微载体悬浮培养Vero细胞生产狂犬病毒分别与相应的转瓶培养工艺生产案例对比分析,比较悬浮培养工艺与转瓶培养工艺的生产效益。分析显示,与转瓶培养工艺相比,反应器悬浮培养工艺获得的细胞密度、病毒效价、产品的产量和质量明显提高,生产时的能耗和劳动力需求明显降低。结果表明悬浮培养工艺的生产效益明显高于转瓶培养工艺,适宜于国内生物制品工业化生产的升级换代。 相似文献
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目的利用微载体规模化培养ST细胞制备猪细小病毒L株灭活疫苗,并检测其免疫原性。方法猪细小病毒L株接种微载体悬浮培养的猪睾丸传代细胞系(ST细胞)后,收获细胞培养液和细胞,经二乙烯亚胺(BEI)溶液灭活后浓缩,加矿物质油佐剂乳化,制备灭活疫苗,经肌肉注射疫苗,免疫后28天采血,测定血清中和抗体效价。结果。微载体规模化培养ST细胞制备猪细小病毒获得病毒毒价较高,经灭活浓缩后制备疫苗免疫豚鼠,获得了较高效价的中和抗体效价。结论利用微载体规模化培养ST细胞成功制备了具有较高免疫原性的猪细小病毒灭活疫苗,为后期灭活疫苗的开发奠定了基础。 相似文献
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为了实现鸡新城疫病毒HN2018株(基因Ⅶ型)在乳仓鼠肾(BHK-21)细胞上的无血清规模化培养，本试验采用悬浮培养技术驯化和筛选了1株能够稳定传代的BHK-21-xh悬浮细胞株；使用该细胞以初始密度为100×104个/mL接种摇瓶进行培养，并对摇瓶培养鸡新城疫病毒HN2018株的接毒细胞密度、培养温度、接毒量、收毒时间等工艺参数进行摸索和优化；利用摇瓶优化的病毒培养工艺，在10和100 L生物反应器中逐级放大培养BHK-21-xh悬浮细胞，接种鸡新城疫病毒；采用生物反应器悬浮培养的鸡新城疫病毒HN2018株细胞毒与鸡胚毒分别制备成灭活疫苗，免疫SPF鸡进行免疫效力的比较。结果显示，在摇瓶中培养72 h细胞密度均不低于800×104个/mL,细胞活率均不低于96%;按照BHK-21-xh细胞密度不低于800×104个/mL,病毒感染复数(MOI)为0.216进行接毒，同时添加终浓度为20μg/mL的胰蛋白酶，于35℃温度条件下培养64～72 h收获病毒液，鸡新城疫悬浮培养细胞毒红细胞凝集(HA)效价最高能够达到10log... 相似文献
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草鱼出血病细胞培养灭活疫苗生产工艺的比较 总被引：1，自引：0，他引：1
比较了方瓶静置培养、１０×２００ｍｌ转管培养和细胞生物反应器微载体培养３种方法增殖细胞和病毒的效率,以细胞生物反应器微载体培养法的效率最高,与静置培养法相比较,单位培养液细胞增殖量提高２０～２５倍,病毒增殖量ＴＣＩＤ５０测定增加１．６５对数值,ＬＤ５０测定增加１．４５对数值。经济效益比较,疫苗制备的培养液成本,以细胞生物反应器微载体培养法最低。已研究出以细胞生物反应器微载体培养法增殖细胞和病毒为基本生产工艺的工厂化生产草鱼出血病细胞疫苗工艺流程。 相似文献
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为了建立水貂源犬瘟热病毒(CDV)的大规模悬浮培养技术，实现细胞高密度生长和病毒高效增殖，本研究应用Cephodex微载体悬浮培养鸡胚成纤维细胞系DF-1细胞，增殖弱毒株CDV3。整个过程采用摇瓶培养法，通过对病毒培养温度、病毒收获时间等关键技术条件进行优化，确立最佳培养条件。结果表明，DF-1细胞37℃培养至72 h,接种CDV3,35℃继续培养72 h收获病毒，病毒滴度每0.1 mL可达105.0 TCID50。CDV微载体悬浮培养技术的初步建立，为高效水貂犬瘟热疫苗的研发生产奠定了重要的基础。 相似文献
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《中国家禽》2016,(1)
为探讨鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)BJ902株感染复数(Multiplicity of infection,MOI)、接种时间和维持液三种因素对在悬浮培养DF-1细胞上的病毒滴度影响,分别以不同MOI的IBDV BJQ902株感染悬浮培养24 h的DF-1细胞,以0.005 MOI的IBDV BJQ902株感染悬浮培养不同时间的DF-1细胞,然后以含2%胎牛血清(FBS)的高糖DMEM(HG-DMEM)作为维持液进行培养,观察感染后不同时间的细胞病变、收获感染不同时间的病毒液。以0.005 MOI感染悬浮培养24 h的DF-1细胞,然后使用含2%FBS的不同维持液(MEM、HG-DMEM、LG-DMEM)进行病毒增殖,收获不同时间的病毒液,测定病毒液的TCID_(50)。结果显示,以0.005 MOI的IBDV BJQ902种毒接种悬浮培养24 h的DF-1细胞,维持液为2%FBS的HG-DMEM进行病毒增殖,病毒接种后24~36 h收获的病毒毒价可达10~(8.3) TCID_(50)/0.1 m L以上。表明IBDV BJQ902株可以在微载体悬浮培养的DF-1细胞上高密度增殖。 相似文献
