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1.
为探究宿主蛋白Beclin1在猪瘟病毒(classical swine fever virus, CSFV)非结构蛋白NS5A激活细胞自噬反应过程中的作用及具体分子机制,本研究在感染CSFV及表达NS5A蛋白的ST细胞中,利用qRT-PCR方法检测Beclin1、PI3K/Akt通路相关因子表达变化情况;利用激光共聚焦、Co-IP及GST-pulldown等方法研究Beclin1与NS5A相互作用关系;通过在ST细胞中过表达或敲低Beclin1,研究其对CSFV复制的影响。结果表明,ST细胞感染猪瘟病毒或外源表达NS5A蛋白,Beclin1转录和蛋白表达水平均显著升高,且PI3K/Akt通路相关因子表达水平与之呈正相关。此外,CSFV NS5A蛋白与Beclin1蛋白在细胞中存在共定位且具有相互作用。最后,作者发现在细胞中过表达Beclin1,对CSFV复制起到明显促进作用;反之,利用siRNA敲低Beclin1后,抑制PI3K/Akt通路活化,CSFV增殖表现出明显抑制效应。以上结果表明,Beclin1蛋白对CSFV复制具有促进作用,其机制是通过与NS5A的相互作用调控PI3K/Ak... 相似文献
2.
《畜牧兽医学报》2015,(9)
旨在找出激活PI3K/Akt信号通路的禽呼肠孤病毒(ARV)蛋白质。选取ARV中潜在具有激活PI3K/Akt信号通路活性的σA、σNS、μA、μB和μNS蛋白作为研究对象,将这5个基因克隆到真核表达载体pcAGEN,成功构建重组质粒σA-pcAGEN、σNS-pcAGEN、μA-pcAGEN、μB-pcAGEN和μNS-pcAGEN。将构建的重组质粒转染Vero细胞,采用间接免疫荧光和Western blot检测目的蛋白质的表达,并通过流式细胞术和Western blot,检测转染后Vero细胞磷酸化Akt(P-Akt)的表达量。结果显示,5个目的蛋白质均得到表达。转染σA-pcAGEN或σNS-pcAGEN的Vero细胞,P-Akt的表达量明显升高,而使用PI3K特异性抑制剂LY294002则能抑制P-Akt的表达量明显升高。结果表明,ARV的σA蛋白和σNS蛋白能激活细胞的PI3K/Akt信号通路。 相似文献
3.
本实验旨在探究脐带间充质干细胞(UC-MSCs)介导磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(PI3K/Akt/mTOR)信号通路对乳腺上皮细胞(BMECs)凋亡的调控作用。将处于对数生长期的UC-MSCs与BMECs按照1:2的比例混合共培养72 h,对照单独培养的UC-MSCs和BMECs,再分别用PI3K抑制剂LY294002(50μmol/mL)和mTOR抑制剂RAPA(50 nmol/mL)孵育细胞48 h,采用流式细胞术检测细胞周期和凋亡情况。结果表明:将UC-MSCs与BMECs共培养,能够显著抑制BMECs细胞凋亡,加入PI3K抑制剂LY294002和mTOR抑制剂RAPA孵育BMECs后,极显著地促进了BMECs细胞凋亡(P0.01),但是与UC-MSCs共培养后,这种抑制作用明显得到抵消。UC-MSCs通过介导PI3K/Akt/mTOR信号通路参与调控BMECs的凋亡;抑制剂LY294002和RAPA通过阻断PI3K/Akt/mTOR通路促进BMECs凋亡。综上可知,UC-MSCs能够激活被阻断的PI3K/Akt/mTOR信号通路,使其重新参与调控BMECs。 相似文献
4.
