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1.
为制备MHCⅠ基因工程疫苗的基础材料,构建了鸡MHCⅠ分子重组质粒并进行原核表达,进而制备鸡MHCⅠ分子的多克隆抗体。应用PCR方法,克隆鸡MHCⅠα和β2m基因,构建重组载体pETMHCⅠα和pET-MHCⅠβ2m,经PCR、双酶切和测序鉴定后,将重组质粒在大肠埃希菌Rosetta中进行诱导表达,融合蛋白纯化后,接种昆明小鼠制备多克隆抗体,血清稀释后用免疫印迹法(Western blot)分析。结果表明,鸡MHCⅠα和β2m基因在大肠埃希菌中成功表达,融合蛋白分子质量分别约为52.1ku和33.0ku;制备的鼠抗鸡MHCⅠα和β2m链多克隆抗体,经Western blot检测证实抗体特异性较强,可进一步用于鸡MHCⅠ分子的研究。 相似文献
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为了构建珍珠鸡MHCⅠ轻链β2m成熟肽基因的原核表达载体并在大肠杆菌中实现可溶性的表达,采用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)法从鸡脾脏中提取总RNA,以总RNA为模板,5’-ATC TAG AGG TAC CGG ATC C-(T)15-3’为反转录引物,采用T aK aR a AM V反转录酶合成F irst-strand cDNA(fcDNA)。根据G enB ank中登录的鸡的β2m基因序列,设计了分别含E coRⅠ和H indⅢ酶切位点的一对引物,分别扩增鸡β2m的成熟肽基因。PCR产物经纯化回收后,插入到含L acZ基因的原核克隆载体pGEM-T E asy中,转化至大肠杆菌JM 109感受态细胞,经E coRⅠ和H indⅢ双酶切及PCR鉴定,筛选出阳性克隆。再把所克隆的片断亚克隆到表达载体pM AL-p2X,构建重组表达质粒p2Xβ-2m。将重组表达质粒转化入大肠杆菌E.coli TB 1感受态细胞,筛选阳性克隆,经IPTG诱导表达后,进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析。结果表明,本研究克隆了鸡β2m成熟肽基因序列,全长约297bp,编码约98个氨基酸,并可溶性表达了鸡β2m成熟肽蛋白质分子。采用淀粉树脂柱亲和层析和DEAE凝胶过滤方法对表达产物进行了纯化,并对纯化的表达产物进行了W estern b lot鉴定。本研究为进一步利用BF 2的胞外区在体外共同构建MHCⅠ类分子结合筛选抗原表位肽平台奠定了基础。 相似文献
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为进一步研究MHCⅠ类分子作用机制,以及为制备MHCⅠ基因工程疫苗奠定基础,克隆鸡MHCⅠ基因,并构建MHCⅠβ2m-α融合基因进行原核表达。运用RT-PCR方法,克隆鸡MHCⅠα和β2m链基因,并通过编码连接肽（Gly4Ser）4的基因序列将两者头尾相连,构建了pET-32a-MHCⅠβ2m-α重组质粒,经PCR扩增、双酶切和测序鉴定后,重组质粒在E.coli BL21细胞进行IPTG诱导表达融合蛋白,采用SDS-PAGE和Western blotting方法分别检测表达产物。结果表明,成功克隆了MHCⅠα和β2m链基因,长度分别为1014和300 bp;构建的融合基因MHCⅠβ2m-α长度为1194 bp,经原核表达,融合蛋白分子质量约为62.0 ku,能与相应的抗体结合,具有一定的免疫学活性。 相似文献
