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本试验旨在实现猪β防御素1 (poricine-β-defensin 1,PBD-1)在毕赤酵母中的表达,获得有抗菌活性的抗菌肽PBD-1。根据PBD-1的氨基酸序列和酵母密码子偏好性,设计优化其核苷酸序列,利用SOE-PCR技术获得PBD-1基因序列,克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K中,构建重组质粒pPIC9K-PBD-1,经SacⅠ线性化后转入毕赤酵母SMD1168中。PCR筛选得到阳性酵母表达菌株,经甲醇诱导后得到分子质量约4.5 ku的抗菌肽PBD-1。抗菌特性研究结果表明,表达产物抗菌肽PBD-1对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及枯草芽孢杆菌均有较好的抑制效果。 相似文献
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本试验根据已公布的IBV株S1基因序列及pPIC9K表达载体序列，去掉由18个氨基酸构成的信号肽后，设计一对IBV S1基因表达片段的PCR引物，利用RT—PCR扩增得到了IBV四川分离株的S1基因片段，将该片段克隆到PMD18-T载体上，通过对所得到的重组质粒进行酶切分析、菌落PCR鉴定，证明得到了含有目的基因片段的阳性重组质粒，测序分析片段长为1566bp，已经成功切除了由18个氨基酸构成的信号肽序列。将该基因亚克隆到毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K的SnaBⅠ和NotⅠ酶切位点，并通过菌落PCR、双酶切鉴定了该重组质粒的正确性，IBV S1基因毕赤酵母表达载体的构建为进一步利用毕赤酵母表达IBV S1蛋白提供了基础材料，并对表达产物的免疫原性和禽传染性支气管炎基因亚单位疫苗及特异性诊断抗原的研究打下了基础。 相似文献
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利用毕赤酵母表达系统表达新型家蝇抗菌肽MDAP-2基因(Musca domestica antimicrobial peptide,MDAP-2),为其作为新型抗菌物质应用于临床提供实验依据。根据已有的MDAP-2的氨基酸序列,采用PCR技术扩增获得MDAP-2基因,构建真核重组表达质粒pPIC9K-MDAP-2,将线性化的重组质粒电击转入毕赤酵母(P.pastoris)感受态GS115细胞内,将PCR鉴定为阳性的重组酵母菌进行甲醇诱导表达,并采用Tricine-SDS-PGAE检测表达产物的大小,经镍柱亲和层析纯化获得纯度较高的重组蛋白,采用管碟法检测重组蛋白的生物学活性。结果显示,重组质粒pPIC9K-MDAP-2获得高效表达,蛋白分子量为7.8 kD,管碟法检测重组蛋白对大肠杆菌与沙门氏菌均具有体外抑菌活性。MDAP-2基因的成功表达为进一步研究表达产物的生物学及免疫学活性奠定基础。 相似文献
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将牛病毒性腹泻病毒(BVDV)河北分离株HB-bd毒株E2基因去除跨膜区获得sE2基因,将sE2基因克隆入巴斯德毕赤酵母(P.Pastoris)分泌型表达载体pPIC9K中,筛选培养后提取阳性重组质粒,经酶切和PCR鉴定,命名为pPIC9K-sE2.重组质粒pPIC9K-sE2经Sal Ⅰ酶切线性化,电穿孔导入P.Pastoris GS115基因进行整合,使外源基因sE2稳定地整合到P.Pastoris染色体中,G418筛选得到阳性高拷贝转化子GS115-pPIC9K-sE2.经甲醇诱导表达后,sE2融合蛋白获得了表达,表达产物经SDS-PAGE、Western-blot和Dot-ELISA分析,确定其表达的sE2融合蛋白相对分子质量大小为37 000,且具有天然蛋白的抗原特异性.免疫原性研究证明P.Pastoris表达的sE2蛋白能刺激动物产生特异抗体. 相似文献
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在毕赤酵母真核表达系统中表达柔嫩艾美耳球虫真核起始因子3d(Emeria tenella eukaryotic initiation factor 3d,EteIF3d)基因,并获得具有天然构象的活性蛋白。将EteIF3d基因克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9k上,将构建正确的重组质粒通过电激转化入酵母细胞GS115,用组氨酸缺陷培养基和G418分别进行筛选,获得含重组质粒的酵母表达细胞。在含1%甲醇的BMMY培养基中诱导培养,收集1~3 d的表达上清。表达产物进行SDS-PAGE检测,并用Western blot进行免疫学分析。结果表明,本研究成功构建了重组质粒pPIC9k-EteIF3d,并成功表达该蛋白,且该蛋白能与兔抗EteIF3d血清特异性结合,具有良好的抗原性。EteIF3d基因可在真核表达系统毕赤酵母中表达,且获得蛋白具有抗原性,从而为进一步研究该蛋白的结构和功能奠定了基础。 相似文献
