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根据大肠杆菌的密码子偏好性,人工设计并合成了3条抗菌肽Cecropin P1基因寡核苷酸片段,通过PCR扩增得到抗菌肽Cecropin P1基因,将此基因克隆到原核表达载体pMAL-p2X中,然后将重组质粒pMAL-p2X-Cecropin P1转化E.coliTB1,经IPTG诱导进行融合表达,以Amylose Resin亲和层析纯化。通过SDS-PAGE分析,融合蛋白MBP-Cecropin P1表达与纯化成功。抗菌肽Cecropin P1基因的成功表达为进一步研究其抗菌活性、抗菌机理及应用研究打下基础。 相似文献
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为使抗菌肽Cecropin D在巴斯德毕赤酵母中高效表达,本研究根据Cecropin D全基因序列和毕赤酵母的偏嗜性设计合成4条寡聚西核苷酸,SOEing-PCR技术法合成Cecropin D基因序列,并克隆至酵母表达载体pGAPZαA中,构建重组表达质粒,将其线性化后电击转化毕赤酵母菌株SMD1168,经高浓度博莱霉素筛选,获得高拷贝转化子,菌液PCR鉴定表明Cecropin D基因已整合到酵母基因组中.在GAP强启动子调控下,重组Cecropin D高效分泌表达,产物耐高温耐酸碱,并对部分革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有抑菌效果,对E.coliDH5 α和S.aureus Cowan I株的MIC值分别为2.17 μg/mL和4.55 μg/mL. 相似文献
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为了利用组成型表达方法在Pichia pastoris SMD1168中表达抗菌肽Cecropin AD,利用化学方法合成编码抗菌肽Cecropin AD的基因片段SH,将基因片段SH插入到载体pGAPZa-A中命名为pGAPZa-ASH,将pGAPZa-ASH电转至Pichia pastoris SMD1168中,Zecion抗性筛选阳性重组子。用Tricine-SDS-PAGE分析表达状况,琼脂扩散法检测蛋白的抑菌活性。结果表明:在3.0ku处有目的条带,并且表达产物抗菌肽Cecropin AD有生物活性。研究利用组成型表达方法在毕赤酵母菌株成功表达了抗菌肽Cecropin AD。组成型表达方法在本研究中成功的应用,为以后的实验研究奠定了理论基础。 相似文献
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根据在家蚕品系菁松和菁松近等基因系添食家蚕浓核病病毒（BmDNV）前后差异表达的抗菌肽Cecropin D,构建重组表达载体pET-41b-CecD,将测序正确的载体转化到E.coli BL21菌株中进行诱导表达,并对诱导条件进行优化。诱导产物用蛋白质印迹（western blot）进行验证。可溶性分析发现谷胱甘肽硫转移酶（GST）融合抗菌肽部分可溶,部分在表达过程中形成包涵体。GST亲和层析纯化后,分别检测重组抗菌肽的抗菌活性,结果表明：纯化后的重组抗菌肽可以很好地抑制并杀灭细菌,其效果与抗生素卡那霉素相似。 相似文献
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昆虫抗真菌肽Thanatin-CAD双价基因的合成、克隆及其表达 总被引：7，自引：3，他引：4
为促进昆虫抗菌肽基因在转基因抗病育种和生物工程制药的应用,通过设计嵌合引物结合分段PCR的方法将抗真菌肽Thanatin基因与Cecropin AD基因(CAD基因)融合拼接为Thanatin-CAD双价基因,采用T-A克隆法将其克隆至pGEM-T Easy载体,进行测序,结果证实与预期设计的完全一致;然后再将其亚克隆至表达载体pET-21d中,用IPTG诱导含重组表达质粒的菌株,对表达产物进行生物活性测定,初步结果显示Thanatin-CAD双价基因的融合表达产物对受试细菌无抑菌活性,但对部分病原真菌有较强的抑菌作用。 相似文献
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基因工程抗菌肽表达条件的优化及生物活性试验 总被引：1，自引：1，他引：0
探讨表达条件对重组抗菌肽表达量和抗菌活性的影响.选用SMD1168毕赤酵母菌株表达cecropinB及其串联体基因和cecA-mag(cecropin A前8个碱基和magainin的第9个碱基)的3个突变体基因抗菌肽.对6种重组酵母菌的摇瓶发酵条件,如pH、发酵温度、甲醇的添加量等进行了优化,结果优化后的表达条件可提高重组抗菌肽的表达量和抗菌活性.并从抑菌试验、酸碱稳定性试验、热稳定性试验、体外稳定性试验探讨了其生物学活性. 相似文献
