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1.
棉花黄萎病菌致病相关基因VdMFS1敲除载体的构建 总被引：1，自引：0，他引：1
利用反向遗传学的手段,构建了棉花黄萎病菌MFS（Major facilitator superfamily）敲除载体,以期通过同源重组策略敲除棉花黄萎病菌（Verticillium dahliae Kleb.）强毒力菌株Vd080中的VdMFS1基因,初步明确该基因的功能。以pCAMBIA-1302为基础,通过酶切连接的方法,将该基因的上游序列UP、筛选标记基因HPH和VdMFS1基因下游序列DOWN以首尾相连的顺序插入到该载体中,成功构建了VdMFS1基因敲除载体pCB1302-MFS,为大丽轮枝菌致病基因的功能研究奠定了基础。 相似文献
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海莲耐盐基因AOC克隆及转录融合表达载体的构建 总被引：1，自引：0，他引：1
利用RT-PCR的方法从红树林海莲中克隆丙二烯环化氧化酶基因(AOC),并进行序列测定和BLAST程序进行同源序列分析。从RT-PCR得到的产物,其核苷酸序列与GeneBank中海莲丙二烯环化氧化酶基因AO(CBAB21610)的核苷酸序列完全相同。AOC基因通过中间载体pBS-AOC,pJIT60-AOC,最后克隆到植物表达载体pGreenII0229上,得到双35S的pGreenII0229-AOC植物表达载体。AOC基因和ipt基因通过中间载体pBS-AOC,pBS-ipt,pBS-AOC-ipt,pJIT60-AOC-ipt;最后将AOC和ipt基因以转录融合的方式克隆到植物表达载体pGreenII0229上,得到具有双35S启动子的AOC,ipt双基因转录融合的植物表达载体pGreenII0229-AOC-ipt。 相似文献
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促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)是线虫体内信号转导的重要组分,在生长发育过程中具有重要作用。本研究从象耳豆根结线虫中克隆了1个促分裂原活化蛋白激酶基因Me-mapk1c DNA序列,该序列全长1 369 bp,包含1个1 185 bp的完整开放阅读框,推导编码394个氨基酸,蛋白质分子量为45.39 ku。同源性搜索比对结果发现,该基因编码的蛋白序列与南方根结线虫MI-MAPK1具有99%的一致性。通过构建原核表达载体p ET-32a-MAPK,在IPTG的诱导下得到70 ku左右的特异融合蛋白(包括大小约26 ku的标签序列)。利用RNAi技术对象耳豆根结线虫二龄幼虫Me-mapk1基因进行沉默,线虫诱导番茄根结形成的数量显著减少,推测Me-mapk1基因的下调表达有可能影响象耳豆根结线虫二龄幼虫(J2)的生长发育。 相似文献
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根据GenBank中收录的菜豆几丁质酶基因mRNA序列设计一对引物,以菜豆品种五常油豆总DNA为模板,通过PCR扩增获得一个约1.1kb的DNA片段Bchi,将其克隆入pUC18载体.测序和序列分析结果表明,该序列全长1088bp,含有一个981bp的完整开放读码框,无内含子,编码327个氨基酸,编码产物在结构上具有Class Ia几丁质酶的结构特征:N-端具有一个26个氨基酸的信号肽,其后是富含8个半胱氨酸、长41个氨基酸的几丁质结合区和由249个氨基酸组成的高度保守的催化区,C-端为由11个氨基酸组成的液泡定位多肽.序列与结构上的同源性分析表明Bchi基因是菜豆Class Ia几丁质酶基因.此序列已在GenBank中注册,登录号为AY357300.以pQE-30为原核表达载体,构建成pQE-Bchi重组表达载体,转化表达受体菌E.coliM15,经IPTG诱导后表达出一个约35kD的蛋白,与推测的Bchi基因编码产物的大小一致,表明Bchi基因在大肠杆菌中能够表达,是一个具有表达功能的基因. 相似文献
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根据KCS基因的保守性设计引物,以高神经酸含量的碎米荠叶片DNA为模板(KCS基因无内含子),克隆碎米荠超长链脂肪酸合成的限速酶β-酮脂酰- CoA合酶(KCS)基因全长CDS序列,命名为CarKCS.Blast 比对及序列分析表明,目的片段序列和GenBank上报道的拟南芥KCS18序列同源性达到87％.CarKCS全长1518bp,不含内含子,编码505个氨基酸.生物信息学分析表明,所有的酶功能活性位点的氨基酸都存在,在N端都有两个,C端有一个高度疏水的跨膜结构域;CarKCS与KCS18同属于KCS基因家族的FAE1 - like亚家族.将目的片段连接到pFCC -5941.nap表达载体,经PCR和酶切检测,证明已成功构建了pNapin- CarKCS载体. 相似文献
