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猪生殖—呼吸道综合征病毒CH—1a株N基因的原核表达 总被引：3，自引：0，他引：3
将ＰＲＲＳＶＣＨ－１ａ株Ｎ基因用ＥｃｏＲＩ和ＰｓｔＩ双酶切从重组质粒ｐＵＣ１８－ＯＲＦ７切下后,插入到原核表达载体ｐＢＶ２２０的ＰＲ,ＰＬ启动子下游,得到重组表达质粒,ｐＢＶ２２０－ＯＲＦ７,转化了ｐＢＶ２２０－ＯＲＦ７的大肠杆菌ＪＭ８３经诱导培养后,用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测表达产物,结果表明ＰＲＲＳＶＣＨ－１ａ株的Ｎ基因在原核载体上得到高效表达,表达产物占菌体总蛋白的１５． 相似文献
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禽流感HA基因疫苗脂质体的制备及其理化性质 总被引：17，自引：1，他引：16
用改良的逆相蒸发法制备了Ｈ７亚型禽流感保护性抗原血凝素（ＨＡ）基因重组质粒ｐＳＶＨ７脂质体。电镜观察表明,该脂质体多呈球形的单层或多层结构,脂质体粒径分布均匀,粒径范围２０～７００ｎｍ,平均粒径１６３ｎｍ,主要粒径分布位于５０～２００ｎｍ（８４．８０％）。重组质粒ＤＮＡ在脂质体的制备过程中保持了稳定性,并能抵抗ＤＮＡ酶的水解破坏作用。吸收光谱表明,在２４８ｎｍ及２６８ｎｍ处脂质体有２个特征吸收峰,ＤＮＡ的存在不改变吸收峰的位置,但能增加吸收峰的强度。 相似文献
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将ＰＲＲＳＶＣＨ１ａ株Ｎ基因用ＥｃｏＲＩ和ＰｓｔＩ双酶切从重组质粒ｐＵＣ１８ＯＲＦ７切下后,插入到原核表达载体ｐＢＶ２２０的ＰＲ、ＰＬ启动子下游,得到重组表达质粒ｐＢＶ２２０ＯＲＦ７。转化了ｐＢＶ２２０ＯＲＦ７的大肠杆菌ＪＭ８３经诱导培养后,用ＳＤＳＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测表达产物。结果表明ＰＲＲＳＶＣＨ１ａ株的Ｎ基因在原核载体上得到高效表达,表达产物占菌体总蛋白的１５３％。表达蛋白可望成为有价值的ＰＲＲＳ诊断抗原。 相似文献
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组织型纤溶酶原激活剂基因在小鼠体内的表达 总被引：1，自引：0，他引：1
将组织型纤溶酶原激活剂（ｔ－ＰＡ）基因ｃＤＮＡ经多次亚克隆插入到真核表达载体ｐＳＶＬ的ＳＶ４０启动子和ｐｃＤＮＡ３的ＣＭＶ启动子下游,构建了重组质粒ｐＳＶＬ－ｔＰＡ和ｐｃＤＮＡ３－ｔＰＡ。分别将这２种重组质粒直接注射于小鼠骨骼肌,观察了ｔ－ＰＡ基因在小鼠体内的表达情况。体外凝血试验结果显示,注射重组质粒ＤＮＡ后,第５天凝血时间有所延长,第１５～２０天达到高峰,小鼠体外凝血时间平均延长７ｍｉｎ左右,延长时间与基因注射量呈明显的正相关。 相似文献
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用限制性内切ｃｏ ＲＩ将不含起始密码子的ｐｐ３８基因从重组转移载体质粒ｐＶＬ ｐｐ３８ Ｉ中切出，将致弱Ｉ型ＭＤＶ ｐｐ３８基因同源物的重组转移载体质粒ｐＶＬ ｐｐ３８与野生型杆状病毒（ＡｃＭＮＰＶ）以脂质体介导法共转染昆虫细胞系Ｓｆ９后，用单克隆抗体Ｈ１９介导的间接荧光抗体法筛选到能表达ＭＤＶ ｐｐ３８基因同源物的重组杆状病毒克隆。经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ试验，证实ｐｐ３８ｘ 相似文献
7.
