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1.
口蹄疫病毒RNA复制酶基因3D的克隆、表达及纯化 总被引：1，自引：0，他引：1
利用RT-PCR扩增了口蹄疫病毒(FMDV)的RNA复制酶基因，并将其克隆到原核表达载体pET-32a( )中。重组质粒在大肠杆菌中表达后的目的蛋白为可溶性形式，纯化产物用感染A型FMDV的豚鼠康复血清进行Western-blotting检测，结果表明，3D基因得到了正确的表达。 相似文献
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对氧磷酶（PON）基因家族有PON1、PON2和PON33个成员，具有抗氧化应激的作用，与血脂异常、糖尿病和冠心病等发病有密切的关系。虽然PON3是PON家族中发现最晚、研究最少的，但近来研究结果发现，在PON3转基因小鼠中，PON3能明显减缓动脉粥样硬化病和肥胖症的形成。因此，本研究描述了猪PON3基因的cDNA编码区的分离和分子特性，克隆了由外显子交替剪接而形成的3个猪PON3转录突变体。结果表明，PON3的mRNA和蛋白质在猪的所有组织中均可表达；而且，与大白猪瘦肉型品系母猪相比， 相似文献
3.
山羊Sox2基因克隆、原核表达和GST融合蛋白纯化 总被引：2，自引：0，他引：2
本研究旨在克隆山羊Sox2基因,构建pGEX-Sox2原核表达重组质粒,从大肠杆菌中获得纯化的GST-Sox2融合蛋白.应用RT-PCR方法从6周龄胎山羊生殖嵴扩增Sox2基因编码全序列,将其克隆到pMD18-T载体,然后再亚克隆到pGEX-KG表达载体.重组质粒pGEX-Sox2转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,用SDS-PAGE电泳及Western blotting检测GST-Sox2融合蛋白表达,用谷胱甘肽Sepharose 4B介质分离纯化该融合蛋白.结果表明,山羊Sox2基因编码序列全长为960 bp;在优化的表达条件(1 mmo|·L-1 IPTG,22℃诱导16h)下,重组质粒(pGEX-Sox2)在大肠杆菌得到了高效表达;谷胱甘肽Sepharose 4B颗粒纯化蛋白得到预期大小的融合蛋白(约60 ku).结论,本研究克隆了山羊Sox2基因,获得了纯化的GST-Sox2融合蛋白,为制备其多克隆抗体奠定了基础,为进一步研究山羊iPS细胞(Induced pluripotent stem cells)创造了条件. 相似文献
4.
采用PCR方法从鸡源新城疫病毒（NDV）强毒F48E9株P基因重组质粒中扩增出了V基因全长cDNA，并引进相应的突变位点，将其克隆到pMD18-T载体，然后亚克隆到原核表达载体pET-30c上，重组质粒经酶切、PCR鉴定及测序，筛选出阳性重组质粒，并命名为pET-30c-V。将pET-30c-V转化大肠埃希氏菌BL21（DE3），用1mmol／LIPTG 37℃过夜诱导表达，SDS-PAGE及Western-blotting分析结果表明，所表达的NDVV重组蛋白主要以包涵体形式存在，分子质量约28ku，与理论值大小相符。将包涵体用8mol／L脲变性，经Ni-NTA柱纯化，透析复性，得到纯化的V蛋白。用复性后的V蛋白免疫21日龄SPF鸡（300μg／只），成功制备了抗鸡NDVV蛋白的抗血清。 相似文献
5.
从大肠杆菌AcrA的编码序列中设计引物，以大肠杆菌基因组为模板，扩增出AcrA基因中约691bp的cDNA片段，将所得片段与pMD—18T载体连接，转化到DH5α大肠杆菌中，成功地筛选到阳性克隆，其质粒测序结果与文献报道一致。从阳性克隆中提取质粒，经HindⅢ和BamHI酶解，回收691bp的目的片段，定向克隆到pET—28a表达载体中，提取质粒，再次转化到BL21(DE3)中，成功地筛选出阳性克隆。经IPTG诱导阳性菌，通过SDS—PAGE检测出AcrA部分基因的表达。 相似文献
6.
