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为建立空心莲子草致病菌假隔链格孢菌Nimbya alternantherae的原生质体提取体系,以其强致病性野生型菌株N.alternantherae 11-2为供试菌株,研究了不同菌龄、酶系统、酶解时间及稳渗剂等对假隔链格孢菌原生质体制备及再生的影响,并采用聚乙二醇PEG介导转化法,构建了随机插入突变体库。结果表明,在酵母浸出粉胨葡萄糖液体培养基中培养2 d的假隔链格孢菌丝体,以0.7 M山梨醇为稳渗剂,同时使用2%裂解酶、2%崩溃酶和2%蜗牛酶3种酶的混合液,在30 ℃下酶解3 h能获得足量的原生质体,且其再生率也可满足后继转化试验的要求。 相似文献
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原生质体的制备是真菌遗传转化的基础,为了解芦笋茎枯病菌Phomopsis asparagi的遗传转化体系,以芦笋茎枯病菌Pa1100为供试菌株,研究了细胞壁裂解酶、酶解时间、稳渗剂等对芦笋茎枯病菌原生质体制备的影响及稳渗剂对原生质体再生的影响。结果表明可制备芦笋茎枯病菌原生质体较为适宜的条件是：CM液体培养基中培养分生孢子3 d,以1.5%裂解酶、1%崩溃酶和1.5%蜗牛酶为组合酶解液,33 ℃水浴酶解4.5 h,以PBS（pH 6.98）与1 mol/L MgSO4混合液为酶解稳渗剂。含0.6 mol/L蔗糖的PDA培养基较适合于芦笋茎枯病菌原生质体的再生。 相似文献
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以优化原生质体的制备方法,建立小麦光腥黑粉菌的遗传转化体系为目的,研究了小麦光腥黑粉菌菌株培养时间、细胞壁裂解酶、酶解时间和渗透压稳定剂等对原生质体制备的影响。结果表明,以水琼脂培养基上培养7d的菌丝为初始材料,配置1.5%崩溃酶+1.5%溶壁酶+1.5%蜗牛酶的复合酶液,28℃酶解2 h后原生质体的获得率最高;以1.2 mol/L的氯化钾为渗透压稳定剂,得到的原生质体数量最多,且释放的原生质体能够均匀散乱分布,不聚集成堆;较适宜原生质体再生的培养基为TB3培养基,可产生较多的单菌落。 相似文献
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研究了多种细胞壁降解酶的种类和浓度、酶解时间、菌龄,以及渗透压稳定剂等因素对粉红粘帚霉67-1菌株原生质体形成和再生的影响。结果表明,粉红粘帚霉67-1菌株原生质体形成的适宜条件为:使用溶壁酶(3mg/ml)、蜗牛酶(3mg/ml)、纤维素酶(2mg/ml)的组合酶液酶解时间为2h,菌龄为14h,稳渗剂为NaCl(0·5mol/ml)。在上述条件下,原生质体产量达到9·25×106/ml。将原生质体涂布于含KCl(0·5mol/ml)的再生培养基上,再生率最高。显微观察表明,粉红粘帚霉67-1菌株主要通过顶端和侧位释放原生质体。 相似文献
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苏云金芽胞杆菌B7发酵液在药后96 h对小菜蛾2龄幼虫致死率高达85.06%;枯草芽胞杆菌TL2对黄瓜枯萎病和辣椒疫霉病有显著拮抗活性(对峙培养5 d对病原菌的平均抑制率在60%以上)。本文对菌株B7和TL2的原生质体形成、完全灭活及融合的最佳条件分别进行了筛选,研究结果表明菌株B7在溶菌酶1.0 mg/m L、酶解70 min的条件下,原生质体形成率和再生率最佳,分别为85.0%和29.41%;菌株TL2在溶菌酶1.25 mg/m L、酶解50 min的条件下,原生质体形成率和再生率最佳,分别为80.00%和25.00%。菌株TL2原生质体完全灭活的最佳条件为60℃水浴35 min,菌株B7原生质体完全灭活的最佳条件为紫外照射25 min。灭活后的两亲本融合最佳条件为30℃水浴融合20 min后涂布再生培养基,用影印法连续传代10次以上,最后筛选出17株稳定的融合子,经过杀虫防病检测最后筛选到一株兼具两亲本特性的高效融合子TLB15。TLB15发酵液在药后96 h对小菜蛾2龄幼虫校正死亡率为93.44%,TLB15发酵液对黄瓜枯萎病和辣椒疫霉病(对峙培养5 d)的平均抑制率分别为60.00%和62.79%。 相似文献