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目的:通过原核表达科尔沁牛防御素BNBD5获得纯化产物,研究其对牛乳腺炎致病菌的抑菌活性。方法:从牛外周血中分离中性粒细胞,提取牛总RNA,将克隆的牛抗菌肽BNBD5基因连接到原核表达载体pET-30a中,经IPTG诱导原核表达,SDS-PAGE鉴定表达结果,并通过大肠杆菌、金黄色葡萄球菌验证抑菌生物活性。结果:成功构建了pET-30a-BNBD5重组载体,经IPTG诱导,pET-30aBNBD5融合表达产物的相对分子质量约为10 ku,与预期的多肽分子质量大小相符,证实已得到重组表达产物,通过抑菌试验可知其对于大肠杆菌、金黄色葡萄球菌均有抑菌性。结论:获得科尔沁牛防御素BNBD5基因体外表达产物,其对于大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有抑制作用。 相似文献
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利用毕赤酵母表达系统表达新型家蝇抗菌肽MDAP-2基因(Musca domestica antimicrobial peptide,MDAP-2),为其作为新型抗菌物质应用于临床提供实验依据。根据已有的MDAP-2的氨基酸序列,采用PCR技术扩增获得MDAP-2基因,构建真核重组表达质粒pPIC9K-MDAP-2,将线性化的重组质粒电击转入毕赤酵母(P.pastoris)感受态GS115细胞内,将PCR鉴定为阳性的重组酵母菌进行甲醇诱导表达,并采用Tricine-SDS-PGAE检测表达产物的大小,经镍柱亲和层析纯化获得纯度较高的重组蛋白,采用管碟法检测重组蛋白的生物学活性。结果显示,重组质粒pPIC9K-MDAP-2获得高效表达,蛋白分子量为7.8 kD,管碟法检测重组蛋白对大肠杆菌与沙门氏菌均具有体外抑菌活性。MDAP-2基因的成功表达为进一步研究表达产物的生物学及免疫学活性奠定基础。 相似文献
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动物抗菌肽天蚕素(cecropin)因具有抗菌谱广、活性较强、不易产生耐药性等特点而成为新型抗菌剂开发的材料。为了探讨通过原核表达的途径高效获取天然cecropin,以重叠PCR方法分别人工合成家蚕(Bombyx mori)和果蝇(Drosophilamelanogaster)的抗菌肽cecropin B基因(CecB2)并克隆至T载体,测序确认后分别克隆至pET-32a载体,转化至E.coli BL21(DE3)宿主菌进行表达。通过SDS-PAGE和Western blotting检测到2种目的蛋白均得到表达,但表达量存在差异,Bradford法测定纯化后的BmCecB2融合蛋白和DmCecB2融合蛋白的质量浓度分别为0.6、2.0 mg/mL。经Ni-NTA亲和层析纯化和透析处理后的2种产物的抗菌活性存在明显差异:DmCecB2和BmCecB2的质量浓度为10 mg/mL时,对E.coli DH5α的抑菌圈直径分别为15、8 mm左右,最小抑菌浓度分别为0.05、0.10 mg/mL。以上结果说明DmCecbB2的原核表达效率及表达产物的抑菌活性均明显高于BmCecB2。用生物信息学方法分析家蚕和果蝇的CecB2蛋白在结构上存在差异,这可能是导致2种产物活性不同的主要原因。 相似文献
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抗菌肽cecropin P1的研究进展 总被引：1，自引：0，他引：1
cecropin P1是一种哺乳动物抗菌肽,对G-菌及一些G 菌有抑制杀灭作用.本文就cecropin P1的结构、抗菌机理、抗菌活性、基因工程及其应用前景做一综述. 相似文献
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前期采用差减杂交的方法筛选到新型欧洲鳗鲡抗菌肽elecilin,其基因全长为477 bp,编码159个氨基酸,理论分子量约17.4 kDa。为了获得具活性的大量表达的抗菌肽,本研究利用毕赤酵母表达了elecilin。首先将elecilin基因克隆至酵母分泌表达载体pPICZaA,构建了重组分泌表达质粒pPICZaA-elecilin,电击转化毕赤酵母X-33。经Zeocin筛选和PCR鉴定,获得重组酵母菌,通过甲醇诱导,SDS-PAGE和Western blot鉴定,证实诱导后的培养基中存在与预期分子量大小相一致的蛋白,能被His-tag单克隆抗体识别,表明利用酵母成功表达了欧洲鳗鲡抗菌肽elecilin。这为进一步研究该抗菌肽的功能及作为饲料添加剂的应用奠定了基础。 相似文献
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构建表达抗菌肽Cecropin AD蛋白的真核重组表达质粒pGAPZα-A-CAD,并转化酵母菌Pichia pastoris X-33,Zeocin抗性筛选阳性重组子,通过PCR鉴定、Tricine-SDS-PAGE分析和琼脂孔穴扩散法筛选获得抗菌肽CAD组成型表达菌株,并采用pH-溶氧监控策略进行工程菌Pichia pastoris X-33/pGAPZα-A-CAD的50 L中试发酵研究。结果表明,本实验成功实现了抗菌肽CAD在毕赤酵母Pichiapastoris X-33中的组成型表达pGAPZα-A,Tricine-SDS-PAGE分析显示在4.0 kDa处有明显的目的条带,工程菌经50 L发酵罐培养48 h后收获的上清液,100℃热处理10 min后,对金黄色葡萄球菌ATCC25923、大肠杆菌ATCC25922等均有明显的抑杀作用。抗菌肽的组成型表达方法在本研究中得到了成功应用,中试研究为以后的规模化生产和应用奠定了基础。 相似文献
