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1.
旨在解析牛MSTN启动子与MEF2C之间的相互调控作用,进一步探讨MSTN基因在肉牛肌肉生长发育方面的调控机制。首先,通过PCR扩增关岭牛MSTN启动子序列2 267 bp和MEF2C基因CDS区1 425 bp。其次,构建pGL3-Basic-MSTN和pcDNA3.1(+)-MEF2C双荧光素酶报告载体,采用脂质体法共转染至小鼠C2C12成肌细胞,24 h后检测其双荧光素酶活性。最后,通过PCR扩增MSTN启动子核心片段MSTN-P1,重新构建以MSTN-P1片段替代(CMV)区的重组表达载体pEGFP-N3-MSTN-P1-MEF2C,将其分别转染至小鼠C2C12成肌细胞和大鼠下颌腺上皮细胞,24 h后观察绿色荧光蛋白发光情况,48 h后提取细胞总RNA,利用qRT-PCR检测MEF2C基因在不同细胞中的表达情况。结果显示,在小鼠C2C12成肌细胞中,共转染pcDNA3.1(+)-MEF2C试验组较pGL3-Basic-MSTN试验组能显著增强MSTN启动子的活性(P0.05),较pGL3-Basic对照组能极显著增强MSTN启动子的活性(P0.01);MSTN启动子核心片段MSTN-P1能驱动MEF2C基因在小鼠C2C12成肌细胞中的表达量极显著上调(P0.01),且能驱动MEF2C基因在大鼠下颌腺上皮细胞中的表达量显著上调(P0.05)。结果表明,在转录水平,MSTN启动子与MEF2C可能同时参与了牛肌肉生长和分化的调控。 相似文献
2.
为了构建以PiggyBac(PB)转座子为载体元件,绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因,含UCP3基因启动子的PiggyBac转座子二元系统PB-513B-UCP3,并验证其转座活性,试验采用PCR技术扩增获得UCP3基因启动子,分别通过T4 DNA连接酶与质粒PB-513B-1和pEGFP-N3连接,构建重组质粒PB-513B-1-UCP3和pEGFP-N3-UCP3-pro;用脂质体法将质粒pEGFP-N3、重组质粒pEGFP-N3-UCP3-pro和PB-513B-1-UCP3以及PiggyBac转座子二元系统分别转染至小鼠成肌细胞C2C12中,检测其在小鼠成肌细胞C2C12中的表达情况。结果表明:PCR扩增得到大小为1 080 bp的单一目的条带;经酶切和测序鉴定,成功构建重组质粒PB-513B-1-UCP3和pEGFP-N3-UCP3-pro,PiggyBac转座子二元系统的阳性克隆数明显多于重组质粒PB-513B-1-UCP3和pEGFP-N3-UCP3-pro的克隆数。说明试验成功构建了PiggyBac转座子介导的重组质粒PB-513B-1-UCP3及pEGFP-N3-UCP3-pro,且证实PiggyBac转座子介导的牛UCP3基因启动子在小鼠成肌细胞C2C12中具有较高的转座活性。 相似文献
3.