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为进一步研究MHCI类分子作用机制,以及为制备MHCI基因工程疫苗奠定基础,克隆鸡MHCⅠ基因,并构建MHC Ⅰβ2m-a融合基因进行原核表达.运用RT-PCR方法,克隆鸡MHC Ⅰa和β2m链基因,并通过编码连接肽(Gly4 Ser).的基因序列将两者头尾相连,构建了pET-32a-MHC Ⅰβ2m-a重组质粒,经PCR扩增、双酶切和测序鉴定后,重组质粒在E.coliBL2 Ⅰ细胞进行IPTG诱导表达融合蛋白,采用SDS-PAGE和Western blotting方法分别检测表达产物.结果表明,成功克隆了MHCⅠa和β2m链基因,长度分别为1014和300 by;构建的融合基因MHCⅠβ2m-a长度为1194 by,经原核表达,融合蛋白分子质量约为62.0 ku,能与相应的抗体结合,具有一定的免疫学活性. 相似文献
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根据GenBank中收录的鸡主要组织相容性复合体(Major Histocompatibility Complex,MHC)Ⅰ的α胞外区基因核苷酸序列,设计并合成了一对引物,PCR扩增α胞外区基因.将特异性DNA条带回收,以pGEM-T Easy veetor质粒为载体进行连接,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,经蓝白斑... 相似文献
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根据GenBank中登录(登录号:AB115244)的鸭MHC-Ⅰα链序列设计并合成1对引物,采用RT-PCR技术从鸳鸯鸭脾脏组织中克隆出鸳鸯鸭MHC-Ⅰα链基因,并进行T-A克隆和序列测定.结果表明,所获得的鸳鸯鸭MHC-Ⅰα链基凶长909bp,编码303个氨基酸的多肽,含一个完整的鸳鸯鸭MHC-Ⅰα链胞外区成熟肽基因.序列比较发现.鸳鸯鸭MHC-Ⅰα链基因与GenBank登录的其它品种的鸭MHC-Ⅰα链核苷酸同源性为89.4%～91.0%,与人和其他动物的MHC-Ⅰα链胞外区成熟肽基因的氨基酸同源性为11.1%～79.3%,表明MHC-Ⅰα链胞外区成熟肽基因存在着种的多样性,且亲缘关系越近,同源性越高.鸳鸯鸭MHC-Ⅰα链胞外区成熟肽基因的成功克隆为进一步研究鸭MHC-Ⅰ基因表达、生物学活性和应用奠定基础. 相似文献
7.
β2微球蛋白（β2m）是组成主要组织相容性复合体（MHC）Ⅰ类分子复合体的轻链分子,对于MHCⅠ类分子在细胞表面稳定表达和有效递呈抗原肽必不可少。本试验从来航鸡全血细胞中克隆了鸡β2m（Chβ2m）全基因,利用软件预测了其信号肽序列,并构建了表达成熟Chβ2m的重组载体,在大肠杆菌表达系统中以包涵体形式高效表达。将所得包涵体溶于8 mol/L脲,并在变性条件下对包涵体中的重组Chβ2m进行纯化,获得了高纯度的Chβ2m,为制备MHCⅠ四聚体及探索禽类MHCⅠ类分子结构与功能的关系提供了条件。 相似文献
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鸡MHCⅠ类分子信号肽的预测及其序列特征 《畜牧与饲料科学》2015,36(12):1-1
旨在进一步研究MHCⅠ类分子作用机制,分析MHCⅠ类分子α链和β2m链的信号肽序列特征。运用信号肽分析软件预测淮南麻黄鸡MHCⅠ类分子的α链和β2m链信号肽区域,通过序列比对,进一步分析鸡MHCⅠ类分子2条链的序列特征。信号肽分析软件预测结果表明,鸡MHCⅠ类分子的α链和β2m链均存在信号肽,且均由21个氨基酸残基组成。序列分析结果表明,鸡MHCⅠ类分子β2m链信号肽区域的氨基酸序列较为保守,但α链信号肽区域则呈现出一定的多态性,有23.8%的氨基酸残基发生突变。此外,将鸡MHCⅠ类分子信号肽序列与鸭、人和鼠的相应区域进行比对,表明鸡与鸭的α链和β2m链分子信号肽相似性均较高,分别为60%和65%,但与人和鼠的相似性均较低。 相似文献
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《黑龙江畜牧兽医》2017,(17)
