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扩增口蹄疫病毒(FMDV) 3C蛋白编码基因,将其克隆到原核表达载体,并转化至大肠杆菌BL21中进行诱导表达; 3C重组蛋白纯化后免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体,通过ELISA和Western blot检测多克隆抗体的效价和特异性,并将该抗体通过间接免疫荧光(IFA)和Western blot应用于3C的检测。ELISA结果显示,制备的3C蛋白多克隆抗体效价达1∶256 000; IFA结果显示,该抗体能够检测到3C蛋白在细胞中的定位; Western blot结果显示,该多克隆抗体能够检测到在细胞中过表达的3C蛋白。本研究制备的FMDV 3C蛋白多克隆抗体为FMDV及其3C蛋白的相关研究提供了重要的物质基础。 相似文献
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旨在获得牛支原体延伸因子EF-Tu蛋白,分析其在牛支原体菌体内的分布情况,建立EF-Tu间接ELISA法,为进一步研究牛支原体EF-Tu的生物学功能提供理论依据,也为建立牛支原体有效的血清学诊断方法和亚单位疫苗的研制奠定基础。参照Uniprot数据库中M.bovis PG45株EF-Tu基因序列,应用Overlap PCR扩增获得EF-Tu基因并将其克隆至pMD19-T载体,测序正确后,构建pET32a-EF-Tu原核表达载体,转化大肠杆菌BL21表达菌,IPTG诱导表达,纯化后的表达产物免疫新西兰兔(New Zealand rabbit)制备多克隆抗体,利用间接ELISA测定高免血清抗体效价,用Western blot和间接ELISA法初步定位EF-Tu在菌体内的分布,通过优化反应条件,建立间接ELISA检测法。结果表明:重组蛋白EF-Tu约为66ku,主要以可溶性形式表达;采用间接ELISA测定的多克隆抗体效价为1:6400;Western blot和ELISA表明该蛋白在牛支原体细胞质和细胞膜中均有表达,且含量相当。利用EF-Tu建立的ELISA法具有很好的特异性和敏感性。通过原核表达系统成功得到牛支原体延伸因子的重组蛋白,该蛋白分布于菌体细胞质和膜表面,且含量基本相当。本研究所建立的EF-Tu ELISA法适合大规模的血清学诊断检测。 相似文献
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《中国动物传染病学报》2015,(5)
采用PCR方法扩增鸭TLR3基因胞外区,将其克隆至原核表达载体p ET-32a(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,经IPTG诱导后,表达重组TLR3蛋白,并从包涵体中纯化重组蛋白。结果显示,PCR扩增得到972 bp的TLR3基因胞外区,用纯化的重组TLR3蛋白免疫实验兔,制备TLR3的多克隆抗体,用Western blot和ELISA检测其特异性及效价。本研究成功表达了TLR3基因胞外区,用该蛋白免疫实验兔后,制备的多抗能与TLR3特异性反应。 相似文献
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克隆猪细小病毒(PPV)VP2基因全长1 740bp,构建其原核表达载体后进行蛋白的表达与纯化,接种家兔制备多克隆抗体。用PCR方法扩增PPV VP2全长基因,扩增产物克隆至表达载体pET-32a并转化至E.coli BL21(DE3)感受态中。分别用不同诱导时间、IPTG浓度、温度诱导表达VP2重组蛋白,经SDS-PAGE电泳切胶回收纯化目的蛋白。对家兔进行3次免疫后,采集血清制备抗体。PCR扩增得到1 740bp的VP2基因片段;构建原核表达载体pET-32a-VP2,经37℃,IPTG浓度1.0mmol/L诱导表达4h可得分子质量大小约为82ku目的蛋白;间接ELISA检测抗体效价可达1∶12 800;Western blot证明所制备的抗体能够有效的应用于PPV VP2抗原的检测。本研究成功构建了表达PPV VP2基因的原核载体,获得了VP2蛋白,制备了兔抗多克隆抗体,为建立检测PPV VP2蛋白ELISA方法奠定了基础。 相似文献