本研究旨在对广西巴马小型猪成肌细胞决定基因1(myoblast-determining 1,MyoD1)进行克隆分析,并构建MyoD1基因真核表达载体pEGFP-N1-MyoD1,为进一步研究该基因在广西巴马小型猪骨骼肌发育中的调控作用奠定基础。以广西巴马小型猪的肝脏组织为材料,应用RT-PCR技术克隆得到广西巴马小型猪MyoD1基因编码序列,对其核苷酸序列和蛋白质序列进行生物信息学分析,并构建该基因的真核表达载体,经过PCR和双酶切验证,通过脂质体转染,将重组质粒转染C2C12细胞,在细胞水平验证了该载体的正确性。结果显示,广西巴马小型猪MyoD1基因编码区序列长960 bp,编码319个氨基酸,核苷酸序列与猪、牛、水牛、绵羊、马、人、小家鼠、褐家鼠、家犬的同源性依次为99.7%、92.8%、92.9%、92.6%、91.5%、82.9%、82.9%、82.0%和90.9%;系统进化树分析表明,广西巴马小型猪MyoD1基因在不同物种及进化过程中具有高度保守性;蛋白质结构分析表明,MyoD1蛋白为膜外蛋白,在第4-116位氨基酸处存在1个MyoD家族标志性的MyoD结构域,对广西巴马小型猪、猪和人的MyoD1蛋白高级结构比较发现其具有极高的相似性。本研究构建的广西巴马小型猪MyoD1基因表达载体pEGFP-N1-MyoD1,转染C2C12细胞后产生绿色荧光信号,表明MyoD1基因在C2C12细胞中成功表达。 相似文献
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广西巴马小型猪MyoD1基因克隆及其真核表达载体的构建 总被引：1，自引：0，他引：1
本研究旨在对广西巴马小型猪成肌细胞决定基因1(myoblast-determining 1,MyoD1)进行克隆分析,并构建MyoD1基因真核表达载体pEGFP-N1-MyoD1,为进一步研究该基因在广西巴马小型猪骨骼肌发育中的调控作用奠定基础。以广西巴马小型猪的肝脏组织为材料,应用RT-PCR技术克隆得到广西巴马小型猪MyoD1基因编码序列,对其核苷酸序列和蛋白质序列进行生物信息学分析,并构建该基因的真核表达载体,经过PCR和双酶切验证,通过脂质体转染,将重组质粒转染C2C12细胞,在细胞水平验证了该载体的正确性。结果显示,广西巴马小型猪MyoD1基因编码区序列长960 bp,编码319个氨基酸,核苷酸序列与猪、牛、水牛、绵羊、马、人、小家鼠、褐家鼠、家犬的同源性依次为99.7%、92.8%、92.9%、92.6%、91.5%、82.9%、82.9%、82.0%和90.9%;系统进化树分析表明,广西巴马小型猪MyoD1基因在不同物种及进化过程中具有高度保守性;蛋白质结构分析表明,MyoD1蛋白为膜外蛋白,在第4-116位氨基酸处存在1个MyoD家族标志性的MyoD结构域,对广西巴马小型猪、猪和人的MyoD1蛋白高级结构比较发现其具有极高的相似性。本研究构建的广西巴马小型猪MyoD1基因表达载体pEGFP-N1-MyoD1,转染C2C12细胞后产生绿色荧光信号,表明MyoD1基因在C2C12细胞中成功表达。 相似文献
5.
为阐明牛解偶联蛋白3（uncoupling protein 3,UCP3）和肌球蛋白重链1（myosin heavy chain 1,MYH1）基因启动子的核心区及其在小鼠C2C12和3T3-L1两种细胞株中的启动活性,本研究利用PCR、双荧光素酶和脂质体转染等方法进行关岭牛UCP3和MYH1基因启动子的扩增、重组载体构建和启动子活性分析。结果显示,试验成功构建了pGL3-Basic-UCP3-pro和pGL3-Basic-MYH1-pro重组真核表达载体,分别转染至小鼠C2C12和3T3-L1细胞后发现,UCP3、MYH1基因启动子的核心区分别为UCP3-P6（－385~+3 bp）和MYH1-P5（－255~+15 bp）区域;pGL3-Basic-MYH1-P2~pGL3-Basic-MYH1-P5在C2C12细胞中启动子活性均高于3T3-L1细胞,表明MYH1基因启动子活性在成肌细胞C2C12中较高。本研究阐明了UCP3和MYH1基因启动子的核心区及其启动子活性,为进一步研究UCP3和MYH1基因的转录调控机理提供了科学依据。 相似文献
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研究旨在构建具有高效抗菌、活性持久的奶牛乳腺特异性表达质粒,探索研制新型抗菌制剂,为利用基因工程技术防治奶牛乳房炎提供重要材料。根据GenBank中奶牛溶菌酶基因(lysozyme,Lyz)mRNA序列(GenBank号:NM_180999.1)设计引物,从奶牛乳腺上皮细胞中RT-PCR扩增Lyz基因编码序列,将其克隆到携带增强型绿色荧光蛋白通用型表达载体pEGFP-N1中测序。重组质粒pEGFP-N1-Lyz经Ase I+Hind III双酶切除CMV启动子,将奶牛乳腺特异性表达β-乳球蛋白基因(BLG)启动子同源重组替换到Ase I和Hind III酶切位点,构建奶牛溶菌酶基因(Lyz)乳腺特异性表达质粒pBLG-EGFP-N1-Lyz,采用脂质体法转染奶牛乳腺上皮细胞(BMEC)、人肾脏上皮细胞(HEK293T),荧光显微镜检测转染细胞中绿色荧光蛋白的表达情况。结果表明,重组表达质粒pBLG-EGFP-N1-Lyz测序结果与目的片段长度相符,转染至BMEC细胞和HEK293T细胞,在奶牛乳腺上皮细胞观察到绿色荧光, HEK293T细胞未观察到绿色荧光,奶牛Lyz基因乳腺特异性表达质粒构建成功。 相似文献
8.