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禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)是引起我国小麦纹枯病的主要致病菌。为了建立高效稳定的禾谷丝核菌遗传转化体系,本试验比较研究了不同细胞壁降解酶、酶液浓度、酶处理温度和时间等因素对禾谷丝核菌原生质体制备的影响,利用正交设计试验优化了原生质体再生条件。结果表明,液体培养6d的菌丝,采用15mg/mL溶壁酶+10mg/mL蜗牛酶组成的混合酶液,30℃下酶解4h,可以获得较高的原生质体释放量,可达到3.0×106个/mL;禾谷丝核菌原生质体再生的最佳条件是以SuTC缓冲液作为渗透压稳定剂悬浮原生质体,采用单层混菌法接种于TB3再生培养基,原生质体再生率可达到58.6%。禾谷丝核菌原生质体制备和原生质体再生条件的优化,为深入研究禾谷丝核菌生长发育的分子遗传学基础和进一步探索小麦纹枯病的致病机理奠定了基础。 相似文献
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地衣芽胞杆菌Bacillus licheniformis HS10及其粗蛋白对多种病原真菌具有防治效果,为挖掘其生防功能基因,本研究通过对原生质体的制备、再生培养基、渗透压稳定剂、电击参数等试验条件进行优化,建立了地衣芽胞杆菌HS10原生质体电转化法。结果表明最佳转化条件为:转接培养10h达到对数生长后期的菌体,浓缩4倍后,利用终浓度1mg/mL的溶菌酶,于37℃、150r/min酶解20min,酶解效率达到99.34%,1×SMM洗涤3次,调整菌浓度至1.0×108 cfu/mL,并通过1.6kV、5ms的电击后,迅速在SMMP溶液中100r/min、37℃恢复6~10h,涂布于含Kan和Erm的再生培养基DM3平板。将该方法用于突变体库构建的质粒pMarA(8 253bp)和基因敲除质粒pMADΔCP(13 043bp)的大片段质粒转化,分别获得了37cfu/μg DNA和10cfu/μg DNA阳性转化子。该遗传转化体系为地衣芽胞杆菌HS10中相关基因功能的研究提供了技术支撑。 相似文献
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为建立香梨果萼黑斑病菌链格孢(Alternaria alternata)的原生质体遗传转化体系,本实验以香梨果萼黑斑病菌强致病性菌株LI1为供试材料,研究菌龄、酶系统、酶解时间等对链格孢菌原生质体制备的影响。链格孢菌菌丝在CM液体培养基中培养20 h,以0.7 mol·L-1 NaCl为稳渗剂,1%裂解酶+1%崩溃酶+1%蜗牛酶的酶液组合下,28 ℃酶解4 h,原生质体制备效率最高。通过PEG/CaCl2介导法将含有潮霉素B抗性基因和绿色荧光蛋白基因的质粒转入链格孢菌LI1,转化子生长表型及外源基因的PCR鉴定结果表明抗性基因已成功整合到香梨果萼黑斑病菌中。成功建立了香梨果萼黑斑病菌链格孢菌的原生质体遗传转化体系,并成功获得GFP标记菌株,为病原菌侵染定殖过程及致病机制研究奠定了基础。 相似文献
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突脐蠕孢与弯孢原生质的双亲灭活融合 总被引：4，自引：0，他引：4
采用灭活原生质体方法,对致病力强、产孢量低的突脐蠕孢EM菌株和致病力较弱、但产孢量高的弯孢CL菌株两株稗草致病菌进行原生质体融合,通过观察形态、生物学及抑草活性等特性筛选融合子。结果表明,2%溶壁酶+2%蜗牛酶处理获得两亲株的原生质体释放数量最高,CL和EM分别达1.25×106个/ml和1.21×106个/ml;再生培养基○c处理的CL和EM原生质体再生率分别达14.7%和13.2%。EM利用热灭活55℃5min;CL利用紫外灭活30s,距离20cm,照射时间4min;聚乙二醇促融,获得3个融合子。融合子在孢子形态上与亲株存在明显差异,其菌丝生长速度、孢子产量、对稗草根生长的抑制作用等也与双亲菌株有差异。 相似文献
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由链格孢(Alternaria alternata)引起的梨黑斑病是我国梨生产上的主要病害之一,导致梨叶与果实产生黑斑症状及早期落叶,对我国梨产业的健康发展构成严重威胁。本实验在前期获得强致病性梨黑斑病菌菌株HN-5基础上,建立该病菌的遗传转化体系。通过优化原生质体制备过程以及转化体系发现梨黑斑病菌HN-5原生质体制备的最优条件为:菌丝在M R液体培养基中培养36 h;以0.7 M NaCl+0.8 M Mannitol为稳渗剂,配置复合细胞壁裂解酶(1%崩溃酶+1%裂解酶+1%纤维素酶+1%蜗牛酶),酶解菌丝3 h,原生质体的产量可达0.5×10~7个·mL~(-1)。通过PEG介导的原生质体遗传转化体系,将含有RFP基因的质粒p KD7转入链格孢菌HN-5中,转化效率为6个·μg~(-1)DNA。PCR检测和转化子荧光观察均表明RFP基因整合到了HN-5基因组中并成功表达。致病性分析发现RFP (Red Fluorescent Protein)标记转化子致病性未发生变化。本研究成功建立了PEG (Polyethylene glycol)介导的梨黑斑病菌遗传转化体系,构建了RFP标记菌株,为研究该病菌的致病机理奠定基础。 相似文献