《中国畜牧杂志》2017,(2)
瘦素是一种重要的能量调控因子,存在于人体骨骼肌细胞,而瘦素在鸭肌肉生长和发育过程中的作用还不十分清楚。本实验采用离体培养鸭成肌细胞、CCK-8、荧光定量PCR等技术,探索瘦素调控鸭成肌细胞的增殖和分化机理。结果表明:1 ng/mL瘦素促进鸭成肌细胞生长,而10 ng/mL和100 ng/mL显著抑制成肌细胞生长(P0.05);瘦素处理24 h后,1 ng/mL组的Myf5和MyoD的表达量最高,10 ng/mL组的Myf5和100 ng/mL组的MyoD的表达量最低(P0.05);而MRF4和MyoG在各个浓度处理组的表达量均显著下降(P0.05);1 ng/mL瘦素处理24 h后,AMPK和PI3K的表达量也显著升高(P0.05),即AMPK和PI3K参与瘦素调控鸭成肌细胞生长发育过程;分别抑制AMPK和PI3K信号通路后,瘦素诱导Myf5和MyoD表达被减弱(P0.05),而MRF4和MyoG的表达上升仅在AMPK被抑制组(P0.05)。以上数据表明,瘦素可通过激活AMPK和PI3K信号通路调控鸭成肌细胞增殖和分化,但是AMPK信号通路作用性应大于PI3K信号通路。 相似文献
5.
《中国兽医学报》2016,(5):852-858
磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol kinase 3-kinase,PI3Ks)蛋白家族参与对细胞增殖、分化、凋亡等多种细胞功能的调节。课题组前期利用Illumina/Solexa高通量测序技术对羊传染性脓疱病毒(Orf virus,ORFV)感染OFTu细胞前后mRNA表达谱进行比较分析发现,PI3K在感染后宿主细胞中显著上调表达。为进一步验证,利用荧光定量PCR、Western blot方法分别从基因转录水平和蛋白表达水平对羊传染性脓疱病毒(Orf virus,ORFV)感染不同时间段(0、3、6、12、24、48、72h)Hela细胞中PI3K的表达变化规律进行分析,与未接毒细胞相比,PI3K在感染后不同时间段均呈上升趋势,且随着感染时间延长而增加,该结果与表达谱分析结果一致。为进一步明确PI3K对ORFV侵染复制的影响,利用PI3K特异性抑制剂LY294002对PI3K进行抑制处理后接种ORFV,收集感染后不同时间段(12、24、48、72h)细胞进行定量PCR检测和TCID50测定,结果显示,加入LY294002处理的Hela细胞,其病毒滴度低于未处理细胞中的病毒滴度,由此可见阻断PI3K对ORFV的入侵具有抑制作用。上述研究结果表明,PI3K对ORFV在宿主细胞中的复制增殖具有明显的促进作用。该研究结果不仅有助于对参与ORFV侵染过程相关信号通路的研究,而且将为深入揭示ORFV致病分子机制奠定基础。 相似文献
6.
《畜牧兽医学报》2015,(10)
为探讨PI3K/Akt信号通路在鸡细胞型朊蛋白(ChPrPC)过表达的DF-1细胞(DF-1-PrP)增殖、黏附、侵袭和凋亡过程中的作用及其与ChPrPC表达量的关系,以DF-1-PrP细胞为模型,空载体转染的DF-1-NC细胞和DF-1细胞为对照,分别用0、10、20、50、100、200nmol·L-1渥曼青霉素处理以抑制PI3K/Akt信号通路,检测细胞对鼠尾胶原的黏附能力,Transwell小室法检测细胞侵袭力,MTT法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡,RT-PCR法检测PRNP基因转录量。结果显示,随着渥曼青霉素浓度的增加,DF-1-PrP、DF-1-NC和DF-1细胞的PRNP基因转录量均减少,其增殖、黏附、侵袭能力相应下降,而总凋亡率均升高;但在低于100nmol·L-1的同一渥曼青霉素浓度下,DF-1-PrP细胞增殖、黏附、侵袭能力始终高于对照组,而总凋亡率均低于对照组。本研究表明ChPrPC的过量表达可促进DF-1细胞增殖、黏附和侵袭,抑制其凋亡,在以上过程中,PI3K/Akt信号通路可能具有重要的作用,渥曼青霉素能有效阻断这一通路,但PI3K/Akt信号通路并不是ChPrPC调节细胞凋亡的唯一途径。 相似文献
7.