禽流感病毒血凝素基因的克隆及其DNA疫苗的免疫原性 总被引：22，自引：3，他引：19
禽流感病毒（ＡＩＶ）的表面结构蛋白血凝素（ＨＡ）是其主要保护性抗原。本研究参考已发表的Ｈ７亚型ＡＩＶ的ＨＡ基因序列，设计合成了１对Ｈ７ＨＡ特异引物，以ＡＩＶＡ／Ａｆｒｉ．Ｓｔａｒ．／Ｅｎｇ－Ｑ／９８３／７９／（Ｈ７Ｎ１）（Ａ／Ａｆｒｉ．Ｓｔａｒ．／Ｅｎｇ）核酸为模板，通过ＲＴ－ＰＣＲ扩增出１条１．７ｋｂｃＤＮＡ片段。将这一片段定向克隆到ｐＵＣ１８中，对其５′端及３′端部分序列测定后，确证其为ＨＡｃＤＮＡ。将ＨＡ基因置于ＳＶ４０启动子和增强子下游，构建了这一基因的真核表达质粒ｐＳＶＨ７。以此质粒１００μｇ肌肉注射免疫３周龄ＳＰＦ鸡６只，４周后以１００倍鸡胚感染剂量（ＥＩＤ）的ＨＡ基因同源病毒对所有鸡进行攻毒，１周后以棉拭子进行泄殖腔病毒分离；免疫后１～６周每周对所有鸡翅静脉采血，分离血清，检测ＨＩ抗体。结果，１００μｇ免疫组鸡病毒分离数为０／６，对照组为６／６；攻毒后１周免疫组鸡ＨＩ效价为１∶３２～１∶６４，对照组为１∶４～１∶１６。表明所构建的ＨＡ基因表达质粒可作为基因疫苗诱导鸡产生免疫保护反应。 相似文献
8.
PRV特异性糖蛋白gp50基因片段的克隆探针制备 总被引：1，自引：0，他引：1
在ＢＨＫ２１细胞中增殖伪狂犬病病毒（ＰＲＶ），提纯ＰＲＶＤＮＡ，选编码特异性糖蛋白ｇｐ５０基因中的２６２ｂｐ片段进行ＰＣＲ扩增。扩增产物经ＫｐｎⅠ和ＳａｌⅠ双酶切后，将２２２ｂｐ片段与质粒ｐＵＣ１９连接构成重组子ｐＵＰ。通过转化大肠杆菌ＪＭ８３、Ａｍｐｒ和α互补效应筛选后，扩增、提纯重组子ｐＵＰ，用ＫｐｎⅠ和ＳａｌⅠ酶切，电泳回收克隆的２２２ｂｐ片段。用光敏生物素标记２２２ｂｐ片段和重组子ｐＵＰ制备的探针，分别检出４６．８ｐｇ和９３．６ｐｇ的ＰＲＶＤＮＡ，且ｐＵＰ探针只与ＰＲＶ呈杂交阳性反应，与ＨＳＶ－１、ＨＳＶ－２及ＣＭＶ呈阴性反应。 相似文献
9.
鸡传染性支气管炎病毒SY毒株S1基因的RT-PCR扩增与克隆 总被引：2，自引：0，他引：2
利用 ＩＢＶ Ｓ１基因特异性寡聚核苷酸引物,经 ＲＴ－ＰＣＲ技术扩增鸡传染性支气管炎病毒 ＳＹ毒株 Ｓ１基因,得到预期的１．７ｋｂ片段。并将扩增所得ｃＤＮＡ插入克隆质粒载体ｐＵＣ１９的ＥｃｏＲⅠ／ＢａｍＨⅠ酶切位点,在大肠杆菌ＤＨ_(5a)中实现目的基因的克隆,获得ＳＹ毒株Ｓ１基因重组质粒。 相似文献
10.
应用ＲＴ－ＰＣＲ扩增猪瘟病毒（ＨＣＶ）石门株部分ｐ２３和ｐ１４基因，然后采用平端克隆法将扩增的ｃＤ－ＮＡ克隆到ｐＵＣ１９和ＳａｍⅠ位点，用双脱氧终止法牟重组质粒中的插入片段进行序列分析。将所测定的序列与其他１０株ＨＣＶ相同基因区域用ＤＮＡＳＩＳ计算机软件进行同源性比较和系统树分析。结果表明，大部分毒株为同一个型，该型共包括９个ＨＣＶ株，以Ｂｒｅｓｃｉａ株为代表，石门（Ｓｈｉｍｅｎ）株也属该型；而Ａ 相似文献
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采用反转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）方法，以自行设计的Ｈ７和Н５亚型禽流感病毒血凝素（ＨＡ）基因特异的两对引物，分别扩增了禽流感病毒Ａ／ＡｆｒｉｃａｎＳｔａｒｌｉｎｇ／９８３／７９（Ｈ７Ｎ１）株和Ｇ株（广东鹅体分离株，Ｈ５Ｎ１）约１．７ｋｂ的ＨＡ全基因ｃＤＮＡ。将所扩增的两个基因ｃＤＮＡ未端经Ｔ４ＤＮＡ聚合酶修饰后分别插入ｐＵＣ１８和ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ质粒中，得到了两个基因的重组质粒。本研究为国内禽流感病毒分子生物学研究奠定了基础 相似文献
12.
