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1.
根据GenBank中已发表的猪圆环病毒2型(PCV2)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)有关基因序列,通过序列比对及参考相关文献,设计了3对特异性引物。通过优化,建立了可同时检测PCV2、PRV及PPV 3种病毒的多重PCR方法。结果表明,该方法能同时检测到PCV2、PRV及PPV的最低核酸量分别为40pg、72pg、46pg。对猪圆环病毒3型(PCV3)、猪细环病毒(TTSuV)、猪流行腹泻病毒(PEDV)、猪蓝耳病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)无扩增。应用该方法对87份临床样品进行检测,PCV2阳性检出率为28.7%(25/87),PRV野毒检出率为11.5%(10/87),PPV检出率为12.6%(11/87)。其中2种以上病毒混合感染阳性率为13.8%(12/87),3种病毒同时感染的阳性率为2.3%(2/87),其结果也与单一PCR结果一致。研究结果提示,该方法可用于PCV2、PRV、PPV三种病原的单一感染或混合感染的鉴别诊断。 相似文献
2.
在GenBank中收集猪细小病毒(PPV)结构蛋白VP2基因、猪圆环病毒2型(PCV2)的ORF2序列、猪伪狂犬病毒(PRV)的gB基因、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的NSP2基因、猪瘟病毒(CSFV)的E2基因和乙型脑炎病毒(JEV)的M基因,利用Primer5.0等分子生物学软件对收集的序列分析比较,筛选出上述基因的特异保守序列并设计引物和探针,将设计好的探针与相应的微球偶联,优化条件,建立检测方法。结果表明:建立的检测PPV、PCV2、PRV、PRRSV、CSFV、JEV6种病毒核酸的多重液相芯片技术具有较好的特异性、敏感性和稳定性,对PPV、PCV2、PRV、PRRSV、CSFV、JEV6种病毒核酸的最低检出量分别为8.50×10~2copies/μL、2.87×10~2copies/μL、2.07×10~2copies/μL、2.61×10~2copies/μL、2.34×10~2copies/μL、2.05×10~2copies/μL,与相应病毒PCR/RT-PCR检测方法相比,敏感性提高了100~1000倍;对临床388份样品同步进行荧光PCR与液相芯片检测,结果99.87%相符。本方法为液相芯片技术在动物多病毒快速高通量检测、鉴别诊断等应用方面奠定了基础。 相似文献
3.
《中国兽医学报》2020,(1)
根据GenBank中PRRSV ORF6、PCV2 ORF2、PPV NS1、PRV gB、SIV M、JEV NS1、CSFV E2等基因的部分片段,分别设计特异性引物,用实验室已保存的病毒及阳性病料,通过对7个病毒单一PCR的退火温度和敏感性进行优化和检测,再选择合适的多重PCR缓冲体系及酶,优化退火温度、模板及引物浓度,最后检测多重PCR的敏感性、特异性及重复性,建立一种能够同时且快速鉴别PRRSV、PCV2、PPV、PRV、SIV、JEV和CSFV这7种常见猪呼吸道和繁殖障碍类病毒的多重PCR检测方法,并用其对2017-2019年贵州部分地区的150份临床病料进行检测。多重PCR特异性检测结果表明:从混合病毒基因组中分别扩增出大小为224,353,424,549,684,831,1 137 bp的特异性片段,未扩增出E.coli、APP、PEDV及正常组织的DNA/RNA;敏感性试验表明,该方法对病毒的最低检测量分别为PRRSV 94 pg、PCV2 66 pg、PPV 68 pg、PRV 20 pg、SIV 35 pg、JEV 17 pg、CSFV 14 pg;重复性试验表明:相同条件下的6次重复试验均能扩增出7个病毒的目的条带;应用试验表明:150份临床病料中二重感染阳性率高达66.00%(99/150);三重感染阳性率达11.33%(17/150);四重感染阳性率达2.00%(3/150);五重感染阳性率达0.67%(1/150);六重感染阳性率为0,七重感染阳性率为0,阳性PRRSV、PCV2、PPV、JEV、SIV的多重PCR与单一PCR的符合率均为100.00%,阳性CSFV和PRV的符合率为90.00%以上,研究建立的多重PCR检测方法具有敏感性高、特异性强、重复性好的特点,对猪场猪呼吸和繁殖障碍类病毒病混合感染的快速诊断具有十分重要的意义。 相似文献
4.