家蚕BmAWD与家蚕翅膀发育密切相关,控制其翅膀发育的完整性及可用性。在对本实验室构建的家蚕蛹期cDNA文库测序中,我们筛选到-条编码AWD蛋白的cDNA序列,将其命名为BmAWD基因。通过生物信息学分析,发现该基因序列全长为689bp,ORF框为465bD,编码154个氨基酸残基,含有-个NDPK保守结构域。通过PCR扩增获得该基因ORF框并克隆到表达载体pGEX-5X-1上,得到重组表达质粒pGEX-5X-1-AWD,将该重组子转化大肠杆菌BL21,经PCR、酶切鉴定证明重组正确,在37℃下以IPTG诱导表达后收集菌体并裂解,SDS-PAGE分析发现在43kD左右处有一特异性蛋白条带,与预期值相符,但目的蛋白主要以沉淀即包涵体形式存在,25℃下诱导表达,SDS—PAGE分析表明目的蛋白主要存在于上清中。采用亲和层析法纯化融合蛋白GST-AWD,目的蛋白通过与层析柱上的GST磁珠结合而被纯化分离。 相似文献
7.
为建立绵羊肺腺瘤病毒(jaagsiekte sheep retrovirus,JSRV)受体透明质酸酶-2(Hyal-2)的原核高效表达体系,本试验设计了扩增JSRV受体Hyal-2基因的特异性引物,应用PCR技术扩增出Hyal-2全长基因,将该基因定向重组于原核表达载体pGEX-4T-1中,构建pGEX-4T-1-Hyal-2重组质粒,并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达,逐步优化条件至稳定表达,经Western blotting检测融合蛋白成功表达后,通过亲和层析法对融合蛋白进行纯化。结果表明,Hyal-2基因正确地插入到原核表达载体pGEX-4T-1中;经诱导含重组质粒pGEX-4T-1-Hyal-2的表达菌高效表达了带GST标签的目的蛋白;SDS-PAGE电泳结果显示目的蛋白分子质量为80 ku,与预期大小一致,经Western blotting验证为带GST标签的融合蛋白;通过谷胱甘肽亲和层析法获得纯化的目的蛋白。本试验结果为进一步制备Hyal-2蛋白的多克隆抗体及深入研究其功能奠定基础。 相似文献
8.
从猪肌生成抑制素(MSTN)cDNA序列中设计引物。以pMD18-T-MSTN质粒为模板，PCR扩增猪MSTN成熟蛋白编码序列，该片段全长1095bp。将所得片段与pMD18-T载体连接，构建重组质粒pMT—mpMSTN，将其转化到大肠杆菌DH5a中，成功地筛选到阳性克隆。双酶切重组质粒pMT—mpMSTN和真核表达载体pcDNA3．1，连接目的片段与载体pcDNA3．1，转化大肠杆菌DH5a，经酶切、PCR及测序分析，表明成功地构建了真核表达质粒pcDNA3．1-mpMSTN。 相似文献
9.
《畜牧与兽医》2017,(11):118-123
利用RT-PCR扩增获得少孢节丛孢菌新疆分离株XJ-A1几丁质酶AO-14目的基因片段,对该基因进行克隆和分子特征分析;构建重组表达质粒p ET32a-AO14,转化到大肠杆菌进行诱导表达,用SDS-PAGE和Western blot分析表达的重组蛋白。结果表明,AO-14基因c DNA全长为1 200 bp,编码399个氨基酸;编码蛋白几丁质酶AO-14属于糖苷水解酶18家族,具有典型的几丁质酶催化区保守序列SXGG和DGXDXDWE,氨基酸序列的第131~139为活性位点所在区域,无信号肽序列。SDS-PAGE分析结果显示,AO-14表达产物的分子质量约为60 ku;Western-blot分析结果表明,重组蛋白可以与抗少孢节丛孢菌多克隆抗体发生反应,证实在大肠杆菌中实现了少孢节丛孢菌XJ-A1几丁质酶AO-14基因的表达,为进一步研究少孢节丛孢菌几丁质酶AO-14生物学功能奠定了基础。 相似文献
10.