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克隆猪热休克蛋白40 (heat shock protein 40,Hsp40)基因并构建其原核表达载体,以纯化的猪Hsp40蛋白为抗原免疫兔制备抗猪Hsp40多克隆抗体。参照GenBank收录的猪Hsp40全基因序列,设计1对特异性扩增其CDS区全序列的引物,利用RT-PCR方法扩增猪Hsp40基因;扩增产物经双酶切后定向克隆至原核表达载体pCzn1-His,测序无误后转化Arctic Express (DE3) RP感受态高效表达宿主菌,优化其表达条件(时间、IPTG浓度、温度)后,将可溶性的猪Hsp40重组蛋白用His-Band Ni^+层析柱进行纯化,用纯化的His-Hsp40重组蛋白免疫兔以制备多克隆抗体。采用抗原亲和纯化法对制备的多抗进行纯化,并采用间接ELISA法检测抗体效价。利用Western blot检测重组蛋白的免疫原性和反应原性,以及抗体的特异性。结果显示,克隆得到的猪Hsp40基因片段长度为1 485 bp,表达出的可溶性His-Hsp40重组蛋白相对分子质量约为57 800,制备出的猪Hsp40蛋白多克隆抗体效价为1∶512 000,且该多抗能够特异性识别His-Hsp40重组蛋白和猪肺泡巨噬细胞中的Hsp40蛋白。结果表明,成功克隆了猪Hsp40基因,表达并纯化了猪Hsp40蛋白,制备的兔抗猪Hsp40蛋白多克隆抗体能够有效地应用于猪Hsp40蛋白抗原的检测。 相似文献
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《中国畜牧兽医》2019,(12)
本研究旨在通过原核表达系统表达非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)Georgia 2007/1株EP402R基因,获得其编码的CD2v重组蛋白,并针对纯化的CD2v重组蛋白制备多克隆抗体。将ASFV EP402R全长基因进行密码子优化后连入pET-28a(+)表达载体,构建原核重组表达质粒,经1 mmol/L IPTG于16℃诱导12 h后,利用SDS-PAGE和Western blotting对重组蛋白进行表达鉴定和反应原性分析。以纯化的CD2v重组蛋白为免疫原制备鼠源抗CD2v多克隆抗体,随后以间接ELISA方法、间接免疫荧光试验及Western blotting分别检测多克隆抗体的效价和特异性。结果显示,ASFV EP402R基因克隆至pET-28a(+)获得pET-28a-EP402R重组质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞后经诱导表达获得CD2v重组蛋白,其大小约为47 ku,重组蛋白主要以包涵体形式存在,部分也可以融合表达蛋白形式存在。Western blotting结果显示,其可溶性上清经镍柱纯化后能被ASFV阳性血清识别,具有良好的反应原性。间接ELISA检测该多克隆抗体效价可达1∶512 000,间接免疫荧光试验和Western blotting表明该多克隆抗体可特异性识别真核表达的CD2v蛋白。以上结果表明,通过原核表达的ASFV CD2v重组蛋白具有较好的免疫原性,利用重组蛋白制备的多克隆抗体具有较高的抗体效价和特异性,为进一步研究ASFV EP402R生物学功能及基因缺失毒株的鉴别诊断和疫苗开发提供技术储备。 相似文献
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《中国家禽》2019,(2)
试验拟通过构建A亚群禽白血病病毒(ALV-A) p27基因原核表达载体,从而制备抗p27蛋白鼠源多克隆抗体。将感染ALV-A毒株的DF-1细胞反复冻融后提取RNA并反转录为cDNA,利用PCR扩增获得ALV-A p27基因,将目的基因克隆至pColdⅠ载体,并转化入大肠杆菌BL21(DE3)菌中进行诱导表达,经镍柱纯化后免疫28～32日龄的雌性小鼠,采用间接ELISA法测定抗体效价,Western blot检测抗体特异性。试验经PCR扩增出750 bp左右的特异性条带,并成功构建pColdⅠ-ALV-A-p27原核表达载体,加入终浓度为1 mmol/L的IPTG于18℃诱导表达18～24 h成功得到重组蛋白,该蛋白主要以包涵体形式存在。间接ELISA检测显示,制备的鼠源多克隆抗体血清抗体效价为1∶3 200;Western blot检测结果表明,制备的多克隆抗体能特异性识别原核表达的p27蛋白。试验结果在ALV的抗原分析、血清学诊断等方面有着重要的应用价值。 相似文献