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将牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhoea-mucosal disease virus,BVDV)河北分离株HB-bd毒株E2基因去除跨膜区获得sE2基因,将sE2基因克隆入巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)分泌型表达载体pPIC9K中,筛选培养后提取阳性重组质粒,经酶切和PCR鉴定,命名为pPIC9K-sE2。重组质粒pPIC9K-sE2经SalⅠ酶切后,电穿孔导入P.pastorisGS115基因进行整合,使外源基因sE2稳定地整合到P.pastoris染色体中,G418筛选得到阳性高拷贝转化子GS115-pPIC9K-sE2。经甲醇诱导表达后,sE2融合蛋白获得了表达,表达产物经SDS-PAGE、Western-blot和Dot-ELISA分析,确定其表达的sE2融合蛋白相对分子质量大小为37 000,且具有天然蛋白的抗原特异性。免疫活性研究证明,P.pastoris表达的sE2蛋白能刺激动物产生抗体。 相似文献
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为获得猪蛔虫抗菌肽Cecropin P2基因并研究其抗菌功能,根据CecropinP2成熟肽的编码基因,人工合成3条寡聚核苷酸片段,经PCR获取Cecropin P2基因序列,成功构建了重组表达质粒pPIC9 K-Cecropin P2-His6并转化毕赤酵母GS115感受态细胞。转化子经MD、MM以及G418筛选,1%甲醇诱导表达,利用Tris tricine-SDS-PAGE对表达产物进行检测。体外抑菌试验表明,获得的重组蛋白对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有较好的抑菌活性。本试验为抗菌肽的应用和新抗菌肽类药物的开发提供了必要的试验基础。 相似文献
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利用PCR技术，从含有牛朊蛋白（Prion protein，PrP）基因Prnp的开放阅读框的克隆质粒BoPrnp—T中扩增出约420bp的目的基因（PrP猢基因）。将PrP^27-30基因和载体pPIC9K分别用限制性核酸内切酶EcoRⅠ和NotⅠ进行双酶切，T4DNA连接酶作用后，转化至E．coli JM109中，构建重组表达载体pPIC9K-boPrP^27-30。pPIC9K-boPrP^27-30经限制性核酸内切酶SalⅠ线性化后电转至毕赤酵母GS115中，经G418筛选后得到高拷贝的重组菌株GS115／pPIC9K-boPrP^27-30。GS115／pPIC9K-boPrP^27-30经1．0％甲醇诱导后，表达产物用SDS-PAGE和Western blot分析，结果表明牛PrP^27-30基因在毕赤酵母细胞中获得表达，表达产物的分子量约为27Ku，能够被单克隆抗体SAF-70识别。 相似文献
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猪β防御素-2对猪链球菌感染小鼠的治疗效果评价 总被引：1，自引：1，他引：0
防御素是一种广泛分布于动植物中的阳离子小肽,是哺乳动物先天性免疫防御系统的重要成分,具有广谱抗菌、抗病毒和抗真菌活性。猪β防御素-2（porcine β-defensin-2,PBD-2）是猪表达的天然防御素之一,在体外具有良好的抗菌活性。本研究旨在评价PBD-2在动物体内对重要的人兽共患病原菌猪链球菌感染的治疗效果,为评估PBD-2成为治疗性药物的潜在价值提供依据。首先,在体外检测了PBD-2对猪链球菌临床分离菌株SC-19的杀菌活性,并且在鼠源巨噬细胞（RAW264.7）上检测了PBD-2的细胞毒性。随后,选取4~6周龄,体重在18~22 g的C57雌鼠,检测了PBD-2处理组和PBS对照组小鼠（n≥6）感染猪链球菌SC-19后的存活率、组织载菌量、炎性细胞因子水平和病理变化。结果表明,PBD-2（25~200 μg·mL-1）可显著地抑制猪链球菌SC-19生长（P<0.05）,且抑制作用随浓度升高而增强,同时,对RAW细胞无显著的毒性作用（P>0.05）。在体内,PBD-2处理能有效降低小鼠感染猪链球菌SC-19后的死亡率,并且显著降低小鼠感染细菌后的脑、肺、脾组织和血液中的细菌载量,以及血清中炎性细胞因子IL-6、IL-12和TNF-α的水平（P<0.05）。同时,PBD-2治疗也显著降低了小鼠感染细菌后肺和脾组织的病理变化程度（P<0.05）。这些结果说明,PBD-2在体外具有良好的抗猪链球菌的活性,无显著细胞毒性,同时,在小鼠体内对猪链球菌感染具有治疗效果,提示,PBD-2具有进一步开发为治疗性药物的潜力。 相似文献
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Defensin is a small cationic peptide widely distributed in animals and plants. It is an important component of the innate immune defense system of mammals. It has a broad spectrum of antibacterial, antiviral and antifungal activities. Porcine β-defensin-2 (PBD-2) is one of the natural defensins expressed in pigs and has good antibacterial activity in vitro. The purpose of this study is to evaluate the therapeutic effect of PBD-2 in the treatment of Streptococcus suis infection