为研究JAK/STAT和PI3K/AKT信号通路在小反刍兽疫病毒（PPRV）宿主细胞天然免疫中的作用,在PPRV感染山羊肾细胞24、48和72 h后,分别用MTT试验和间接免疫荧光试验（IFA）检测病毒感染细胞活力及其在细胞中的分布;用qRT-PCR和Western-blot分别检测病毒蛋白、Nectin-4受体、 JAK/STAT和PI3K/AKT信号通路及其下游信号分子表达水平的变化。结果表明,PPRV感染24、48和72 h后的细胞存活率分别为99.53%、77.12%和66.87%,病毒H和N蛋白表达水平显著增加（P<0.05）;但Nectin-4表达无显著变化（P>0.05）;p-STAT1/STAT1比值极显著升高（P<0.01）;ISG20、ISG15、IRF9、IRF3、IFNβ和IFNα表达水平显著或极显著升高（P<0.05或P<0.01）;p-AKT表达水平极显著升高（P<0.01）;p-AKT/AKT、p-NFκB/NFκB、p-GSK/GSK和p-CREB/CREB比值均显著或极显著升高（P<0.05或P<0.01... 相似文献
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9.
为研究microRNA(gga-miR-21)对传染性法氏囊病病毒(IBDV)复制的影响,本研究利用PCR方法从鸡的肝细胞基因组中扩增细胞pri-gga-miR-21,克隆于慢病毒表达质粒pL-EGFP中构建重组质粒pL-miR-21。将pL-miR-21与3个包装质粒pLP1、pLP2和pLP/VSVG共转染293FT细胞,制备含gga-miR-21基因的重组慢病毒VL+miR-21。将VL+miR-21感染DF-1细胞,经杀稻瘟菌素筛选获得过表达gga-miR-21的细胞株DF-miR-21,采用定量RT-PCR(qRT-PCR)检测表明,gga-miR-21的表达量比正常DF-1细胞提高60%。将IBDV接种于DF-miR-21细胞,在96 h后,其病毒滴度(104.75TCID50/0.1 mL)显著低于正常DF-1细胞的病毒滴度(108.75TCID50/0.1 mL)。采用生物信息学方法和双荧光素酶报告系统分析验证,在IBDV基因组VP1基因中存在gga-miR-21的结合靶点。将IBDV感染DF-miR-21细胞,采用western blot分析,VP1蛋白的表达量比正常DF-1细胞显著降低;用qRT-PCR分析,VP1 mRNA水平与正常DF-1细胞没有明显差异。本实验结果表明:细胞gga-miR-21可以抑制IBDV的复制,其分子作用机理是在VP1基因翻译水平上实现的。 相似文献
10.
骨骼是脊椎动物中坚硬的结缔组织,具有构成机体基本支架、保护脏器、支撑体重和维持运动的作用。骨骼发育主要是通过膜内成骨和软骨内骨化完成的,该过程由多种调控因子组成的复杂调控网络共同发挥作用以维持畜禽骨骼健康。整合素（integrin）是细胞膜上的一种介导细胞-基质相互作用的跨膜受体,不仅具有引起细胞黏附的作用,还能够通过双向传递细胞内外的信号引发机体相应反应。整合素能够调控多条信号通路,包括磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B (phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B,PI3K/Akt)信号通路,在维持畜禽动物骨骼健康方面发挥重要作用。PI3K/Akt信号通路是由酶联受体介导的能够调节细胞生命活动的信号通路,能通过炎症、自噬、凋亡等作用调节软骨代谢平衡,对维持骨骼健康具有重要意义。综合国内外关于畜禽骨代谢、整合素和PI3K/Akt信号通路之间关系的研究进展,从整合素对畜禽骨代谢的影响、PI3K/Akt信号通路对畜禽骨代谢的影响以及整合素通过PI3K/Akt信号通路对骨代谢的影响三方面进行综述,以期为探究整合素通过PI3K/Akt信号通路在畜... 相似文献
11.