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【目的】 天蚕素抗菌肽是一种商品化的阳离子抗菌肽,在水貂体内的研究较少。试验旨在探究抗菌肽对育成期母貂脏器系数、血清及空肠免疫指标、肠组织形态的影响。【方法】 选取65日龄体重相近的短毛黑母貂60只,随机分为6组,每组10个重复,每个重复1只,单笼饲养。各组饲粮中分别添加0(对照组)、100、200、300、400和500 mg/kg抗菌肽,预试期1周,正试期8周。饲养试验结束后,每组取6只水貂进行心脏采血,采集内脏器官、十二指肠及空肠样品,并测定血清及空肠免疫指标、肠道组织形态。【结果】 与对照组相比,100、300和400 mg/kg抗菌肽组脾脏指数显著升高(P < 0.05);各试验组补体C3(C3)、补体C4(C4)和免疫球蛋白M(IgM)含量均显著升高,除200 mg/kg抗菌肽组外的所有试验组免疫球蛋白A(IgA)和免疫球蛋白G(IgG)含量均显著升高(P < 0.05);各试验组肿瘤坏死因子(TNF-α)含量均显著降低,100、200、300 mg/kg抗菌肽组分泌型免疫球蛋白(sIgA)、γ干扰素(IFN-γ)及白细胞介素-10(IL-10)含量均显著升高(P < 0.05);各试验组十二指肠和空肠绒毛高度均显著升高,且200 mg/kg抗菌肽组十二指肠隐窝深度显著低于400和500 mg/kg抗菌肽组,而绒毛高度/隐窝深度(V/C)显著高于对照组、400和500 mg/kg组(P < 0.05);200、300和400 mg/kg抗菌肽组空肠V/C均显著升高(P < 0.05)。【结论】 饲粮中添加天蚕素抗菌肽可促进育成期母貂免疫器官发育,提高机体免疫力,改善肠组织形态,建议抗菌肽添加水平为100~200 mg/kg。 相似文献
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将猪β-防御素-2基因(pBD-2)片段正确连接到pET32a载体上,从而得到稳定表达pBD-2的大肠杆菌表达株。根据已报道的pBD-2基因序列,按大肠杆菌密码子优化原则合成了5条pBD-2基因片段,通过重叠延伸PCR(SOE PCR)方法将这5段延伸成完整的pBD-2基因序列,将该基因定向插入原核表达质粒pET32a的多克隆位点上,成功地在大肠杆菌BL21(DE3)中表达出TrxA-pBD2融合蛋白。结果显示,表达的融合蛋白用肠激酶切掉TrxA后做琼脂孔穴扩散法检测,pBD-2对金黄色葡萄球菌有较好的抑菌活性,表明试验获得表达pBD-2的大肠杆菌菌株。 相似文献
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JIANG Xue-bin CHEN Jia-wei YANG Jun LIU Shun-zhi XIAO An-ji LU Zhi-peng CHU Pin-pin HUANG Chao-yuan CAI Hai-ming MA Miao-peng ZHANG Ling-hua 《中国畜牧兽医》2016,43(3):644-649
In order to produce antimicrobial peptide PBD-1 with bioactivity in Pichia pastoris,according to published amino acid sequence of PBD-1 and the partiality codon of yeast,the PBD-1 gene was amplified by SOE-PCR and cloned into pPIC9K to construct a recombinant expression vector pPIC9K-PBD-1.The recombinant vector was linearized by SacⅠ,and then transformed into SMD1168 by electroporation.Positive yeast expression strain was obtained by PCR.The antimicrobial peptide PBD-1 (approximately 4.5 ku) was expressed by methanol induction.Antibacterial activity assay showed that the antimicrobial peptide PBD-1 had better antibacterial activity against E.coli,S.aureus and B.subtilis. 相似文献