通过构建猪核转录因子C/EBPβ编码区真核表达体pEGFP-N1-C/EBPβ,将猪C/EBPβ异位表达于小鼠成肌细胞C2C12细胞中,为进一步研究C/EBPβ在猪脂肪发育中的调控机制奠定基础。本试验利用RT-PCR扩增C/EBPβ编码区序列并测序,提交GenBank;并将其克隆至真核表达载体pEGFP-N1,通过双酶切和测序鉴定重组质粒。将重组表达体pEGFP-N1-C/EBPβ导入C2C12细胞,荧光显微镜下观察C/EBPβ在细胞中的定位,半定量RT-PCR和Western blot检测C/EBPβ在细胞中的表达情况。本试验成功克隆测序了猪C/EBPβ基因编码区序列,并首次上传到GenBank;成功构建猪C/EBPβ真核表达体pEGFP-N1-C/EBPβ,并将其异位表达。结果表明:猪C/EBPβ在脂肪组织中表达量丰富,心肌和背最长肌表达微量,并且正确插入真核表达载体pEGFP-N1,荧光显微镜下观察重组体组主要集中在细胞核;而C/EBPβ基因和蛋白在转染重组体C2C12细胞中均有表达。本研究为提高猪肉肌内脂肪含量方面的研究提供新的思路。 相似文献
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《畜牧兽医学报》2015,(7)
本研究旨在筛选出关岭牛MyoDI基因启动子上的转录因子结合位点。根据GenBank已公布的牛MyoDI基因的启动子序列,设计特异性PCR引物,扩增贵州关岭牛MyoDI基因的启动子区,构建重组克隆载体pUCM-TMyoDI-pro,并对阳性质粒进行测序鉴定。再利用筛选试验和生物信息学分析筛选出关岭牛MyoDI基因启动子上的转录因子结合位点。结果,筛选出关岭牛MyoDI基因启动子上含有的转录因子结合位点有SATB1、Xbp、MEF2、Pax-3、Pbx1、PPAR、TFⅡD、COUP-TF、Gfi-1、HNF-1、HOX4C、NRF2(ARE)、MEF1、RXR、SMUC、Snail、MyoD、VDR。结合在线软件分析和文献,最终筛选出关岭牛MyoDI基因启动子上含有MyoD、TFIID、Pax3、MEF1、VDR和MEF2转录因子结合位点,这些转录因子对启动子活性起着重要的调控作用。结果显示,关岭牛MyoDI基因启动子上含有MyoD、TFIID、Pax3、MEF1、VDR和MEF2转录因子结合位点。 相似文献
10.