为了研究新疆哈萨克绵羊主要组织相容性复合体(MHC)Ⅰ类分子基因序列的多态性,采用PCR和测序的方法分别克隆新疆哈萨克绵羊MHCⅠ类分子基因重链和轻链的c DNA全长,并进行生物信息学分析。结果表明:成功扩增出新疆哈萨克绵羊MHCⅠ类分子基因重链、轻链,大小分别为1 107 bp、357 bp;通过生物信息学软件预测蛋白质分子质量分别为90 ku和29.694 ku;等电点(p I)分别为5.00,5.23;重链富含G、C碱基,有两段跨膜螺旋,最大疏水指数为3.622,最小疏水指数为-2.922,预测整条肽链表现为亲水性,在1~84位碱基之间存在信号肽;轻链四种碱基含量基本一致,也有两段跨膜螺旋,在1~63位碱基之间存在信号肽。新疆哈萨克绵羊MHCⅠ类分子基因编码蛋白质的二级结构以无规则卷曲元件的含量最高,该蛋白质的三级结构由一条α链,另一条为β链通过非共价键组成,由α1、α2组成抗原结合槽;NCBI数据库中不同地区的哈萨克绵羊的MHCⅠ类分子基因的同源性在89.87%~99.91%之间,与数据库中牛的MHCⅠ类分子基因同源性达到了98.88%,轻链MHCⅠ类分子基因还与猪和人的同源性相对较高。 相似文献
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《中国畜牧兽医》2016,(8)
为进一步研究主要组织相容性复合体Ⅰ类(major histocompatibility complex,MHCⅠ)分子在免疫应答中的作用机制,试验经PCR克隆获得MHCⅠα和β_2m链基因,随后插入带有荧光标签蛋白的真核表达载体,成功构建了重组质粒pEGFP-MHCⅠα和pmCherry-MHCⅠβ_2m,并通过脂质体法转染293T真核表达细胞。荧光显微镜观察可见,MHCⅠα和β_2m分子主要分布于真核细胞的内膜系统,改变了与之融合的荧光蛋白在细胞内的定位。此外,Western blotting检测可见大小约68.3和41.3ku的目的蛋白反应带,表明重组质粒能够在293T细胞中顺利表达,且表达蛋白与鸡MHCⅠ类分子的相应抗体可发生特异性结合反应,具有良好的免疫学活性。 相似文献
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从鸡脾脏中提取总 RNA,以总RNA为模板,5’-ATC TAG AGG TAC CGG ATC C-(T)15-3’为反转录引物,采用TaKaRa AMV反转录酶合成First-strand cDNA (fcDNA)。根据GenBank中登录的鸡的BF2基因胞外区序列,设计了含EcoRⅠ和 HindⅢ 酶切位点的2对引物,分别扩增鸡BF2的胞外区基因。PCR产物经纯化回收后,插入到含LacZ基因的原核克隆载体pGEM-T Easy中,转化至大肠杆菌JM109感受态细胞,经EcoRⅠ和Hind Ⅲ双酶切及PCR鉴定,筛选出阳性克隆。再把所克隆的片段亚克隆到表达载体pMAL-p2X vector,构建重组质粒p2X/BF2（1-5）。将重组表达质粒转化入大肠杆菌TB1感受态细胞,筛选阳性克隆,经IPTG诱导表达后,进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析。结果表明,本研究克隆了5类鸡BF2的胞外区基因序列,试验结果证明本研究已成功克隆并可溶性表达了5类BF2胞外区蛋白质分子,全长约807~819 bp,编码约269~273个氨基酸。采用淀粉树脂柱亲和层析和DEAE凝胶过滤方法对表达产物进行了纯化,并对纯化的表达产物进行了western blot鉴定。本研究为进一步利用BF2的胞外区在体外构建MHC Ⅰ类分子结合筛选抗原表位肽平台奠定了基础。 相似文献
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SOE PCR重构SLA-Ⅰ复合体研究 总被引：2，自引：0，他引：2
