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沙门氏菌PCR检测方法的建立 总被引：3，自引：1，他引：2
根据GenBank沙门氏菌侵袭蛋白A(invA)基因序列设计引物,扩增特异的202 bp核苷酸片段,经过优化PCR扩增条件,建立了沙门氏菌特异、敏感和快速的PCR检测方法。特异性试验结果表明,从沙门氏菌参考菌株中均能扩增出特异性的核苷酸片段,大肠杆菌、巴氏杆菌、金黄色葡萄菌、志贺氏菌、蜡样芽孢杆菌、变形杆菌、绿脓杆菌的扩增结果均为阴性。敏感性试验结果表明,采用简便的直接煮沸裂解法制备样品DNA,该方法的敏感性可达2.43×103CFU/mL。 相似文献
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建立酸乳中葡糖醋杆菌的赖解旋酶恒温基因扩增(helicase-dependent isothermal DNA amplification,HDA)检测方法。根据葡糖醋杆菌16S基因序列(基因号为HQ677466.1)设计特异性引物,并优化反应体系中UvrD解旋酶和T4 gp32的浓度。通过HDA法直接检测酸乳中的葡糖醋杆菌,并确定其检出限,在建立的HDA体系中对酸乳中多种菌株进行扩增和电泳检测,验证方法的特异性。结果表明:用HDA法检测酸乳中葡糖醋杆菌,得到了与设计序列长度(101 bp)一致的基因片段,检出限为102 CFU/g,反应体系中UvrD解旋酶和T4 gp32的适宜添加量分别为0.1 μg和5.0 μg。该方法用于检测酸乳中葡糖醋杆菌的灵敏度高、耗时短。 相似文献
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研究以布鲁氏杆菌保守的OMP25蛋白基因为靶基因,设计了6条LAMP特异性引物,同时探讨了加环引物对LAMP的影响,通过优化LAMP体系的反应条件,建立了一套快速检测布鲁氏杆菌的新方法。LAMP扩增产物可通过凝胶电泳和荧光显色进行判定。该研究比较了LAMP法和加环引物LAMP法的灵敏度,并检测了其引物特异性。试验结果显示,普通LAMP法的灵敏度为20CFU/mL,加环引物的LAMP法的灵敏度为2.0CFU/mL。通过两种方法的比较可知:LAMP法可以快速、直观、准确地检测布鲁氏杆菌,加环引物可进一步提高LAMP的扩增效率,是一种在基层现场有广泛应用前景的检测方法。 相似文献
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空肠弯曲杆菌是人细菌性胃肠炎的常见食源性致病菌之一,严重危害人类的健康,建立快速精准检测食源性空肠弯曲杆菌的方法,对于保障人们的健康和食品安全具有重要意义。本研究建立了一种可视化、低成本基于hipO基因的环介导等温扩增(LAMP)技术快速检测空肠弯曲菌的方法。该LAMP方法检测空肠弯曲菌CJFX01基因组DNA为阳性,而对肠出血性大肠杆菌O157:H7、鼠伤寒沙门菌、单增李斯特菌、小肠结肠炎耶尔森菌、金黄色葡萄球菌、产气荚膜梭菌等食源性致病菌和胸膜肺炎放线杆菌Aha01、副猪嗜血杆菌Ahh01、多杀性巴氏杆菌Ahm03、猪链球菌Ahs02、猪丹毒丝菌Ahe01、支气管败血波氏杆菌Ahb01等猪源致病菌基因组DNA检测结果均为阴性,表明其具有良好的特异性。灵敏度的检测结果表明,LAMP检测空肠弯曲杆菌的检测限为5.4×101 CFU/mL,而基于F3/B3引物对常规PCR的检测限为5.4×106 CFU/mL,即LAMP检测空肠弯曲杆菌的灵敏度比常规PCR高100 000倍。本研究建立的LAMP检测方法具有快速、可视化、低成本、特异性好和灵敏度... 相似文献
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快速检测大肠杆菌O157的LAMP方法的建立与评价 总被引：1，自引：0，他引：1
利用DNA环介导恒温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP),以rfbE基因为靶序列,设计LAMP引物,建立LAMP反应体系与条件,进行灵敏度和特异性试验.结果显示,整个检测过程仅需1h即可通过肉眼直接目测试验结果.在灵敏度试验中,rfbE-LAMP对O157菌液和模拟阳性样品的最低检测限分别为1CFU/mL和1 CFU/g.在特异性试验中,以其他血清型大肠杆菌以及沙门杆菌基因组DNA为模板对rfbE基因进行检测,均没有发生非特异性扩增反应.试验建立的LAMP检测方法具有操作简单安全、检测灵敏度高、特异性高的特点,能够满足基层实验室、应急检测或现场监测等方面的使用需求. 相似文献
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检测创伤弧菌两种毒力基因的环介导等温扩增检测方法的建立 总被引：1，自引：0，他引：1