试验旨在构建陆川猪G蛋白偶联受体1（G protein-coupled receptor 1，GPR1）基因真核表达载体，并对其组织表达谱进行分析。采用RT-PCR技术从10周龄陆川猪皮下脂肪组织中扩增出GPR1基因CDS区后，使用常规分子克隆手段构建含GPR1基因片段的真核表达载体pEGFP-N1-GPR1，利用双酶切和测序对重组质粒pEGFP-N1-GPR1进行鉴定，并以脂质体法将重组质粒转染3T3-L1细胞24 h后观察细胞荧光表达情况。收集所转染3T3-L1细胞并提取其总RNA，实时荧光定量PCR进一步检测GPR1真核表达载体表达情况；提取6头10周龄陆川猪心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、背最长肌、皮下脂肪总RNA，实时荧光定量PCR检测GPR1基因mRNA在陆川猪各组织中的表达量。结果表明，陆川猪GPR1基因CDS全长1 068 bp，成功将其连接至pEGFP-N1真核表达载体，重组表达载体pEGFP-N1-GPR1质粒和空载pEGFP-N1质粒所转染3T3-L1细胞均能表现出绿色荧光，且空白对照组并未表现出绿色荧光。实时荧光定量PCR结果证实，GPR1基因在重组质粒试验组的表达量极显著高于空载质粒组（P<0.01）。GPR1基因在10周龄陆川猪肝脏中表达量最高，在心脏、脾脏、肺脏、肾脏、皮下脂肪中均有表达，在背最长肌中几乎不表达。本试验成功构建了真核表达载体pEGFP-N1-GPR1，并获得了GPR1基因组织表达谱，为进一步研究GPR1基因对陆川猪脂肪沉积的影响提供参考。 相似文献
11.
《中国兽医学报》2014,(10)
本研究采用SOE-PCR技术,分别获得了CTCF因子结合序列的突变和缺失的序列,构建2个重组质粒pEGFP-N1/1554M和pEGFP-N1/1549。质粒pEGFP-N1/1554M由CTCF因子的结合序列CCCTC突变为TAAGT后的序列替换pEGFP-N1的CMV启动子构建而成;质粒pEGFP-N1/1549由CTCF因子结合序列CCCTC缺失后序列(长1 549bp)替换pEGFP-N1的CMV启动子构建而成。用重组质粒分别转染牛乳腺上皮细胞(BMEC),经筛选获得稳定的单克隆细胞,测定荧光强度并与对照组pEGFP-N1/1554(未缺失)比较荧光强度。结果表明,质粒pEGFP-N1/1554M的启动子活性显著强于对照组(P<0.01),质粒pEGFP-N1/1549的启动子活性显著强于对照组(P<0.01);即CTCF因子结合位点突变和缺失后,bLTF基因启动子活性都显著增强。 相似文献
12.
旨在构建PLCζ真核表达载体,初步研究其在体细胞系中的表达特性。本研究用PCR技术扩增出PLCζ基因片段,克隆至载体pEGFP-N1,鉴定无误后,将构建了重组质粒pEGFP-N1-PLCζ转染293T细胞和绵羊成纤维细胞,在倒置荧光显微镜和激光扫描共聚焦显微镜下观察重组质粒在细胞中的表达和分布。经酶切与测序证明,本试验成功的构建了pEGFP-N1-PLCζ真核表达载体,并且成功与绿色荧光蛋白融合表达。本试验实现了pEGFP-N1-PLCζ在绵羊胎儿成纤维细胞中的表达,这将有利于进一步通过核移植来研究其重组蛋白对卵母细胞的激活作用。 相似文献
13.
《畜牧与兽医》2015,(1):76-81
为了获得稳定表达猪skMLCK基因的小鼠成肌细胞C2C12细胞株,将猪skMLCK基因cDNA序列T-A克隆至pMD-18T载体;重组质粒经双酶切后,定向克隆至真核表达载体,获得表达重组质粒pEGFP-N1-skMLCK;经脂质体介导,重组质粒稳定转染入C2C12细胞中;通过实时定量PCR方法检测skMLCK基因的表达水平,以及其他相关基因的表达情况。结果:获得了稳定表达猪skMLCK基因的C2C12细胞株;连续培养30d后,用实时定量PCR方法检测到skMLCK基因高表达,同时发现CFL2b和MEF2C基因表达下调。试验表明稳定表达猪skMLCK基因的小鼠成肌细胞系构建成功,为猪skMLCK基因功能的进一步研究提供了前期工作基础。 相似文献
14.