《畜牧兽医学报》2016,(7)
旨在探讨禽呼肠孤病毒(ARV)的σA和σNS蛋白是否是通过PXXP或YXXXM基序来激活PI3K/Akt信号通路的。作者采用重叠延伸PCR的方法,将σA和σNS基因的PXXP或YXXXM基序进行突变后构建了重组质粒,并在Vero细胞中进行了表达。通过流式细胞术和Western blot,检测转染后Vero细胞磷酸化Akt(P-Akt)的表达量,并与野生型σA和σNS蛋白激活的P-Akt表达量进行比较。结果显示,σA和σNS基因均得到了表达,σA基因的110—114和114—117位的PXXP基序突变后,Vero细胞P-Akt的表达量明显下降。可见,ARV的σA蛋白,是通过PXXP基序来激活PI3K/Akt信号通路的。本研究从细胞信号转导角度揭示了ARV与宿主相互作用的机制,也为寻找抗ARV药物作用靶标提供了新的思路。 相似文献
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《畜牧兽医学报》2016,(10)
冷诱导RNA结合蛋白(CIRP)是NF-κB和ERK信号通路的上游调控因子,而这两条信号通路是甲型流感病毒复制和机体起始免疫所必需的,为探讨CIRP对H1N1甲型流感病毒复制的影响及可能的分子机制,构建了CIRP过表达BHK-21细胞系(Cirp+BHK-21),用Western blot检测NF-кB和ERK1/2的磷酸化水平,研究CIRP对NF-кB和ERK1/2的调节作用;用Real-time RT-PCR检测H1N1甲型流感病毒感染后Cirp+BHK-21和对照细胞中病毒拷贝数的动态变化,以及在特异性阻断剂PDTC阻断NF-кB通路的Cirp+BHK-21细胞中病毒拷贝数的动态变化。Western blot检测结果显示:过表达CIRP显著促进了BHK-21细胞中NF-κB的磷酸化水平(P0.05),而对ERK1/2的磷酸化水平无显著影响;病毒定量检测结果显示:过表达CIRP能显著促进H1N1甲型流感病毒的增殖,感染后3、9、15、21h病毒在Cirp+BHK-21细胞中的拷贝数分别为对照组的111%、103%、167%和235%(P0.05);阻断NF-κB信号通路后病毒的拷贝数显著下降,在感染后3、9、15、21h分别为未阻断组的98%、42%、19%(P0.05)和7%(P0.05)。从本研究结果可见,CIRP可通过活化NF-κB信号通路促进H1N1甲型流感病毒的复制。 相似文献
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为了阐明ERK(extracellular signal-regulated protein kinases)1/2通路在传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)复制过程中的作用以及双特异性磷酸酶6(dual specificity phosphatase 6,DUSP6)对ERK的反馈性负向调控在IBV复制过程中的作用。本研究通过Western blot、Northern blot检测发现:IBV感染Vero和H1299细胞可导致ERK1/2的磷酸化水平和DUSP6表达均上调;利用MEK1/2特异性抑制剂U0126处理病毒感染的细胞后,可明显下调ERK1/2的磷酸化,同时抑制病毒的增殖;利用DUSP6的特异性抑制剂BCI抑制DUSP6的活性或者用siRNA阻断DUSP6的表达后,再感染IBV,发现ERK1/2的磷酸化水平增高,病毒蛋白的表达上调。综上,推测IBV感染细胞激活ERK1/2信号通路,有助于病毒的复制,同时,细胞通过诱导表达DUSP6,负向调控ERK1/2的磷酸化水平,抑制病毒增殖。 相似文献