利用剪接重叠延伸PCR(SOE PCR)技术,中间加一富含甘氨酸/丝氨酸的linker(G4S)3,将SLA-Ⅰ重链基因SLA-2和轻链基因β2m连接,形成复合体基因链SLA-2-(G4S)3-β2m,然后将复合体基因链克隆入p2X表达质粒,导入受体菌TB1并进行表达。结果显示,利用SOE PCR技术成功得到了复合体基因链SLA-2-(G4S)3-β2m,并且克隆入p2X载体。SDS-PAGE检测表明,复合体基因导入宿主菌后获得了融合蛋白MBP-SLA-2-(G4S)3-β2m,大小为84.1 ku。试验结果为今后在体外进行相关基因重组表达提供参考。 相似文献
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根据GenBank中登录（登录号：AB115244）的鸭MHC-Iα链序列设计并合成1对引物,采用RT-PCR技术从鸳鸯鸭脾脏组织中克隆出鸳鸯鸭MHC-Iα链基因,并进行T-A克隆和序列测定。结果表明,所获得的鸳鸯鸭MHC-Iα链基因长909 bp,编码303个氨基酸的多肽,含一个完整的鸳鸯鸭MHC-Iα链胞外区成熟肽基因。序列比较发现,鸳鸯鸭MHC-Iα链基因与GenBank登录的其它品种的鸭MHC-Iα链核苷酸同源性为89.4%～91.0%,与人和其他动物的MHC-Iα链胞外区成熟肽基因的氨基酸同源性为11.1%～79.3%,表明MHC-Iα链胞外区成熟肽基因存在着种的多样性,且亲缘关系越近,同源性越高。鸳鸯鸭MHC-Iα链胞外区成熟肽基因的成功克隆为进一步研究鸭MHC-I基因表达、生物学活性和应用奠定基础。 相似文献
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根据基因库中鸡β-防御素Gal-6cDNA基因序列设计2对引物,应用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,从安徽三黄鸡白细胞RNA中扩增了β-防御素Gal-6cDNA基因片段。得到了大小为250bp片段。将扩增产物纯化并克隆到PGEM-T-Easy载体上,转化感受态细胞DH-5α,经筛选获得重组质粒并测序,用P3/P4引物从重组质粒中扩增出成熟肽,大小约150个bp。测序后Blast分析表明,安徽三黄鸡序列与基因库上已发表的序列相差一个碱基,Gal-6多肽共有67个氨基酸组成,分别是20个氨基酸残基的信号肽、5个氨基酸的原片段、42个氨基酸的成熟肽。 相似文献
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本试验从鸡的肝脏中提取总RNA,根据GenBank公布的鸡β-防御素Gallinacin-8(简称gal-8)基因序列设计2对引物,运用RT-PCR技术扩增出大小为20lbp的鸡β-防御素gal-8的基因片段.通过序列分析得知其由66个氨基酸组成,包括20个氨基酸残基的信号肽、5个氨基酸的原片肽及41个氨基酸的成熟肽.BLAST分析表明与GenBank中已公布的序列相比较缺失2个碱基,其同源性达到98%.将该基因克隆进pGEM-T Easy载体中,并转化大肠杆茵感受态DH5α,经筛选和测序鉴定获得了阳性重组质粒.从重组质粒中扩增出的成熟肽,大小约123 bp.试验为进一步构建重组核蛋白及表达具有广谱抗微生物活性的防御素提供了实验基础. 相似文献
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典型的主要组织相容性复合体(MHC)是抗原递呈的关键分子,具有重要的免疫功能,与多种疾病密切相关。为深入了解地方品种鸡MHCⅠ类α分子的特征,尤其是抗原结合区域的特点,通过RT-PCR技术获得了29个淮南麻黄鸡完整的α链基因,并进行了分析。结果显示,淮南麻黄鸡MHCⅠα分子高度多态,但主要集中在α1和α2区域,该区变异氨基酸位点共68个,其中高度变异22个。淮南麻黄鸡MHCⅠ分子α1和α2区域氨基酸序列同源性介于79.3%~99.5%之间,仅少部分序列完全一致。鸡氨基酸序列同源性与鸭较高,介于57.6%~64.1%之间;其次为人和鼠。进化分析显示,淮南麻黄鸡MHCⅠ分子α1和α2区域分属于两个类群,但未显示明显的品种差异。此外,鸡与鸭的亲缘关系较近,与其他物种则遗传距离较远。研究结果表明,淮南麻黄鸡MHC分子在进化过程中呈现高度的多态性,但受到病原体的选择压力,多态性主要位于抗原肽结合部分的α1和α2区域。 相似文献