猪繁殖障碍病毒性疫病六重PCR检测方法的建立及应用 总被引：7，自引：0，他引：7
参照GenBank中相关的基因序列,设计了6对引物分别用于扩增PRV gE、PPV NS1、PCV ORF2、PRRSV ORF7、CSFVE2、JEVE基因的部分片段。敏感性和特异性试验结果表明,该mPCR对6种病毒的最低核酸检测量分别为PRV 6.6pg、PPV 96pg、PCV 12.9pg、PRRSV 10.5pg、CSFV 51pg、JEV 46pg,对猪流感病毒(SIV)、大肠杆菌(E.coli)的扩增结果均为阴性。103份临床病料检测结果表明,上述6种猪病毒性疫病在贵州省猪群中普遍存在且混合感染情况严重。该六重PCR方法不仅实现了上述6种病毒的同时检测,更实现了DNA病毒及RNA病毒的同步检测,能够对PRV、PPV、PCV、PRRSV、CSFV、JEV单个或混合感染的临床病料进行快速鉴别诊断。 相似文献
5.
为了建立能够同时检测猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)和猪细小病毒(PPV)的多重PCR,并用于猪场感染情况的动态监控以及临床诊断,根据GenBank中已发表的5种病毒的基因序列,针对CSFV的E2、PRRSV的Nsp2、PRV的gB、PCV2的ORF2和PPV的VP2基因,分别设计了特异性引物。在建立的单项PCR基础上,通过优化反应条件,建立了能同时检测5种病毒的多重PCR,并具有较高的灵敏性和良好的特异性。采用建立的多重PCR对127份疑似病猪的扁桃体活体组织进行检测,检出了5种病毒的存在,其中感染2种及以上病毒的样品比例为38.6%(49/127),表明该方法是一种快速、灵敏、高效的病原学检测手段。 相似文献
6.
《中国兽医学报》2016,(3):378-383
参照GenBank中猪伪狂犬病毒(PRV)gE基因以及猪圆环病毒2型(PCV2)中ORF2特异性序列,设计特异引物和TaqMan-MGB探针,通过优化反应条件,建立了同时检测PRV野毒株和猪圆环病毒(PCV2)的双重荧光定量PCR检测方法,并验证该方法的特异性、敏感性、重复性。结果表明,该方法检测PRV和PCV2灵敏度分别可达2.23×101、4.5×102拷贝/μL,均比常规PCR检测方法高100倍;同时检测猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖和呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪细小病毒(PPV)、均为阴性,无交叉反应;对30份疑似病料进行检测并与普通PCR进行比较,结果显示,二者检测PRV的总符合率为96.67%,检测PCV2的总符合率为93.33%。本试验建立的TaqMan-MGB双重荧光定量PCR检测方法可同时对PRV野毒株和PCV2进行早期快速诊断,可应用于病原学监测,流行病学调查等。 相似文献
7.
根据GenBank中的猪伪狂犬病病毒(PRV)gE、猪圆环病毒2型(PCV-2)ORF2、猪细小病毒(PPV)VP2基因序列,设计了3对引物,成功建立了检测PRV野毒株、PCV-2和PPV的多重PCR诊断方法,扩增产物分别为288 bp、419 bp、681 bp。敏感性、特异性试验结果显示,该PCR对3种病毒的最低核酸检测量分别为PRV 48.2 pg/L、PCV-2 36.7 pg/L、PPV 0.25 ng/L,而PRV(gE基因缺失株)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、大肠杆菌的扩增结果均为阴性。对87份自然感染病猪样品的检测结果表明,该多重PCR检测结果与单一PCR检测结果完全符合。结果表明,该多重PCR方法具有很好的特异性和敏感性,可用于临床PRV野毒株和gE基因缺失疫苗株、PCV-2和PPV的检测。 相似文献
8.