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紫杉木霉菌株ZJUF0986原生质体的制备及诱变抗性菌株的选育 总被引：1，自引：0，他引：1
通过原生质体诱变,以目标代谢产物木霉菌素为抗性筛选标记选育木霉菌素高产菌株。紫杉木霉野生型菌株ZJUF0986在N15培养基中生长20h的菌丝体,用15mg/mL崩溃酶、30mg/mL蜗牛酶和30mg/mL溶壁酶组合成的混合酶为酶裂解液,以菌丝量∶ 酶裂解液=1∶ 2.5(w/v)的比例,在30℃、100r/min条件下酶解90min,原生质体释放量最佳,达到9.42×108个/mL。所制备的原生质体进行氯化锂-紫外复合诱变,紫外照射剂量为60s时的突变率和正突变率最高,筛选到高产突变体菌株UL60-11,其发酵效价比野生型菌株提高67.3%。 相似文献
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为了探索不同酶系组成对玉米弯孢叶斑病菌原生质体制备的影响,建立该病菌原生质体遗传转化系统,采用酶系混合物裂解菌丝体制备原生质体,采用PEG介导方法进行原生质遗传转化,通过PCR和Southern blotting技术对转化子进行验证。结果表明:1%溶壁酶+1%蜗牛酶+1%纤维素酶混合酶系为玉米弯孢叶斑病菌原生质体制备的最佳酶系,可以产生原生质体6.78×106 cfu/mL。用PEG介导方法转化共获得16个稳定的转化子,从中随机挑取5个转化子发现质粒pV2已被成功整合到基因组中。本研究获得了制备玉米弯孢叶斑病菌原生质体的最佳酶系,建立了PEG介导的原生质体遗传转化体系,为开展该菌致病相关基因克隆和基因功能研究提供了一种手段。 相似文献
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小麦锈菌夏孢子经盐酸处理后的形态观察 总被引：1，自引：0，他引：1
为了快速区分小麦条锈菌、叶锈菌和秆锈菌,用不同浓度的盐酸处理3种小麦锈菌的新鲜夏孢子和在4 ℃冰箱内保存4个月以上的锈菌夏孢子,在显微镜下观察夏孢子形态以及原生质体变化。结果表明, 24.5%、28.5%、32.5%、36.5%4种浓度的盐酸处理条锈菌夏孢子后其原生质体均浓缩成多个分散的小团。而同样方法处理叶锈菌和秆锈菌新鲜菌种时其原生质体浓缩成一个大团或多个小团,浓缩成一个大团的比例随盐酸浓度的增大而提高;用不同浓度盐酸处理保存4个月以上的2种小麦锈菌时,95%以上的夏孢子原生质体浓缩成多个分散的小团,少数（不超过5%）的夏孢子原生质体浓缩成一个大团。研究还发现叶锈菌和秆锈菌夏孢子活力、盐酸浓度等对夏孢子原生质体浓缩状况有很大影响,且与病菌生理小种有一定的关系。因此,锈菌夏孢子经36.5%浓盐酸处理后的原生质体浓缩状况只能作为小麦锈病田间快速诊断检测的辅助手段,不能作为锈病种类鉴别的唯一标准,必须结合病害症状特征、孢子形态以及分子生物学方法等进行综合判别。 相似文献
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原生质体法介导真菌遗传转化体系是实现大规模随机、定点突变和菌种改良的方法之一,为研究真菌致病性和侵染机制奠定了基础。原生质体法构建转化体系的步骤包括原生质体的制备、转化与再生,其中关键是原生质体的制备,通常采用酶解法破除细胞壁获得原生质体,其获得率直接影响转化效率。转化通常借助于聚乙二醇(PEG)介导、电击或限制性内切酶法完成,其中PEG介导的原生质体转化法较传统,技术较成熟;电击法操作较简单;限制性内切酶(REMI)介导的整合转化,因其转化效率较高,可产生大量稳定的转化子,正被越来越多地应用于丝状真菌的遗传转化。 相似文献
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以苹果属珠眉海棠(Maluzumi Mati)根为供体进行原生质体分离条件的研究,结果表明,酶解过程中酶液浓度、酶液渗透压、酶解时间均对原生质体分离效果产生重要影响。对于珠眉海棠,一步酶解法,两步酶解法皆可以分离根原生质体,但两步酶解法优于一步酶解法。两步酶解法的最佳分离条件为:Cellulysin 28 mg/mL+纤维素酶(Cellulase RS)15 mg/mL+果胶酶(PectolaseY-23)2 mg/mL。 相似文献