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根据其它植物Actin基因设计一对简并性引物,以甜菜根总RNA为模板,采用RT-PCR的方法扩增出Actin基因片段并克隆到pUCm-T载体上,阳性克隆经PCR鉴定测序。序列分析表明,克隆得到Actin基因家族的两个成员,其片段长度均为598 bp,编码198个氨基酸,它们间的同源性为87%。将其分别命名为BvACT1和BvACT2,已在GenBank中注册,登录号为KF214784和KF214785。多重序列比较表明,Bv A CT1氨基酸序列与其他植物Actin基因的同源性在92%以上,而Bv A CT2则在93%以上。 相似文献
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利用GATEWAYTM技术快速构建番木瓜环斑病毒HC-pro基因的RNAi表达载体 总被引：1，自引：0，他引：1
通过RT-PCR扩增番木瓜环斑PRsV病毒HC-pro基因,序列比对结果表明,克隆到的该基因片段与已知的海南或华南地区已克隆的HC-pro基因只有约92%的同源性,说明PRSV病毒具有较大的变异性.为了培育番木瓜转基因抗病植株,利用pWATERGATEI体和GATEWYTM技术,成功构建了番木瓜环斑病毒HC-pro基因的RNAi表达载体.具体步骤如下:①设计带特异性重组序列attB的HC-pro基因PCR的引物;②利用该引物进行RT-PCR扩增日C-pro基因;③通过BP反应,将扩增得到的HC-pro基因序列插入入门载体pDONR201中;④通过LR反应将HC-prd基因序列从pDONR201重组到目标载体pWATERGATE中,得到PRSV HC-pro基因的RNAi表达载体. 相似文献
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酸性蛋白酶pepB基因植物表达载体的构建及在玉米中的转化 总被引：1，自引：0，他引：1
以黑曲霉基因组DNA为模板,利用聚合酶链式反应(PCR)技术扩增了酸性蛋白酶pepB基因序列,并将其克隆到pMD18-T Vector上,对重组子进行了PCR检测和限制性内切酶分析并测序.DNA序列分析表明:克隆片段长为1340bp,与已发表的pepB基因序列同源性达99.85%.将pepB基因片段插入到带有耐盐基因的表达载体pCAMBIA1301-BADH上,构建了无抗生素选择标记的重组质粒pB-pepB-35S,从而得到了植物表达载体,该载体利用耐盐基因BADH替代抗生素基因作为筛选标记.通过花粉管通道法将其导入玉米自交系,获得了转基因植株,并得到了转化植株的种子. 相似文献
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以热带玉米自交系CML288为供试材料,根据拟南芥ELF4基因保守序列设计引物,采用RT-PCR方法克隆了ELF4在玉米上同源基因的全长cDNA序列(GenBank上的登录号为HQ009862)。序列分析表明,该基因cDNA序列全长683 bp,开放阅读框为432 bp,编码了144个氨基酸,与拟南芥、水稻的氨基酸序列同源性分别高达62%和75%,此外它们还共同包含一个高度保守的DUF1313未知功能结构域。利用基因重组技术分别构建了能够高效表达的过量表达载体pBI-ZmELF4和带有GFP标记的融合表达载体pGIT-ZmELF4-GFP,利用融合表达载体进行洋葱表皮瞬时表达实验,结果将ZmELF4定位于细胞核内,说明该基因在细胞核内起作用。 相似文献
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以已经克隆到亚麻木质素合成关键酶咖啡酸-O-甲基转移酶基因(COMT)全长cDNA序列为基础,通过扩增RNAi顺式及反式片段(均为249 bp),先连接到中间载体pBSK,再连接表达载体pCAMBIA-1301-multi,构建成COMT基因的RNAi表达载体,通过农杆菌介导转化亚麻,获得转基因植株,通过GUS染色和PCR检测,表明干扰载体已经转入亚麻中。这为推进亚麻纤维品质改良的分子育种提供了基础。 相似文献
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茶树咖啡因合成酶基因RNA干涉表达载体构建 总被引：11，自引：3，他引：8
咖啡因合成酶（TCS）是茶树咖啡因生物合成途径中的一个关键酶,催化7-甲基黄嘌呤转变为可可碱和可可碱转变为咖啡因。抑制TCS基因表达是培育低咖啡因茶树的最有效途径。用RT-PCR方法扩增茶树TCS基因的两个cDNA片段,并克隆入T-载体中。干涉载体和TCS基因片段的T克隆经限制性内切酶两次双酶切与连接,将两个TCS基因片段分别反向重复插入到干涉载体pFGC5941,构建了TCS基因的RNA干涉载体,分别命名为pFGC5941-TCS02和pFGC5941-TCS03。经PCR和DNA测序获得验证。TCS基因RNA干涉载体的构建为培育低咖啡因茶树奠定了基础。 相似文献