《中国兽医学报》2019,(2):193-197
由猪瘟病毒(CSFV)、伪狂犬病病毒(PRV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的繁殖障碍性疫病在中国的不断暴发,增加了猪的发病率和死亡率。为了建立同时检测这3种病毒的多重PCR方法,本研究根据GenBank中这3种病毒的参考基因序列设计引物,并对反应中的影响因素进行优化,建立了同时检测CSFV、PRV和PRRSV的多重PCR方法。该方法扩增的基因片段大小分别为570(CSFV),232 (PRRSV)和173bp(PRV)。敏感性和特异性试验结果显示,该方法对3种病毒的核酸最低检出量分别为23.88(CSFV),13.10(PRRSV)和14.60pg(PRV),对大肠杆菌(Ec.oli)、沙门菌(Salmonella)、猪乙型脑炎病毒(JEV)及猪圆环病毒2型(PCV2)的检测结果均为阴性。对2015年5月至2016年1月收集的168份临床样本检测结果显示,CSFV阳性率为24.4%,PRRSV阳性率为21.4%,提示河北省该段时间内引起猪繁殖障碍性疫病的主要病原为CSFV和PRRSV。经多重PCR检测为PRRSV、PRV或CSFV阳性的临床样本,再次使用商品化的试剂盒进行检测,符合率为100.0%。这些结果表明,本试验建立的多重PCR方法省时、高效,可用于PRRSV、PRV和CSFV感染的临床诊断。 相似文献
9.
为建立能同时检测猪瘟病毒(CSFV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的方法,针对CSFV和PRRSV的基因序列设计3对特异性引物,第1对引物扩增CSFV毒株NS2基因508bp片段,第2对引物扩增PRRSV美洲型经典毒株和变异毒株Nsp2基因338bp/248bp片段,第3对引物扩增PRRSV欧洲型毒株ORF5基因614bp片段。经过反应条件的优化,建立了能同时检测并区分CSFV毒株和PRRSV美洲型经典毒株、变异毒株及欧洲型毒株的多重RT-PCR方法。该方法可以特异扩增CSFV和PRRSV,而与猪口蹄疫病毒(FMDV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)均无交叉反应;对CSFV和PRRSV 4种重组质粒标准品的检出下限均为1.67×103拷贝/μL。对采集的106份临床疑似病料进行检测,结果CSFV和PRRSV变异株混合阳性4份,占3.77%(4/106);CSFV阳性7份,占6.60%(7/106);PRRSV变异株阳性17份,占16.04%(17/106)。结果表明,建立的多重RT-PCR检测方法可以用于CSFV和PRRSV的临床快速鉴别诊断和流行病学调查。 相似文献
10.
旨在建立一种可同时检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)、猪细小病毒(PPV)和猪巨细胞病毒(PCMV)的多重PCR检测方法。参考相关文献及序列比对结果设计6对特异性引物,建立了可同时检测以上6种病毒的多重PCR方法并应用此方法对临床病例进行了检测。结果表明,所建立的多重PCR方法灵敏度高,对6种病毒的最低核酸检测量分别为12.8pg(PRRSV)、46pg(CSFV)、16pg(PRV)、23.5pg(PCV-2)、72pg(PPV)、8.6pg(PCMV),对猪流感病毒(SIV)、猪乙型脑炎病毒(JEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪轮状病毒(PoRV)无特异性扩增。应用该方法对临床145份样品进行检测,总阳性率为83.45%,2种以上病毒混合感染阳性率为69.66%。说明所建立的多重PCR检测方法敏感,可用于猪群中上述6种猪病病原的单一感染或混合感染的鉴别诊断。 相似文献