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【目的】应用大肠杆菌表达系统表达牛病毒性腹泻病毒(BVDV) E0蛋白,纯化后免疫小鼠制备E0蛋白多克隆抗体用于BVDV的检测技术研究。【方法】采用PCR扩增BVDV的E0基因,将其连接至pET-28a (+)构建重组表达载体pET28a-E0。将重组质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞,经IPTG诱导、亲和层析纯化后,通过SDS-PAGE和Western blotting鉴定E0蛋白的表达情况。将纯化的E0蛋白免疫小鼠制备BVDV E0多克隆抗体,并通过Western blotting、细胞免疫荧光试验、ELISA等试验检测该多克隆抗体的特异性和效价,以及在BVDV检测中的应用。【结果】成功构建原核表达载体pET28a-E0,表达并纯化E0蛋白,制备的BVDV E0多克隆抗体可特异性识别纯化的E0蛋白及pET28a-E0在BL21中表达的总蛋白。进一步Western blotting、细胞免疫荧光试验、双抗夹心法ELISA证明制备的E0多克隆抗体可用于BVDV的检测。间接ELISA结果表明,E0多克隆抗体效价高于1∶64 000。【结论】制备的BVDV E0多克隆抗体效价高、抗原结合特异性强,为BVDV E0蛋白的生物学功能研究及BVDV的检测提供了材料支持。 相似文献
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[目的]利用大肠杆菌原核表达系统对猪干扰素α-1(Po IFNα-1)基因进行表达,制备Po IFNα-1重组蛋白多克隆抗体。[方法]根据Gen Bank发表的Po IFNα-1核苷酸序列,合成密码子优化的Po IFNα-1基因,构建Po IFNα-1基因的p ET-28a原核表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌后,利用IPTG进行诱导表达。表达的Po IFNα-1重组蛋白纯化后,免疫昆明系小鼠,制备多克隆抗体。采用Western blot技术检测Po IFNα-1重组蛋白的多克隆抗体与天然Po IFNα-1的反应性。[结果]合成的Po IFNα-1基因在大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌中成功表达,针对Po IFNα-1重组蛋白的多克隆抗体能够识别天然的猪干扰素α-1。[结论]合成的Po IFNα-1基因在大肠杆菌中获得了成功表达,为后续研究奠定了基础。 相似文献
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《中国兽医学报》2020,(6)
试验旨在表达、纯化扩展莫尼茨绦虫VASA蛋白,并制备兔抗VASA多克隆抗体。根据扩展莫尼茨绦虫全基因核苷酸序列设计特异性引物,利用PCR方法扩增vasa基因片段;将扩增产物与原核表达载体pET-22b(+)连接,获得重组质粒pET-22b-VASA;经Amp抗性筛选阳性菌,双酶切、PCR测序鉴定后,将其转化大肠杆菌(DE3)感受态细胞中,并进行IPTG诱导表达;重组融合蛋白经镍柱纯化后,进行Western blot鉴定;将融合蛋白免疫兔,制备多克隆抗体。结果显示,重组质粒pET-22b-VASA构建正确,通过IPTG诱导获得大小约32 200的VASA重组融合蛋白;Western blot分析表明其与鼠抗His单克隆抗体呈阳性反应。纯化的VASA蛋白免疫兔获得了多克隆抗体,ELISA检测其效价为1∶128 000。本试验成功制备了具有免疫原性的VASA蛋白及其兔源多克隆抗体,为VASA蛋白生物学功能及该蛋白在绦虫体内的分布等研究奠定基础。 相似文献