参考牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)基因组序列设计1对引物,扩增出650 bp的E0基因片段。将目的片段克隆至pMD18-T载体,经酶切鉴定获得阳性重组质粒并对其进行测序。将E0基因定向亚克隆到pET32a表达载体中,酶切及测序鉴定正确后,转化BL21表达菌,经IPTG诱导得到了以包涵体形式表达的重组蛋白。重组蛋白经亲和层析法纯化后,免疫印迹检测证明纯化的重组蛋白具有良好的活性。 相似文献
11.
香猪对氧磷酯酶基因家族的克隆及序列分析 总被引：2，自引：2，他引：0
采用RT-PCR技术,从香猪的肝脏总RNA中克隆了3个对氧磷酯酶(paraoxonase,PON)基因:PON1、PON2、PON3,其cDNA分别长1164、1212和1080 bp,各包含1个完整的开放阅读框,分别编码355、354、354个氨基酸组成的前体,其N-端的15、23、23个氨基酸为信号肽。香猪PON1基因中有1个碱基变异,不改变编码的氨基酸,为无义突变;香猪PON2基因中有2个碱基改变,导致成熟肽发生Q234R、V269I替换;香猪PON3基因中有1个碱基变化,使成熟肽出现R127H替换。经三维结构预测分析,这3个氨基酸位点的变化将影响蛋白质内部区域的微环境,影响对氧磷酯酶的功能,可能与香猪的抗逆性有一定的联系。 相似文献
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为阐明陇东肉牛对氧磷酶1（paraoxonase 1,PON1）基因的结构与功能,本研究运用PCR扩增陇东肉牛PON1基因所有外显子序列并测序,通过Seqman软件完成序列拼接,结合生物信息学方法预测和分析其碱基组成、开放阅读框及编码蛋白的理化性质、原子组成、氨基酸残基数、亲水性和疏水性、分子质量、等电点、二级结构、高级结构等。结果显示,陇东肉牛PON1基因CDS区序列全长1 068 bp,编码355个氨基酸残基,其中数目最多的为亮氨酸（Leu）,数目最少的为半胱氨酸和色氨酸（Cys和Trp）。碱基组成中A+T含量（56.55%）高于G+C含量（43.26%）。与GenBank中牛PON1基因序列（登录号：EU289337）比对分析发现,在PON1基因外显子4、6、8、9中存在突变,但均未导致氨基酸发生变化,为同义突变。PON1蛋白的原子组成是C1810H2796N454O533S12,分子质量为39.83 ku,理论等电点为5.24,为稳定的水溶性蛋白质。PON1蛋白二级结构中无规则卷曲、延展链、α-螺旋和β-转角分别由159、116、55和25个氨基酸构成,最终形成了以无规则卷曲和延展链为主的混合型。PON1蛋白的疏水性结果表明,第8位苏氨酸（Thr）疏水性最强（最高分值2.878）,第299位脯氨酸（Pro）亲水性最强（最低分值-2.222）。本试验结果为深入研究陇东肉牛PON1蛋白功能及探讨PON1基因突变对甘肃地方肉牛胴体、肉质性状的影响奠定基础。 相似文献
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为了表达流行性乙型脑炎（epidemic encephalitis type B）非结构蛋白NS1,本研究通过PCR扩增了日本乙脑病毒（Japanese encephalitis virus,JEV）P3株NS1基因,并分别构建了其融合表达His和GST标签的原核表达载体,经PCR、酶切和测序鉴定正确后转化大肠杆菌BL21感受态细胞,用IPTG诱导表达了NS1融合蛋白,通过SDS-PAGE电泳和Western blotting进行鉴定,并用尿素变性复性和镍亲合层析法纯化目的蛋白。结果显示,试验成功构建了NS1的两个原核表达载体pET-42b-NS1和pGEX-KG-NS1,P3株NS1基因全长1 056 bp,以包涵体的形式表达约40 ku的蛋白,尿素变性复性效果较好,镍亲合层析纯化得到纯度和浓度均较高的NS1蛋白。JEV NS1基因可以通过原核表达系统高效表达蛋白并纯化得到高纯度产物,为后期生物学功能研究奠定基础。 相似文献