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《畜牧兽医学报》2015,(7)
猪主要组织相容性复合体Ⅰ类分子又称猪白细胞抗原Ⅰ类分子(SLA-Ⅰ),参与内源性抗原在体内的递呈过程,其结构包括重链(α链)和轻链(β链)两部分。本研究首先采用RT-PCR从原代猪肺泡巨噬细胞(PAM)中扩增出SLA-Ⅰα链胞外区基因和β链基因;继而利用原核表达系统获得包涵体形式表达的SLA-Ⅰα链胞外区和β链重组蛋白质;将目的重组蛋白质洗涤、复性、纯化后,经Western blot及质谱技术进行验证。以纯化的重组蛋白质免疫兔制备抗血清,经间接ELISA检测其效价达1∶256 000。以制备的抗血清进行Western blot和间接免疫荧光试验,结果显示,所制备的抗血清能够特异性地识别原代及传代PAM表达的SLA-Ⅰα链及β链蛋白。研究结果不仅为SLA-Ⅰ类分子的功能研究提供了有用的分析试剂,也为病毒感染的免疫机制研究奠定了必要的基础。 相似文献
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为了构建山地乌骨鸡β防御素Gal-2基因酵母表达载体,试验根据GenBank中鸡β防御素Gal-2基因序列设计引物,采用RT-PCR技术从山地乌骨鸡骨髓细胞中扩增出Gal-2基因,经PCR和酶切鉴定后测序,并采用DNAStar软件进行生物信息学分析;再根据毕赤酵母偏爱密码子和山地乌骨鸡β-防御素Gal-2成熟肽编码基因序列设计并合成1对引物,采用PCR技术从重组质粒pMD18-T-Gal-2扩增出其成熟肽编码基因,并将其插入载体pPICZaA,构建重组质粒pPICZaA-Gal-2,将pPICZaA-Gal-2线性化,通过电击转入毕赤酵母菌株GS115,用1%甲醇诱导表达120 h,表达产物纯化后进行Tricine-SDS-PAGE电泳鉴定。结果表明:山地乌骨鸡β防御素Gal-2基因克隆成功;山地乌骨鸡β-防御素Gal-2成熟肽编码基因重组真核表达载体构建成功;山地乌骨鸡Gal-2基因在酵母中得到表达。 相似文献
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从鸡脾脏中提取总 RNA,以总RNA为模板,5’-ATC TAG AGG TAC CGG ATC C-(T)15-3’为反转录引物,采用TaKaRa AMV反转录酶合成First-strand cDNA (fcDNA)。根据GenBank中登录的鸡的BF2基因胞外区序列,设计了含EcoRⅠ和 HindⅢ 酶切位点的2对引物,分别扩增鸡BF2的胞外区基因。PCR产物经纯化回收后,插入到含LacZ基因的原核克隆载体pGEM-T Easy中,转化至大肠杆菌JM109感受态细胞,经EcoRⅠ和Hind Ⅲ双酶切及PCR鉴定,筛选出阳性克隆。再把所克隆的片段亚克隆到表达载体pMAL-p2X vector,构建重组质粒p2X/BF2（1-5）。将重组表达质粒转化入大肠杆菌TB1感受态细胞,筛选阳性克隆,经IPTG诱导表达后,进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析。结果表明,本研究克隆了5类鸡BF2的胞外区基因序列,试验结果证明本研究已成功克隆并可溶性表达了5类BF2胞外区蛋白质分子,全长约807~819 bp,编码约269~273个氨基酸。采用淀粉树脂柱亲和层析和DEAE凝胶过滤方法对表达产物进行了纯化,并对纯化的表达产物进行了western blot鉴定。本研究为进一步利用BF2的胞外区在体外构建MHC Ⅰ类分子结合筛选抗原表位肽平台奠定了基础。 相似文献