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克隆弓形虫上海SHR株SRS20A基因,构建原核表达体系,通过诱导表达和蛋白纯化,免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,对蛋白进行特征化鉴定。采用PCR技术扩增弓形虫SRS20A基因,克隆至原核表达载体pET-30a（+）中,转化大肠埃希菌（E. coli）,IPTG诱导目的蛋白表达,采用镍亲和层析法获得纯化蛋白并免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,使用弓形虫阳性血清检测SRS20A蛋白的反应原性,应用纯化的rSRS20A蛋白通过ELISA方法对猪临床样品进行检测,利用Western blot技术检测多克隆抗体与弓形虫天然蛋白的反应性,通过间接免疫荧光观察SRS20A蛋白在虫体内的定位情况。成功从弓形虫基因组中扩增出SRS20A目的基因,构建了pET-30a-SRS20A重组质粒,利用小鼠感染弓形虫的阳性血清可以特异性识别重组蛋白rSRS20A,ELISA试验表明rSRS20A可以与猪临床血清特异性反应,证明SRS20A具有良好的反应原性。制备并获得了抗SRS20A重组蛋白的多克隆抗体,通过Western blot可检测出弓形虫天然蛋白SRS20A的特异性条带。通过间接免疫荧光方法鉴定S... 相似文献
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【目的】克隆绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae,Mo)EF-Tu基因,原核表达获得EF-Tu蛋白,制备抗EF-Tu蛋白的兔源多克隆抗体,为研究肺炎支原体EF-Tu蛋白的结构和功能奠定基础。【方法】采用重叠延伸PCR方法将pET-28a-EF-Tu质粒中EF-Tu基因中间的TGA密码子突变为TGG,并对测序结果与其他支原体参考株进行相似性比对和遗传进化分析,利用在线软件对其推测的蛋白序列进行生物信息学分析。将突变后的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行原核表达,经SDS-PAGE和Western blotting鉴定,利用镍柱亲和层析法纯化,以纯化的EF-Tu融合蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,采用间接ELISA和Western blotting检测多克隆抗体效价及免疫反应性。【结果】试验成功突变了EF-Tu基因中TGA位点,并构建了融合表达His标签pET-28a-EF-Tu′原核表达载体。生物信息学分析表明,克隆的EF-Tu基因与绵羊肺炎支原体MoGH3-3菌株相似性最高,亲缘关系最近;编码387个氨基酸,无N-糖基化位点和跨膜区域,存在10... 相似文献
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《畜牧兽医科技信息》2017,(8)
为制备猫疱疹病毒Ⅰ型(FHV-1)US3蛋白的多克隆抗体,本研究通过PCR方法扩增US3基因,将其克隆至原核表达载体pET-32a中,构建重组质粒pET-US3;然后转化大肠杆菌BL21(DE3),经1mmol/L IPTG诱导表达His-US3重组蛋白。SDS-PAGE和Western blot试验表明,该重组蛋白为可溶性表达,并且具有较好的反应原性。将切胶纯化后的重组蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体,并通过间接ELISA检测其效价达1:10,000以上。Western blot和间接免疫荧光试验显示,多克隆抗体能够与US3蛋白特异性结合。US3多克隆抗体的制备为US3缺失株的检测及进一步研究US3蛋白的生物学功能奠定了基础。 相似文献
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构建SPRN重组原核表达载体,并进行目的蛋白的表达、纯化及多克隆抗体的制备,提取BALB/c小鼠全血基因组,PCR扩增SPRN基因,克隆至融合表达载体,在大肠埃希菌中表达鼠Shadoo蛋白并纯化;以纯化蛋白为抗原免疫新西兰白兔制备抗血清,并检测抗体效价,用Western blot方法分别检测与重组及内源性Shadoo蛋白的反应性.结果表明,成功制备了小鼠Shadoo蛋白兔源多克隆抗体,为研究Shadoo蛋白与PrP蛋白之间的功能调节关系,自身的生理学作用以及Shadoo蛋白在传染性海绵状脑病发病机制过程中的生物学功能奠定了良好的基础. 相似文献