利用RT-PCR技术扩增获得了长度约640bp的口蹄疫缡毒目的基因，回收片段后与pMD18-T载体进行连接，测序结果表明获得了口蹄疫病毒3C基因。将重组质粒pMD18-3C与表达载体pEGFP-N1分别用BarnH I＋XhoI双酶切后，进行定向亚克隆，对重组表达质粒pEGFP-3C进行PCR、酶切鉴定及DNA测序，结果表明重组表达质粒所含的3C基时读码框正确。用pEGFP-3C转染BHK-21细胞，荧光显示目的基因EGFP发出绿色荧光；对3C转录的mRNA进行RT-PCR鉴定，证实3C基因在BHK-21细胞中得到了表达。 相似文献
15.
应用分子生物学方法、荧光显微镜和实时荧光定量PCR技术,对cripto基因进行克隆、真核表达载体的构建,探讨cripto对C2C12细胞生长增殖的影响和肌细胞分化相关基因MyoD、MyoG、P21、MHC的表达变化。结果显示,phiC31-cripto真核表达载体构建成功,荧光显微镜下可见转染phiC31载体和cripto基因共转染的C2C12细胞表达强烈的绿色荧光,且对细胞的生长增殖无显著性影响;Q-PCR检测MyoD、MyoG、P21、MHC结果证实,猪cripto可以促进细胞分化因子MyoD、MyoG、P21、MHC的表达。结果表明,本试验成功地构建了C2C12-phiC31-cripto过表达细胞系,Q-PCR结果分析发现cripto基因可以促进肌肉分化,为进一步探索cripto基因在肌肉分化中的分子机制提供理论依据。 相似文献
16.
试验旨在构建陆川猪G蛋白偶联受体1(G protein-coupled receptor 1,GPR1)基因真核表达载体,并对其组织表达谱进行分析。采用RT-PCR技术从10周龄陆川猪皮下脂肪组织中扩增出GPR1基因CDS区后,使用常规分子克隆手段构建含GPR1基因片段的真核表达载体pEGFP-N1-GPR1,利用双酶切和测序对重组质粒pEGFPN1-GPR1进行鉴定,并以脂质体法将重组质粒转染3T3-L1细胞24h后观察细胞荧光表达情况。收集所转染3T3-L1细胞并提取其总RNA,实时荧光定量PCR进一步检测GPR1真核表达载体表达情况;提取6头10周龄陆川猪心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、背最长肌、皮下脂肪总RNA,实时荧光定量PCR检测GPR1基因mRNA在陆川猪各组织中的表达量。结果表明,陆川猪GPR1基因CDS全长1 068bp,成功将其连接至pEGFP-N1真核表达载体,重组表达载体pEGFP-N1-GPR1质粒和空载pEGFP-N1质粒所转染3T3-L1细胞均能表现出绿色荧光,且空白对照组并未表现出绿色荧光。实时荧光定量PCR结果证实,GPR1基因在重组质粒试验组的表达量极显著高于空载质粒组(P0.01)。GPR1基因在10周龄陆川猪肝脏中表达量最高,在心脏、脾脏、肺脏、肾脏、皮下脂肪中均有表达,在背最长肌中几乎不表达。本试验成功构建了真核表达载体pEGFP-N1-GPR1,并获得了GPR1基因组织表达谱,为进一步研究GPR1基因对陆川猪脂肪沉积的影响提供参考。 相似文献
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绵羊高硫角蛋白启动子表达活性研究 总被引：1，自引：1，他引：0
角蛋白是羊毛主要结构蛋白,为了筛选在绵羊毛囊中具有高表达活性高硫角蛋白的内源启动子,本研究以绵羊基因组为模板,克隆得到高硫角蛋白基因启动子B2C,将B2C与去除CMV启动子的pAcGFP1-N1载体连接,构建了重组真核表达载体。采用阳离子脂质体法转染传代培养的绵羊成纤维细胞和去除透明带的小鼠4细胞期胚,分析其表达活性。结果表明,转染后48 h,在蓝光激发条件下可以检测到绵羊成纤维细胞核内及核周围绿色荧光蛋白的高表达,转染72 h后,在核内表达减弱,而细胞质内表达增加;此外,虽然利用病毒启动子构建的GFP表达载体能够在小鼠的早期胚胎细胞中表达,但由B2C启动子与GFP构建的表达载体转染小鼠早期胚胎后,未观察到绿色荧光,表明B2C启动子在绵羊成纤维细胞中具有表达活性,但不能在小鼠早期胚胎中表达。 相似文献