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旨在制备抗猪细小病毒(PPV)非结构蛋白共有氨基酸的NS多肽多克隆抗体。根据GenBank(MK993540)公布的PPV基因组序列,克隆其非结构蛋白NS1、NS2共有基因序列(NS基因),并进行生物信息学分析。进而将NS基因克隆至原核表达载体pET-32a,构建重组质粒pET-32a-NS,转化至大肠埃希菌Rosetta(DE3)中进行诱导表达,利用镍柱亲和层析技术纯化表达的重组多肽,用重组多肽免疫Balb/c小鼠制备多克隆抗体。结果显示,PPV杨凌株NS基因长258bp,编码86个氨基酸的多肽,是具有亲水性的非跨膜NS多肽,具有大量的B细胞线性表位。NS多肽在37℃、0.8mol/L IPTG条件下,诱导6h有大量的可溶性表达。免疫印迹试验结果显示,该多肽具有较好的抗原性。用纯化NS多肽免疫小鼠后获得鼠抗NS多肽的血清抗体效价为1∶12800。用制备的NS多克隆抗体检测纯化的NS重组多肽及真核表达的NS1蛋白,均能检测出相应特异性条带,为进一步研究NS蛋白在PPV致病过程中的作用奠定了基础。 相似文献
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腐蹄病节瘤拟杆菌纤毛蛋白与绵羊白细胞介素-2融合基因表达载体的构建及表达 总被引：1，自引：0，他引：1
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牛传染性鼻气管炎病毒gE基因的截短克隆与表达 总被引：6，自引：0，他引：6
以牛传染性鼻气管炎病毒Baaha Nu/67株的DNA作为模板，用PCR扩增gE基N并克隆至pGEM-T Easy裁体，再以此质粒作为模板将gE基因分成6个片段，分别插入原核表达载体pET32a并在大肠杆菌中进行了表达。蛋白电泳结果表明6个片段中有2个片段以可溶形式表达，1个片段以包涵体形式表达，另外3个片段没有表达。采用固定化金属离子亲和层析法在非变性条件下对两个可溶性片段进行了纯化。经免疫印迹试验，间接ELISA和交叉试验证明，两个纯化的重组蛋白均与牛传染性鼻气管炎阳性血清样品发生反应，而与牛传染性鼻气管炎阴性血清无任何反应，显示其具有良好的抗原性和特异性，可用于牛传染性鼻气管炎gE-ELISA诊断方法的建立。 相似文献
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构建致倦库蚊(贵阳株)天蚕素B2(CecB2)基因原核表达载体,并原核表达获得重组蛋白。定向克隆CecB2成熟肽序列至原核表达载体pET32a(+)上,将成功构建的pET32a-CecB2重组表达质粒转化大肠埃希菌Rosetta中经IPTG诱导表达,对IPTG诱导浓度和诱导时间优化后表达所得目的蛋白采用镍离子亲和层析纯化,SDS-PAGE和Western blot检测鉴定表达蛋白。结果表明,成功构建原核表达载体pET32a-CecB2,IPTG浓度和时间优化结果为IPTG浓度为0.05mmol/L,诱导时间为3h。SDS-PAGE检测获得大小约25ku的可溶性纯化蛋白,Western blot鉴定纯化蛋白可与鼠抗His-tag单克隆抗体发生抗原抗体结合反应。说明所构建原核表达载体pET32a-CecB2能在大肠埃希菌中可溶表达,为进一步研究其生物学功能奠定了基础。 相似文献