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【目的】试验旨在建立以鸡白痢沙门氏菌的毒力相关基因所编码的IPAJ蛋白为抗原的间接ELISA方法。【方法】PCR扩增IPAJ基因并连接到pCzn1表达载体上,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,IPAJ基因重组蛋白用IPTG进行诱导表达并纯化,通过Western blotting验证蛋白的反应原性。用纯化的IPAJ蛋白免疫60日龄试验兔,共免疫3次,制备其多克隆抗体,通过ELISA方法检测抗体效价。采用方阵滴定法优化以IPAJ蛋白作为诊断抗原的ELISA条件,初步建立以IPAJ蛋白为诊断抗原的间接ELISA方法,并与平板凝集试验结果进行比较。【结果】试验成功构建鸡白痢沙门氏菌IPAJ原核表达载体,并以包涵体形式纯化出重组蛋白,具有良好的反应原性。Western blotting分析结果显示,成功表达出32 ku的IPAJ蛋白,具有良好的特异性。间接ELISA检测结果显示,多克隆抗体效价为1∶25 600,表明成功制备出多克隆抗体。建立的以IPAJ蛋白为诊断抗原的间接ELISA方法的最佳优化条件为：抗原包被浓度为5μg/mL,5%脱脂奶粉封闭1.5 h,一抗最佳稀释浓度为1∶250... 相似文献
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绵羊梅迪-维斯纳病毒CA蛋白可溶性表达多克隆抗体制备及鉴定 《畜牧与饲料科学》2022,43(5):1-6
[目的] 制备绵羊梅迪-维斯纳病毒（maedi-visna virus,MVV）衣壳蛋白（capsid protein,CA）多克隆抗体,并鉴定其特异性。[方法] 根据MVV内蒙古分离株CA基因序列设计特异性引物,扩增CA基因,构建重组质粒;对 CA重组蛋白进行原核表达及纯化,制备兔源MVV CA重组蛋白多克隆抗体,采用间接ELISA方法测定其抗体效价,利用Western blot和免疫组化方法对其进行特异性鉴定。[结果] 成功构建MVV CA重组蛋白原核表达系统,纯化后的目的蛋白大小约27 kDa;间接ELISA方法测定制备的多克隆抗体效价为1:8 192;Western blot检测感染MVV绵羊的病肺组织,在25 kDa处出现特异性条带;免疫组化结果显示感染MVV绵羊的病肺中巨噬细胞的胞浆内有明显棕黄色阳性信号。[结论] 利用获得的可溶性重组MVV CA蛋白制备的多克隆抗体具有较好特异性,可为MVV血清学诊断技术提供检测抗体。 相似文献
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猪源牛病毒性腹泻病毒SD0803株E2蛋白的表达及抗体制备 总被引：1，自引：0，他引：1
表达去除SD0803E2基因跨膜疏水区的sE2蛋白并制备其抗体,为猪源BVDV诊断奠定基础。RT-PCR扩增SD0803株sE2基因,构建重组原核表达载体pGEX-4T-1-sE2,转化BL21(DE3),IPTG诱导蛋白表达,以纯化的重组蛋白为抗原免疫家兔制备多克隆抗体。采用间接ELISA、Western blot、间接免疫荧光等方法鉴定获得的抗体。结果显示,抗体效价最高可达1∶256 000;制备的抗体可与rsE2蛋白特异性结合;该抗体可特异性识别BVDV感染MDBK细胞表达的E2蛋白,显示抗体高度的特异性。成功构建pGEX-4T-1-sE2原核表达质粒,诱导其表达的蛋白免疫家兔,成功制备的猪源BVDV SD0803株E2抗体。 相似文献
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为深入了解绵羊myostatin基因的表达及调控机理,进行了绵羊myostatin蛋白多克隆抗体的制备.首先将绵羊myostatin基因C-端克隆人含组氨酸标签的表达载体pET-30a-c(+)中,转化大肠杆菌BL21后IPTG诱导表达,然后利用Ni2+亲和层析纯化重组蛋白,薄层扫描及Bradford法分别检测纯化后蛋白的纯度与含量.应用重组蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,利用间接ELISA法检测多克隆抗体效价,用Western blot及免疫细胞化学染色检测抗体特异性.结果,薄层扫描分析纯化后蛋白纯度可达95%以上,Bradford法检测蛋白浓度约5 mg·mL-1,制备的抗血清效价可达1:250 000以上,Western blot检测证明抗体特异性良好,免疫细胞化学染色表明抗血清可检测剑肌肉细胞中内源性myostatin的表达,说明所制备的多克隆抗体可以应用于进一步研究,有助于阐明绵羊myostatin的表达及调控机理. 相似文献