为建立快速检测致病性创伤弧菌两种毒素的环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)方法,分别以创伤弧菌溶血素A基因(hemolysin gene A,HA)和多重毒素(repeats in toxin,RTX)毒力基因的保守序列作为靶序列设计内、外引物。通过肉眼观察白色沉淀初步判断检测结果,通过琼脂糖电泳最终确定检测结果。LAMP检测创伤弧菌的两种基因的灵敏度都达到10 CFU/mL。特异性结果表明致病性创伤弧菌的结果为阳性,而其他几种常见弧菌和食源菌检测结果为阴性。在人工模拟样品检测中,LAMP结果显示,采用水煮法提取DNA,从样品处理到报告结果耗时1.5 h,鱼肉中创伤弧菌的检出限为1×10~2 CFU/g(RTX)和1×10~4 CFU/g(HA);采用同样方法提取DNA进行普通PCR,其检出限为1×10~3 CFU/g(RTX)和1×10~4 CFU/g(HA),耗时4 h。结果表明,本研究建立的LAMP方法检测创伤弧菌两种毒力基因时具有灵敏度高、特异性强、方法简便等优点,适用于食品和养殖业中的现场快速检测。 相似文献
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本试验旨在通过快速定量不同发酵时期下发酵豆粕中解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的数量,以解决豆粕发酵过程品质监控的瓶颈难题,建立解淀粉芽孢杆菌的实时荧光定量PCR方法。根据解淀粉芽孢杆菌DNA解旋酶A亚基(gyrA)基因及16S核糖体RNA(16S rRNA)基因的保守区设计出3对引物,利用常规PCR筛选出1对特异性引物,并以该引物的扩增产物构建的重组质粒作为标准品,建立实时荧光定量PCR方法,并对该方法进行特异性、灵敏性、重复性检验,核酸水平抗干扰验证及豆粕对检测敏感度的干扰验证,最后对发酵的豆粕样品进行定量检测。结果表明:1)以gyrA基因设计的引物构建的质粒标准品建立的实时荧光定量PCR方法具有良好的特异性;2)该方法检测解淀粉芽孢杆菌核酸和菌液的最低检测限分别为102 copies/μL和103 CFU/mL;3)该方法组内变异系数在0.76%~3.27%,组间变异系数在0.34%~1.88%,均低于5%,说明重复性良好;4)含有与不含副干酪乳杆菌核酸的解淀粉芽孢杆菌的Ct值无显著差异(P>0.05),说明该方法不受检样中其他微生物的核酸干扰;5)该方法对豆粕中解淀粉芽孢杆菌的检测限为104 CFU/mL,比纯菌液最低检测敏感度(103 CFU/mL)降低了1个数量级(但不影响该方法的实际检测应用)。解淀粉芽孢杆菌在不同发酵时期发酵豆粕样品中定量检测结果表明,发酵0 d解淀粉芽孢杆菌的数量为9.33×10^5 copies/g,发酵至5 d接种菌数量为4.16×10^8 copies/g。由此可见,本试验建立的解淀粉芽孢杆菌实时荧光定量PCR方法特异性强,灵敏度高,抗干扰能力强,可快速定量发酵豆粕中的解淀粉芽孢杆菌的数量。 相似文献
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建立一种微滴式数字聚合酶链式反应（droplet digital polymerase chain reaction,ddPCR）定量检测发酵乳中醋化醋杆菌的技术。根据醋化醋杆菌ITS基因序列设计特异性引物和探针,通过反应温度筛选优化ddPCR扩增条件,通过多种菌株扩增验证方法特异性,通过人工添加醋化醋杆菌验证方法检出限,通过ddPCR法实测结果和计数法测定结果之间的比较对其绝对定量进行系统性研究。结果表明：建立的发酵乳中醋化醋杆菌ddPCR定量检测方法,反应条件中最适退火温度为54.6℃,方法特异性强,检出限为7.2×101 CFU/mL,灵敏度高,定量偏差率为23.73%。该方法可以满足发酵乳中醋化醋杆菌定量检测需求。 相似文献
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为优化环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）法检测牛奶中结核分枝杆菌的条件,以结核分枝杆菌高度保守的16S rRNA基因为靶基因设计3对特异性引物（F3-B3、FIP-BIP、FLP-BLP）进行试验。比较改良后的CATB/NaCl法、细菌基因组DNA提取试剂盒及热裂解法提取其DNA的效率,确定最佳的提取方法。用灭菌处理过的牛奶对结核分枝杆菌悬液进行倍比稀释以确定该检测方法的敏感度。以牛奶中常见的布鲁氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、李斯特菌、巴氏杆菌、沙门氏菌为对照,对该方法进行特异性测试。结果表明,改良后的CTAB/NaCl法对牛奶中结核分枝杆菌DNA的提取效果要优于其他两种方法。LAMP法检测结核分枝杆菌的灵敏度为3×100 CFU/mL,对人工阳性乳中结核分枝杆菌检测的灵敏度为3×101 CFU/mL。 相似文献