in animals and to provide more insights for evaluating the value of PBD-2 as a therapeutic drug. Firstly, the bactericidal activity of PBD-2 against S. suis clinical isolate SC-19 was measured in vitro, and the cytotoxicity of PBD-2 was tested on mouse-derived macrophages (RAW264.7). Subsequently, C57 female mice aged 4-6 weeks and weighing between 18-22 g infected with S. suis SC-19 were treated with PBD-2 or PBS (n ≥ 6). The survival rate of mice, and the bacteria loads, inflammatory cytokine levels, and pathological changes of tissues were determined. The results showed that PBD-2 (25-200 μg·mL-1) could significantly inhibit the growth of S. suis SC-19 in a concentration-dependent manner (P<0.05). At the same time, PBD-2 had no significant toxic effect on RAW cells (P>0.05). The in vivo study revealed that PBD-2 treatment could effectively reduce the mortality of mice infected with S. suis SC-19. At the same time, PBD-2 treatment significantly reduced bacteria loads in brain, lung, spleen and blood of mice, and decreased the levels of inflammatory cytokines IL-6, IL-12 and TNF-α in mouse sera (P<0.05). At the same time, PBD-2 treatment also significantly alleviated the degree of pathological damages in lung and spleen tissues of mice infected with bacteria (P<0.05). These results indicate that PBD-2 confers great resilience to S. suis in vitro without significant cytotoxicity, while it also exhibits a therapeutic effect on S. suis infection in mice, suggesting that the use of PBD-2 as a therapeutic drug and substitutes for antibiotics is of an excellent prospect. 相似文献
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试验以突破噬菌体裂解酶Lysep3应用瓶颈为切入点,采用酵母表达系统对其进行重组表达以期降低生产成本,同时初步探究其体外抗菌活性和安全性,以期为临床试验提供数据参考。根据毕赤酵母密码子偏爱性优化并合成Lysep3基因,将其连接至表达载体pPICZαA。经菌落PCR和测序验证后,将线性化重组载体pPICZαA-Lysep3电转化巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris X-33。重组酵母转化子经菌落PCR和摇瓶水平甲醇诱导重组蛋白初筛后,在5 L发酵罐中高密度发酵,发酵上清液经His-trap HPGE纯化柱纯化。通过抑菌试验和浊度试验进行rLysep3的抑菌活性分析,通过测定rLysep3对巨噬细胞RAW264.7细胞毒性和小鼠血红细胞溶血性进行rLysep3的安全性分析。结果显示,重组菌在5 L发酵罐中甲醇诱导120 h后Lysep3的表达量达749.2 mg/L。抑菌活性分析发现,rLysep3对肠炎沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、猪葡萄球菌及无乳链球菌均具有抑菌活性,且rLysep3可与EDTA联合作用使肠炎沙门氏菌菌落数下降1.6~1.7个数量级。此外,细胞毒性试验发现,rLysep3在1 024 μg/mL浓度下细胞存活率仍可达78.75%;溶血性分析显示,1 024 μg/mL浓度下溶血率仅为1.58%。上述结果证明,通过毕赤酵母表达系统实现了Lysep3的重组表达,rLysep3具有体外抑菌活性,且具低细胞毒性和低溶血性。从抗菌活性、产业化制备及安全性等方面初步显示出rLysep3具有开发为临床治疗禽肠炎沙门氏菌感染的新型抗菌药物的潜力。 相似文献