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《中国兽医学报》2017,(7):1316-1321
通过比对人、鼠、兔和牛的Nanog启动子保守区设计引物,PCR扩增绵羊Nanog基因启动子序列并分析其调控位点。将其连接到去掉自身CMV启动子的pAcGFP1-N1载体上,构建一个由Nanog启动子带动的真核表达载体(SNanog-pAcGFP1-N1),即构建一个能由该启动子序列带动并产生绿色荧光蛋白(GFP)的真核表达载体,并用脂质体法转染入终末分化细胞(小鼠成纤维细胞和绵羊成纤维细胞)、胚胎干细胞和小鼠胚胎,检测其表达活性。结果显示:成功克隆出1 836bp Nanog启动子序列,通过分析发现该序列含有SP1结合位点、CAAT框、TATA框等功能区;当转染SNanog-pAcGFP1-N1重组质粒后,小鼠胚胎和小鼠胚胎干细胞中能检测到绿色荧光,且在转染72h后达到最大荧光强度,而在小鼠成纤维细胞和绵羊成纤维细胞中不能观察到GFP。结果表明:本试验成功克隆获得绵羊Nanog启动子,所构建的真核表达载体具有在多能干细胞中特异性表达活性。 相似文献
19.
旨在检测p21基因在水牛卵母细胞体外成熟过程中的表达变化,并克隆摩拉水牛p21基因CDs序列,构建真核表达载体。收集体外成熟培养不同时期(0、6、12、24h)和不同形态[有第1极体(first polar body,PB1)PB1和无PB1]的水牛卵母细胞,通过RT-qPCR检测其p21mRNA相对表达量。同时利用RTPCR技术从摩拉水牛卵巢颗粒细胞中扩增出p21基因编码序列,插入pEGFP-N1真核表达载体中,构建出重组质粒。将重组质粒pEGFP-N1-p21转染水牛颗粒细胞,并于培养24h和48h后观察转染细胞的荧光表达情况。收集转染48h后的颗粒细胞,通过RT-qPCR检测p21mRNA相对表达量。结果显示,成熟培养6h的卵母细胞p21mRNA表达量显著高于成熟培养0、12、24h的表达量(P0.05),有PB1的卵母细胞中p21mRNA的表达量显著高于无PB1的卵母细胞(P0.05);重组质粒pEGFP-N1-p21转染颗粒细胞后,有绿色荧光蛋白表达,且与转染pEGFP-N1和空白组相比,pEGFP-N1-p21转染组的p21mRNA表达量显著升高。结果表明,在体外成熟培养过程中均能检测到水牛卵母细胞p21mRNA表达量,成功构建了摩拉水牛p21基因真核表达载体,为下一步研究p21基因在水牛卵母细胞成熟和胚胎发育过程中的功能和调控奠定了基础。 相似文献
20.
本试验旨在构建带有增强型绿色荧光蛋白报告基因EGFP及目的基因泛素化调节因子2(Smurf2)的真核表达载体pEGFP-N3-Smurf2,并转染小鼠肾小管上皮细胞检测其表达情况。用RT-PCR法扩增小鼠肾小管上皮细胞Smurf2的CDS区,构建克隆载体pEASY-Zero-Smurf2和真核表达载体pEGFP-N3-Smurf2,酶切并测序鉴定。运用脂质体转染法将pEGFP-N3-Smurf2真核表达载体转染小鼠肾小管上皮细胞,实时荧光定量PCR、免疫印迹检测Smurf2的表达。PCR结果显示扩增出Smurf2基因片段大小约为2247 bp;重组质粒pEGFP-N3-Smurf2的酶切鉴定及测序结果均表明Smurf2基因成功克隆到真核表达载体中;脂质体转染后检测结果显示,转染pEGFP-N3-Smurf2表达载体的肾小管上皮细胞中Smurf2基因mRNA表达量升高且EGFP-Smurf2重组蛋白有表达。本试验成功构建了含有增强型绿色荧光蛋白标记的Smurf2真核表达质粒,转染后能明显提高细胞内Smurf2的表达,为研究Smurf2基因的功能奠定了基础。 相似文献