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生长阻滞和DNA损伤诱生蛋白45β（growth arrest and DNA damage 45β，GADD45β）参与多种细胞信号通路，在病毒感染过程中发挥重要作用，但在禽白血病病毒（avian leukosis virus，ALV）感染中研究较少。本研究中，用J亚群禽白血病病毒（ALV-J）感染DF-1细胞，通过荧光定量PCR和Western blot检测GADD45β表达水平。此外，在过表达GADD45β和干扰GADD45β的情况下，通过Western blot、间接免疫荧光试验和ELISA检测GADD45β对ALV-J复制的影响。结果表明，ALV-J感染DF-1细胞能显著上调GADD45β表达水平（P<0.05）。过表达GADD45β后，ALV-J的蛋白表达水平显著降低（P<0.05），荧光信号强度也明显低于对照组。然而，干扰GADD45β后，ALV-J的复制水平显著上调（P<0.05），说明GADD45β可以抑制ALV-J病毒复制。本研究首次发现GADD45β具有抑制ALV-J病毒复制的功能，为抗ALV-J的研究提供了新的思路和理论基础。 相似文献
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试验旨在探究猴头菇多糖（HEP）预处理RAW264.7细胞对番鸭呼肠孤病毒（MDRV）复制的影响及其机制,从Toll样受体3/β干扰素TIR结构域衔接蛋白（TLR3/TRIF）信号通路解析HEP在调节MDRV所致的雏番鸭机体免疫抑制中的作用机制并提供体外试验参考。试验设空白对照组（BCG）、病毒感染对照组（VCG）、HEP对照组（HCG）和HEP预防病毒感染组（HPG）,RAW264.7细胞在MDRV感染12和24 h后,通过Western blotting检测各组细胞中TLR3、TRIF和肿瘤坏死因子受体相关因子6（TRAF6）的蛋白表达量;病毒感染24 h后,用ELISA法检测各组细胞培养液中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-10（IL-10）、IL-6、IL-1β、干扰素-β（IFN-β）的含量。TCID50检测结果表明,MDRV病毒的TCID50为103.46。病毒感染后12 h,细胞未出现明显变化;病毒感染后24 h,细胞变圆;病毒感染后36 h,细胞大量死亡。MDRV在RAW264.7细胞中的复制结果显示,在感染病毒12~24 h内,σNS的表达量呈现上升趋势;在24~36 h,σNS的表达量维持在较高水平。Western blotting结果显示,与空白对照组相比,VCG组细胞TLR3、TRIF和TRAF6蛋白的表达量在感染后12和24 h均显著升高（P<0.05）,HCG组TRIF蛋白的表达量均显著升高（P<0.05）;与感染组相比,HPG组的σNS、TLR3、TRIF和TRAF6蛋白表达量在病毒感染12和24 h均显著降低（P<0.05）。ELISA检测结果显示,与空白对照组相比,VCG组细胞培养液中TNF-α、IL-6、IL-1β和IFN-β的含量均显著升高（P<0.05）;与感染组相比,HPG组细胞培养液中TNF-α、IL-6、IL-1β含量均显著降低（P<0.05）,IFN-β的含量显著升高（P<0.05）。结果表明,HEP可调节MDRV感染诱导RAW264.7细胞TLR3信号转导通路活化,抑制TLR3信号转导通路下游产物TNF-α、IL-10、IL-6和IL-1β的过度表达,同时上调IFN-β的表达,从而抑制MDRV在RAW264.7细胞中的复制。 相似文献
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《黑龙江畜牧兽医》2017,(1)