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The assay was aimed to establish a rapid, sensitive and specific method of loop-mediated isothermal amplification (LAMP) for the detection of Salmonella. According to the highly conserved STN gene of Salmonella reported in GenBank, we designed a set of primers, and then followed by a series of LAMP optimization of reaction conditions, specificity test, sensitivity test, stability test and enzyme test. The sensitivity of LAMP and conventional PCR were compared.The results showed that the optimal reaction temperature of LAMP was 65 ℃, when only amplification of Salmonella, the minimum detectable concentration was 101 CFU/mL, which was more than conventional PCR detection by one order of magnitude. The results showed that LAMP method had the qualities of specificity, high sensitivity, short time-consuming and convenience for the detection of Salmonella, which was expected to develop into an effective method 相似文献
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YANG Min WANG Hui-dang YU Lu WU Chang-xin Zhang Hui CAO Xu-dong CHEN Chuang-fu 《中国畜牧兽医》2016,43(7):1688-1693
To optimize the loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method to detect Mycobacterium tuberculosis in milk,the highly conservative 16S rRNA gene of Mycobacterium tuberculosis was selected as a target to design specific primers.Compared the modified method of CATB/NaCl,bacterial genome DNA extraction kit and thermal cracking method to extract the DNA of Mycobacterium tuberculosis,the best approach was chosen.Mycobacterium tuberculosis suspension liquid was diluted with sterilization milk to confirm the susceptibility of this assay.And then Brucella,Escherichia coli,Staphylococcus aureus,Listeria monocytogenes,Bacillus pasteurii and Salmonella were used for specificity detection.The results showed that the modified method of CATB/NaCl was better than the others.The sensitivity of LAMP was 3×100 CFU/mL,and the specificity was 100%.The sensitivity of detecting Mycobacterium tuberculosis in milk by LAMP was 3×101 CFU/mL. 相似文献