用表达非融合蛋白的原核表达载体ｐＢＶ２２０,通过ＰＣＲ技术的引物设计对ＰＲＲＳ病毒ＢＪ－４株核衣壳蛋白（Ｎ）基因起始密码子上游进行了改造和修饰,在其上游加入了 ＥｃｏＲＩ酶切位点。将 ＰＲＲＳ病毒 Ｎ基因插入载体 ｐＢＶ２２０ ＰＬＰＲ启动子和Ｓ－Ｄ序列下游合适距离的位置,成功地构建了含有ＰＲＲＳ病毒Ｎ基因的原核重组表达载体ｐＢＶ－Ｎ。ｐＢＶ－Ｎ转化大肠杆菌ＤＨ５ａ,经温度诱导后菌体裂解物经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析发现,在约１５ｋＤ处出现一条特异性的目的蛋白条带,分子量大小与ＰＲＲＳ病毒Ｎ蛋白相符,而诱… 相似文献
13.
本研究合成了两个成熟人ＩＬ－６ｃＤＮＡ引物，采用ＰＣＲ法扩增出了成熟人ＩＬ－６基因片段，并在其５＇端加入了一个ＥｃｏＲＩ部位和ＡＴＧ，３＇端加入了一个ＢａｍＨＩ部位和ＴＡＡ。利用ｐＢＶ２２０质粒构建成功了ｐＢＶ２２０ＩＬ－６表达载体。将重组质粒导入Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５ａ中，经３０℃扩增的４２℃诱导，表达出了分子量为２１０００的预期蛋白。经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析与溥层证明具有明显的ＩＬ－６活性。实验还对 相似文献
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应用ＲＴ－ＰＣＲ扩增猪瘟病毒（ＨＣＶ）石门株部分ｐ２３和ｐ１４基因，然后采用平端克隆法将扩增的ｃＤ－ＮＡ克隆到ｐＵＣ１９的ＳｍａⅠ位点，用双脱氧终止法对重组质粒中的插入片段进行序列分析。将所测定的序列与其他１０株ＨＣＶ相同基因区域用ＤＮＡＳＩＳ计算机软件进行同源性比较和系统树分析，结果表明，大部分毒株为同一个型，该型共包括９个ＨＣＶ株，以Ｂｒｅｓｃｉａ株为代表，石门（Ｓｈｉｍｅｎ）株也属该型；而Ａｌｆｏｒｔ株和Ｐ９７株与上述９个毒株差异较大，不属同一型。 相似文献
15.
在中国鸡痘病毒２８２Ｅ４弱毒株基因组部分ＢａｍＨＩ片段的质粒ｐＵＢ、ｐＵＣ、ｐＵＤ、ｐＵＤ２、ｐＵＥ和ｐＵＦ酶切分析的基础上,对ｐＵＦ进行了亚克隆获得ｐＵＦ－Ｅ和ｐＫＳ－Ｘ,对最可能存在非必需区的ｐＵＥ质粒进行了序列分析,改造了含Ｐ１１Ｐ７．５－ＬａｃＺ报告基因盒,并在上述质粒的相应单一酶切位点插入Ｐ１１Ｐ７．５－ＬａｃＺ报告基因盒,构建成ｐＵＢ１、ｐＵＦＣ１、ｐＵＦＥ１、ｐＵＦ－Ｅ１和ｐＫＳＦ－Ｘ１５个重组载体质粒。体内重组等工作正在进行中。 相似文献
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HIV—2env基因在大肠杆菌和重组痘苗病毒中的表达 总被引：1，自引：0，他引：1
将编码人Ⅱ型免疫缺陷病毒（ＨＩＶ－２）ｅｎｖｇｐ１２０（Ｅ１）和ｇｐ３６（Ｅ２）分别克隆到原核高效表达载体ｐＥＴ１７ｂ、ｐＢＶ２２０和真核表达载体ｐ１０、ｐ１６中,构建成８个重组质粒。经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析证明,在原核表达系统成功地表达了ＨＩＶ－２ｅｎｖ融合蛋白,表达的蛋白分子量分别为３５０００、７００００和５００００,而原核表达质粒ｐＥＴＥ１在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ凝胶的３５０００处可见明显的额外蛋白带。经薄层扫描测定,原核系统表达的Ｅｎｖ蛋白（ｇｐ１２０）相对含量为５．８％。在真核细胞中表达的Ｅｎｖ蛋白经Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测分析,分子量分别为６００００、５７０００和４２０００。上述表达的Ｅｎｖ蛋白均能与ＨＩＶ－２阳性血清发生特异性反应。重组痘苗病毒可诱导小鼠产生抗ＨＩＶ－２Ｅｎｖ抗体 相似文献