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从家蚕中提取总RNA,采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法,获得了家蚕Cecropin-D基因编码区的cDNA,扩增出家蚕抗茵肽Cecropin-D成熟肽基因片段,重组克隆入pMD18-Tvector载体,经DNA测序,该基因为186bp,编码62个氨基酸。用限制性内切酶切下目的基因,插入毕赤酵母表达载体pPIC9K中,构建真核表达栽体pPlC9K-CD。本实验的研究为获得超量表达的高活性表达抗菌肽Cecropin-D以及为研制具有抗菌活性的新型基因药物奠定了基础。 相似文献
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YU Jian-feng HE Sai JIN Ze-kai ZHOU Huan-qing DONG Xiao-min GONG Dao-qing GU Zhi-liang 《中国畜牧兽医》2016,43(11):2970-2975
The growth hormone（GH）regulated diverse functions of the target cells through binding its receptor and played important roles in the process of metabolism of the body's growth and development.In order to obtain high purity chicken growth hormone（cGH）with biological activity,the gene segment of the mature cGH with six histidine at the C terminus was cloned into the expression vector pPIC9K.The recombinant plasmid（pPIC9K-cGH）was transformed to Pichia pastoris（GS115）by electroporation to construct the recombinant Pichia pastoris（GS115-pPIC9K-cGH).The GS115-pPIC9K-cGH secreted the recombinant protein（cGH）whose molecular weight was about 25 ku induced by 1% methanol induction for 96 h.The purity of cGH attained at least 95% through using Ni affinity chromatography and polyacrylamide glucan gel chromatography to purify the recombinant protein.The results of Real-time quantitative-PCR showed that the purified cGH recombinant proteins could up-regulate its target gene insulin-like growth factor Ⅰ（IGF-Ⅰ）mRNA in chicken liver cancer cell（LMH).It certified that the recombinant cGH protein had biological activity.This study laid a foundation for research of the structure,function and application of cGH. 相似文献
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生长激素（growth hormone,GH）与受体结合调节靶细胞的功能在机体的生长发育及代谢过程中起着极其重要的作用。为获得高纯度具有生物学活性的鸡生长激素（chicken growth hormone,cGH）,试验将C端融合了6个组氨酸的cGH成熟片段基因序列克隆入毕赤酵母表达载体pPIC9K中,使用电转法将重组质粒导入毕赤酵母GS115,以1%的甲醇诱导重组菌（GS115-pPIC9K-cGH）96 h,表达大小约为25 ku的目的蛋白cGH,经Ni离子亲和层析和聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶层析获得95%以上的cGH重组蛋白。实时荧光定量检测结果表明,纯化的cGH重组蛋白可刺激鸡肝癌细胞LMH内的胰岛素样生长因子Ⅰ（insulin-like growth factor Ⅰ,IGF-Ⅰ）基因的mRNA表达上调,表明所发酵纯化的重组蛋白cGH具有生物学活性,这为其结构和功能的研究及生产应用奠定了基础。 相似文献
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为获得J亚群禽白血病病毒gp85蛋白,将gp85基因克隆至毕赤酵母表达载体pPIC9K,构建了pPIC9K-gp85表达载体。将鉴定正确的表达载体经Sal Ⅰ酶切线性化后电转化毕赤酵母宿主菌GS115,经MD及G418抗性平板筛选后挑取阳性克隆进行PCR鉴定,获得重组酵母菌株GS115/pPIC9K-gp85。对阳性重组菌进行诱导表达,表达产物经SDS-PAGE、Western blotting和Dot-ELISA分析,结果表明,gp85基因在毕赤酵母中获得分泌表达,表达产物与J亚群禽白血病病毒多克隆抗体有良好的反应活性,分泌表达量达40 mg/L。本研究为J亚群禽白血病病毒诊断方法的建立及gp85蛋白的深入研究奠定了基础。 相似文献