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《中国预防兽医学报》2020,(9)
来源于肠隐窝干细胞的肠小体能模拟体内肠上皮复杂的生理特性,已成为研究宿主与肠道病原相互作用的理想的体外细胞模型。为探究肠小体能否作为猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)感染模型,本研究从仔猪的回肠组织分离培养隐窝干细胞,在培养第7 d后能形成具有隐窝-绒毛样结构的肠小体。分别采用MOI 1、0.1和0.01 TGEV感染肠小体后,通过荧光定量PCR(qPCR)方法检测TGEV在肠小体中的复制情况,结果显示肠小体支持TGEV复制;进一步用MOI 1 TGEV感染肠小体后,通过qPCR检测并绘制TGEV在肠小体中的病毒复制曲线,结果显示,与2 hpi相比,在12 hpi病毒的mRNA转录水平增加了321倍,在24 hpi病毒复制达到峰值;通过间接免疫荧光(IFA)检测TGEV N蛋白的表达,结果显示N蛋白的表达情况与上述mRNA检测结果相符。通过双荧光标记IFA检测TGEV N蛋白与肠上皮细胞类型标志物的共定位情况,结果显示TGEV能感染多种肠上皮细胞类型,包括肠细胞、干细胞和杯状细胞。此外,通过qPCR检测TGEV感染肠小体的干扰素(IFN)mRNA转录水平,结果显示TGEV感染肠小体能显著增加IFN的产生。以上结果表明肠小体对TGEV易感,肠小体可以作为TGEV感染的体外细胞模型。本研究为探究TGEV与宿主之间的相互作用提供了一个全新的体外细胞模型,将有助于深入理解TGEV的致病机制。 相似文献
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本试验成功分离了1株猪传染性胃肠炎病毒(TGEV),并对其进行了鉴定及生物学特性研究。取华南地区某猪场腹泻病猪肛拭子经无菌处理后接种PK-15细胞分离病毒,首代培养即产生典型的细胞病变。该毒株对鸡红细胞的血凝价为26,病毒效价(TCID50)为108.15/mL。经标准TGE阳性血清的血凝抑制和细胞中和试验鉴定该病毒为TGEV,血凝抑制滴度为28、中和效价为1∶381。通过RT-PCR检测及序列分析,确定其为TGEV,并将该毒株命名为TGEV NC株。TGEV NC株在没有超离纯化和4℃处理下仍有较高血凝特性,为国内首次报道。 相似文献
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《畜牧兽医科技信息》2020,(8)
正微载体悬浮培养高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒是提升该疫苗产品质量的重要工艺技术,细胞微载体悬浮培养不仅可以提高单位体积内的细胞量、提高病毒产品效价,同时还具有劳动成本低、产品批间差异小等优点。在提升并保证病毒含量的基础上降低微载体的使用浓度,是生产部门提质降本的方向。我公司利用5L和50L生物反应器微载体悬浮培养Marc145细胞,对接毒时细胞活力、细胞密度的选择、接毒剂量、病毒收获时机等工艺参数优化基础上,进行了微载体使用浓度的比较,确定了适合的微载体使用浓度,达 相似文献
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为提高猪圆环病毒2型(PCV2)的增殖规模及单位体积内的病毒滴度,本研究利用转管微型反应器,采用荧光定量PCR检测方法,对PCV2在PK-15细胞中复制特性和增殖动态进行了系统研究。结果显示,转管(内置0.6 g纸片载体)中接种约2.98×107个DF-1细胞,培养7 d细胞增至1.93×108~2.0×108个,并确定培养7 d时为最佳接毒时间;病毒的最佳接种剂量为120.8 MOI,最佳收毒时间为接毒后的100 h,可达5.53E+06以上。细胞数增长与糖耗间呈明显平行关系,在细胞生长期内(168 h)平均每个细胞耗糖量为3.09×10-8g/24 h,可以根据糖耗量的多少推测细胞生长状态和数量。相同培养液中利用转管微型反应器培养PK-15细胞生产PCV2最终获得的病毒液毒价比转瓶培养毒价提高1.65倍。本实验为PCV2在生物反应器中大规模培养提供了参考依据。 相似文献