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A loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay was developed for detection of Salmonlla in fecal samples of experimental monkeys. According to the specific sequences (fimY) of Salmonlla in GenBank, one set of primers was selected and the reaction condition was optimized. The results showed that the detection limit of LAMP method was 1.35×101 and 1.35×103 CFU/mL in Salmonella pure culture and clinical samples,respectively,which was the same as routine PCR. The amplification could complete in one hour, and the result could be distinguished by naked eyes. There was non-specific amplification of other pathogens. These results suggested that this LAMP assay was a simple and specific method for rapid detection of Salmonlla in fecal samples. 相似文献
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为实现沙门氏菌的快速检测,根据沙门氏菌特异性invE、hilA、invA、hut基因编码区序列,分别设计合成4套引物,通过对引物筛选和反应条件优化,建立了以invA特异性基因设计合成为引物的沙门氏菌环介导等温扩增检测方法。本方法对沙门氏菌定性检测灵敏度可达到101CFU/mL (细菌浓度),其灵敏度比普通PCR高10倍且反应结果易于观察。以6种沙门氏菌和8种非沙门氏菌细菌DNA为模板进行LAMP扩增检测,并无交叉反应。结果显示,设计的LAMP引物组和建立的沙门氏菌的LAMP检测方法具有特异性好、灵敏度高、快速、费用低廉等优点,可应用于动物和食品样品中肠道沙门氏菌6个亚种的快速检测。 相似文献
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应用环介导等温扩增技术快速检测单核细胞增生李斯特菌的研究 总被引：1，自引：0，他引：1
目的建立环介导等温扩增技术快速检测单核细胞增生李斯特菌。方法根据单核细胞增生李斯特菌(LM)hlyA基因序列中的保守区域,采用在线引物设计软件Primer Explorer4.0进行设计,获得一套特异性的环介导等温扩增(LAMP)引物,对单核细胞增生李斯特菌hlyA基因进行LAMP扩增,并与常规PCR方法进行比较。结果建立的LAMP方法能成功扩增出梯形条带,LAMP检测单核细胞增生李斯特菌纯培养物和人工染菌的灵敏度为5.44×102cfu/mL,而对照PCR检测的灵敏度为5.44×104cfu/mL。对10株细菌进行LAMP扩增,仅单核细胞增生李斯特菌得到阳性结果。从DNA提取到报告结果,耗时仅1h。结论 LAMP检测单核细胞增生李斯特菌灵敏度高,特异性强,耗时短,方法简便,有望发展成为快速检测食品中单核细胞增生李斯特菌的有效手段。 相似文献
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本研究利用3种方法对新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)进行检测,并对这3种检测方法的灵敏度和特异性作出比较。根据新城疫病毒的融合蛋白基因(F基因)设计合成6条特异性引物,利用水浴LAMP法、PCR及LAMP实时浊度仪进行检测。通过对恒温水浴中的反应温度、反应时间及反应液中Mg2＋浓度进行优化获得最佳反应条件,结果用凝胶电泳分析;用优化的温度进行LAMP实时浊度仪检测,同时都与PCR方法进行比较。结果显示,获得了最佳反应条件,水浴LAMP方法最低检测限是1.58 pg,比PCR高100倍,而LAMP实时浊度仪检测灵敏度比水浴LAMP方法高10倍,最低检测限是0.158 pg。3种方法对其他非新城疫病毒均无检出。结果表明,新城疫病毒水浴LAMP检测方法速度快、不需要高精密的仪器,而且具有灵敏度高、特异性强、操作简单等特点,有望在核酸扩增领域取代PCR技术,LAMP浊度仪法检测灵敏度更高,但是所需仪器和试剂比较昂贵。 相似文献
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动物饲料中沙门氏菌环介导等温扩增(LAMP)快速诊断方法的建立 总被引：1，自引：0，他引：1
根据GenBank公布的沙门氏菌高度保守的fimY蛋白基因序列,利用Primer explorer V4软件设计4条针对沙门氏菌fimY基因的特异性引物,通过对Mg2+浓度、dNTP浓度、反应温度、反应时间、特异性、敏感性、重复性和稳定系及符合率等方面,优化LAMP各种反应条件,建立针对沙门氏菌LAMP快速诊断方法。结果表明,该方法具有较强的特异性;比PCR检测方法敏感性高100倍,对沙门氏菌的最低检出量为6.2 CFU/mL;对24份样品的3次检测结果与国标法完全一致。证明建立的针对fimY蛋白基因的LAMP检测方法操作简便,特异性强,敏感性高,适用于现场检测。 相似文献