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根据草莓（Fragaria ananassa Duch）NCED基因序列（GenBank： HQ399498），克隆NCED基因开放阅读框，将该片段插入植物表达载体pBI 121的CaMV 35S 启动子和NOS 终止子之间，构建了正义表达载体pBI 121NCED。克隆NCED基因正义、反义片段和作为内含子的gusA基因片段，以植物表达载体pBI 121为基础，以pCAMBIA2301作为中间载体，通过多次酶切和连接，成功构建了草莓NCED基因RNAi表达载体pBI 121NCEDRNAi和反义表达载体pBI 121NCEDF。经PCR、限制性内切酶酶切和测序鉴定后，成功将pBI 121NCED、pBI 121NCEDF和pBI 121NCEDRNA 3个重组表达质粒导入农杆菌EHA105中。研究结果为进一步研究草莓NCED基因的功能奠定了基础。 相似文献
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Rxol cloned from maize is a non-host gene resistant to bacterial leaf streak of rice. pCAMBIA1305-1 with Rxol was digested with Sca Ⅰ and NgoM Ⅳ and the double right-border binary vector pMNDRBBin6 was digested with Hpa Ⅰ and Xma Ⅰ.pMNDRBBin6 carrying the gene Rxol was acquired by ligation of blunt-end and cohesive end. The results of PCR, restriction enzyme analysis and sequencing indicated that the Rxol gene had been cloned into pMNDRBBin6. This double right-border binary vector,named as pMNDRBBin6-Rxol, will play a role in breeding marker-free plants resistant to bacterial leaf streak of rice by genetic transformation. 相似文献
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Rxo1 是从玉米中克隆的水稻细菌性条斑病非寄主抗性基因。采用ScaⅠ和NgoMⅣ酶切携带Rxo1 基因的载体pCAMBIA1305 1,HpaⅠ和XmaⅠ酶切双右边界双元载体pMNDRBBin6,通过平端和黏性末端连接目的基因和载体,得到了重组载体pMNDRBBin6 Rxo1。 PCR和限制性内切酶酶切以及序列测定证实Rxo1 整合到了双右边界载体pMNDRBBin6中。该载体为利用转基因技术获得无选择标记抗细菌性条斑病水稻育种材料提供了条件。 相似文献
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Rxo1 是从玉米中克隆的水稻细菌性条斑病非寄主抗性基因。采用ScaⅠ和NgoMⅣ酶切携带Rxo1 基因的载体pCAMBIA1305 1,HpaⅠ和XmaⅠ酶切双右边界双元载体pMNDRBBin6,通过平端和黏性末端连接目的基因和载体,得到了重组载体pMNDRBBin6 Rxo1。 PCR和限制性内切酶酶切以及序列测定证实Rxo1 整合到了双右边界载体pMNDRBBin6中。该载体为利用转基因技术获得无选择标记抗细菌性条斑病水稻育种材料提供了条件。 相似文献
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采用ZmCol3基因RNAi载体构建、农杆菌介导玉米遗传转化、转基因材料开花期表型鉴定等研究方法,评估抑制ZmCol3基因表达对玉米开花期的影响。转基因玉米基因组PCR结果证实,人工合成RNAi片段已成功整合到玉米基因组中。qRT-PCR结果表明,在不同转基因玉米株系中ZmCol3基因表达受到不同程度的抑制。温室转基因玉米开花期相关性状调查结果表明,抑制ZmCol3表达,可以将玉米抽雄、散粉和吐丝时间提前2~3 d。研究结果证实,ZmCol3具有调控开花期的生物学功能,抑制该基因表达进而缩短玉米开花期可以作为行之有效的方法应用到玉米熟期改良研究中。 相似文献