为了研究马兜铃酸(AA)模拟的肾小管上皮细胞系HK-2细胞急性肾损伤(AKI)过程中,miRNA-21(miR-21)和肾损伤分子-1(KIM-1)之间的调控关系,以及探讨miR-21对AA引起的AKI的影响,试验选用HK-2细胞,采用不同浓度的30,60,120μmol/L AA处理24 h后,提取各组细胞总RNA,经过逆转录后进行实时荧光定量检测KIM-1 mRNA和miR-21的转录水平。为了确认miR-21是否对KIM-1具有转录后调控作用,通过将miR-21模拟物转染进入HK-2细胞,实时荧光定量PCR检测KIM-1的mRNA转录水平,同时检测miR-21模拟物的表达,探讨miR-21对AA引起的急性肾损伤细胞是否具有保护作用。结果表明:与未处理的对照组相比,AA对HK-2细胞处理后可以促进KIM-1 mRNA和miR-21的过表达(P0.05)。而高浓度的AA(120μmol/L)则促进KIM-1 mRNA表达明显下降,而miR-21仍上调表达。miR-21模拟物的过表达,明显下调了KIM-1 mRNA的表达水平。低浓度的AA处理HK-2细胞后,miR-21和KIM-1表达均上调。当AA浓度达到一定程度后,上调的miR-21开始抑制KIM-1 mRNA的表达,最终通过负反馈调节产出作用。说明高浓度AA通过调控miR-21表达来抑制KIM-1 mRNA的表达水平,从而对AKI起到保护作用。 相似文献
18.
《畜牧与兽医》2017,(2):42-46
为了探究Wnt11(无翅型MMTV整合位点家族成员11)对鸭骨骼肌成肌细胞增殖的影响以及可能与Wnt11相关的信号通路,采用体外分离培养鸭骨骼肌成肌细胞,脂质体介导siRNA(小干扰RNA)转染干扰基因的表达,qRT-PCR(实时荧光定量PCR)检测基因表达变化,Ed U(5-乙炔基-2'-脱氧尿苷)染色分析细胞增殖情况,流式细胞术检测细胞周期变化及信号通路抑制剂处理。结果显示:干扰Wnt11的表达后,增殖相关基因CCND1(细胞周期蛋白D1)、CDK6(周期蛋白依赖性激酶6)和PCNA(增殖细胞核抗原)的表达量极显著降低(P0.01),Ed U阳性细胞数极显著降低(P0.01),处于S期的细胞数显著降低(P0.05);当用Akt(蛋白激酶B)抑制剂处理鸭成肌细胞后,Wnt11表达量显著降低(P0.05),而干扰Wnt11表达后,PI3K(磷脂酰肌醇-3-羟激酶)和Akt的表达量显著升高(P0.05)。提示:Wnt11在鸭成肌细胞增殖过程中有重要调控作用,Wnt11发挥调控作用需要PI3K/Akt信号通路参与,且二者间存在反馈作用。 相似文献
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猪瘟病毒(CSFV)感染无特定病原(SPF)猪后,分离猪外周血单个核细胞进行转录组分析,数据显示病毒感染后泛素特异性蛋白酶18(USP18)基因的转录水平明显上升。为研究USP18分子对CSFV复制的影响及其作用机制,本研究通过构建过表达USP18的细胞系及应用特异性小干扰RNA下调表达USP18的方法,采用荧光定量PCR验证USP18对CSFV增殖的影响,结果显示USP18分子能够促进CSFV的复制;通过检测IFN-β、NF-κB及ISRE的启动子活性及I型干扰素(IFN-I)信号通路的下游分子m RNA的转录水平,采用荧光定量PCR和双荧光酶报答试验分析USP18对IFN-I信号通路的影响,结果显示USP18分子抑制IFN-I信号通路。以上结果表明CSFV通过诱导USP18分子的上调表达,抑制了IFN-I途径,从而逃避天然免疫防御,进而促进自身的复制。本研究为明确CSFV与宿主之间的相互作用及CSFV致病机制提供参考依据和奠定基础。 相似文献