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中国鲎(Tachypleus tridentatus)基因工程抗菌肽的制备及其抗菌活性 总被引：3，自引：0，他引：3
从中国鲎血细胞RT-PCR扩增抗菌肽tachyplesins基因,经改造构建原核和真核表达载体pET-KRN、pPIC9-KRY,并分别在大肠杆菌DE3和毕赤酵母GSll5中诱导表达.用Tris-Tricine SDS-PAGE检测并进一步电洗脱纯化表达产物,经体外生物活性测定表明,表达产物KRN对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、伤寒沙门菌的抑菌环为25、22、25、16mm;MIC值为3.57、7.14、3.57、14.28mg/L.表达产物KRY对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、伤寒沙门菌和李氏杆菌的抑菌环为26、22、25、18、16mm;MIC值为1.57、3.14、1.57、6.28、6.28mg/L,对水霉的抑菌效果尤其显著,抑菌环达35mm. 相似文献
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前期采用差减杂交的方法筛选到新型欧洲鳗鲡抗菌肽elecilin,其基因全长为477 bp,编码159个氨基酸,理论分子量约17.4 kDa。为了获得具活性的大量表达的抗菌肽,本研究利用毕赤酵母表达了elecilin。首先将elecilin基因克隆至酵母分泌表达载体pPICZaA,构建了重组分泌表达质粒pPICZaA-elecilin,电击转化毕赤酵母X-33。经Zeocin筛选和PCR鉴定,获得重组酵母菌,通过甲醇诱导,SDS-PAGE和Western blot鉴定,证实诱导后的培养基中存在与预期分子量大小相一致的蛋白,能被His-tag单克隆抗体识别,表明利用酵母成功表达了欧洲鳗鲡抗菌肽elecilin。这为进一步研究该抗菌肽的功能及作为饲料添加剂的应用奠定了基础。 相似文献
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为了获得抗菌活性较强的抗菌肽，将蜂毒肽（Melittin）与贻贝素B （Mytilin-B）的核心功能序列杂合，以Melittin （3-14）和Mytilin-B （13-27）的成熟肽段作为模板序列，根据巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）偏好密码子，采用SOE方法合成杂合抗菌肽Mel-MytB（MEM）基因。改造后的基因克隆到pPICZα-A质粒，构建分泌型重组酵母表达载体pPICZα-A-MEM，而后经Sac Ⅰ酶切线性化后电转入毕赤酵母受体菌X-33。结果表明，在醇氧化酶（AOX）启动子调控下，分子质量约3.0 ku的Mel-MytB杂合抗菌肽获得表达，具有热稳定性和酸稳定性，煮沸40 min、pH 2.0~10.0范围内抑菌活性基本不变。抗菌特性研究结果表明，该表达产物具有广谱抗菌活性，其对大肠杆菌ATCC25922、金黄色葡萄球菌ATCC25923/ATCC6538、肠道沙门氏菌ATCC13076、鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028、副溶血弧菌ATCC17802、创伤弧菌ATCC27562、枯草芽孢杆菌ATCC6633的MIC值分别为5.1、2.2、2.0、4.6、7.6、9.4、13.2和59.4 μg/mL。因此，重组抗菌肽Mel-MytB在疾病防治和动物饲料添加剂等方面具备较好的应用前景。 相似文献
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【目的】 对猪黏膜保护因子——血红素加氧酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）基因进行克隆及原核表达，为研究高表达HO-1在肠黏膜损伤中的保护作用提供技术支持。【方法】 根据GenBank中公布的HO-1序列（登录号：NM_001004027.1），利用Primer Premier 6.0设计1对特异性引物，利用RT-PCR方法扩增HO-1基因片段，将其与pMD19-T克隆载体连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆进行PCR鉴定；将载体pNCMO2与重组载体pMD19-T-HO-1进行Sal Ⅰ和Kpn Ⅰ双酶切，使用T4 DNA连接酶连接，利用电击转化技术将重组表达载体pNCMO2-HO-1转入感受态短小芽孢杆菌，使用IPTG进行诱导表达，应用SDS-PAGE和Western blotting分析HO-1在短小芽孢杆菌中的融合表达情况。【结果】 猪HO-1基因全长897 bp，编码298个氨基酸。双酶切后在约5 200和897 bp处分别观察到pNCMO2载体片段和HO-1基因片段，证明成功构建基因表达载体pNCMO2-HO-1；电转后的双酶切结果表明，在相同的位置观察到pNCMO2和HO-1片段，证明重组表达载体pNCMO2-HO-1成功导入短小芽孢杆菌。SDS-PAGE和Western blotting鉴定结果发现，在36.5 ku处出现了明显的蛋白印迹，表明成功表达了HO-1的重组蛋白，且为胞外分泌。【结论】 本研究成功构建了HO-1的重组原核表达载体，pNCMO2-HO-1重组载体可以在短小芽孢杆菌中诱导表达。 相似文献