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把ＳＶ４０的增强子序列以紧邻（ｐＳＶＣＡＴＬＢＧＨ）和相距２．３ｋｂ的距离克隆到小鼠金属巯基组氨酸三甲内盐基因（ＭＴ－Ｉ）启动子的上游，用以研究了在体内（ｉｎｖｉｖｏ）环境下原核基因的增强于对真核基因转录调控的影响，以及增强子与启动子的距离对增强于增强转录效率的影响。在建立了ｐＳＶＣＡＴＬＢＧＨ和ｐＳＶ２ＬＢＧＨ两种转基因结构的不同种系的转基因鼠后，通过分析ＩＣＲ、ＫＢ（昆明白）和Ｃ５７ＢＬ３种种系的ｐＳＶＣＡＴＬＢＧＨ转基因鼠的６种主要器官中的ＣＡＴ活性，证明ＳＶ４０增强子可以增强真核基因──ＣＡＴ基因的转录效率而无种属及组织特异性；通过比较ＩＣＲ和昆明白（ＫＢ）两种种系的ｐＳＶＣＡＴＬＢＧＨ和ｐＳＶ２ＬＢＧＨ转基因鼠的心脏和肝脏中ｂＧＨｍＲＮＡ水平，证明在转基因鼠体内，在２．３ｋｂ距离内，ＳＶ４０增强子对由ＭＴ－Ｉ启动子启动的真核基因──ｂＧＨ基因的转录效率的增强效果无明显差异。 相似文献
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绿脓杆菌外毒素A recA基因的融合及融合蛋白的表达 总被引：1，自引：0，他引：1
将绿脓杆菌ｒｅｃＡ基因克隆到ｐＵＣ１８中，构建了中间载体ｐＵＣＲ１８；然后以正确的向位及阅读框架将ｒｅｃＡ基因亚克隆到毒性基因缺失的绿脓杆菌外毒素Ａ（ＰＥＡ）基因中，构建了ＰＥＡ－ｒｅｃＡ融合基因质粒ｐＥＲＡ；融合基因经ＢａｍＨＩ及ＥｃｏＲＩ酶切，以正确阅读框架插入带有Ｔ７表达启动子的质粒ｐＥＴ－１７ｂ，构建了可表达ＰＥＡ－ｒｅｃＡ融合基因的质粒ｐＥＲＡ－１７ｂ。经酶切分析及ＰＣＲ扩增检测证明，绿脓杆菌ｒｅｃＡ已插入ＰＥＡ毒性基因中。ｐＥＲＡ－１７ｂ转化到ＤＥ３溶原态大肠杆菌ＨＭＳ１７４中，经ＩＰＴＧ诱导，表达了ＰＥＡ－ＲｅｃＡ蛋白。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和凝胶薄层扫描ＰＥＡ－ＲｅｃＡ蛋白，表明ＰＥＡ－ＲｅｃＡ的分子量约为９００００，与理论推算相符，表达率占菌体总蛋白量３．４２９％，用ＰＥＡ抗血清和抗ＲｅｃＡ单克隆抗体作免疫印迹分析，ＰＥＡ－ＲｅｃＡ与它们都有免疫学反应 相似文献
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以Ｘｂａ Ｉ和Ｅｃｏ ＲＶ双酶消化ｐＢＴ１获得肿瘤坏死因子α（ＴＮＦα）ｃＤＮＡ基因片段，以Ｘｂａ Ｉ和Ｓｍａ Ｉ酶切点定向克隆入质粒载体ｐＣＭＶ４，构建了人ＴＮＦα重组质粒ｐＣＭＶ－ＴＮＦα。采用ＤＮＡ－磷酸钙共沉淀法转染ＣＯＳ７和ＮＩＨ３Ｔ３细胞，收集转染后不同时间的细胞培养上清，检测ＴＮＦα的表达水平和生物学活性。ＥＬＩＳＡ检测表明，两种细胞转染后，其培养上清中均有ＴＮＦα抗原存在，而载体等 相似文献
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减蛋综合征病毒基因组HindⅢ酶切片段的克隆及酶谱分析 总被引：9，自引：0，他引：9
以ＰＵＣ１９质粒为载体,采用鸟枪法克隆减蛋综合征病毒（ＥＤＳＶ）基因组的ＨｉｎｄⅢ酶切片段,用Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ－ｄＵＴＰ标记的ＥＤＳＶＨｉｎｇⅢ片段探针打点杂交,证实１３个克隆插入了ＥＤＳＶＤＮＡ的ＨｉｎｄⅢ片段。酶切分析结果表明,克隆到了Ａ、Ｂ、Ｆ、ＧＨ、Ｉ、Ｊ７个不同大小的片段,选取上述插入片段的、具有代表性的７个相应质粒ＰＵＨＡ、ＰＵＨＢ、ＰＵＨＦ、ＰＵＨＧ、ＰＵＨＨ、ＰＵＨＩ、ＰＵＨ 相似文献