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1.
为能够用实时荧光定量PCR检测PrP106-126作用的鼠巨噬细胞细胞因子的表达水平,构建目的基因IL-1β、TNF-α、IL-6和内参基因β-actin的标准品质粒和标准曲线。根据GenBank中鼠基因编码区保守序列,设计特异性引物;细胞经PrP106-126作用后,提取总RNA。经反转录、PCR扩增、纯化、连接和转化后,提取质粒并测序鉴定,获得IL-1β、TNFα-、IL-6和β-actin质粒;将质粒梯度稀释,进行荧光定量PCR,获得标准曲线及回归方程。结果显示,产物溶解曲线峰值单一,引物特异性高;标准曲线相关系数r2=0.999,表明线性关系好,成功构建了目的基因和内参基因的标准品质粒和标准曲线。 相似文献
2.
采用PCR方法克隆了鹅生长激素受体（GHR）基因,构建了重组质粒pMD-18T-GHR,并将其作为标准阳性模板。通过对反应条件进行优化,以定量的10倍系列稀释的质粒pMD-18T-GHR为标准品进行荧光定量PCR扩增,建立了检测GHR的荧光定量PCR方法。结果显示,该方法构建的标准曲线线性关系良好,建立的GHR基因荧光定量PCR检测方法灵敏度高、特异性强（可以检测出低于10个拷贝／μL的样品）,准确可靠。籽鹅和莱茵鹅GHRmRNA出壳到90日龄生长过程中肝脏中的表达量不同,30日龄不同组织表达量各有变化特点。 相似文献
3.
利什曼原虫实时荧光定量PCR方法的建立 总被引：1，自引：0，他引：1
以利什曼原虫的小环状动基体DNA(Leishmaniak DNA)为靶基因,建立实时荧光定量PCR检测利什曼原虫的方法。根据GenBank报道的利什曼原虫小环状动基体DNA保守序列设计合成特异性引物,经PCR扩增后与pMD18-T载体连接,转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞。挑选阳性克隆重组质粒经鉴定正确后,作为模板建立SYBR-GreenⅠ荧光定量PCR标准曲线和熔解曲线。结果构建的标准曲线线性关系良好,相关系数为0.996,而且特异性强,重复性好。本研究成功建立了实时荧光定量PCR检测利什曼原虫的方法,该方法可用于利氏曼原虫病的诊断、流行病学监测和科学研究。 相似文献
4.
采用PCR方法克隆了鹅生长激素受体(GHR)基因,构建了重组质粒pMD-18T-GHR,并将其作为标准阳性模板.通过对反应条件进行优化,以定量的10倍系列稀释的质粒pMD-18T-GHR为标准品进行荧光定量PCR扩增,建立了检测GHR的荧光定量PCR方法.结果显示,该方法构建的标准曲线线性关系良好,建立的GHR基因荧光定量PCR检测方法灵敏度高、特异性强(可以检测出低于10个拷贝/μL的样品),准确可靠.籽鹅和莱茵鹅GHRmRNA出壳到90日龄生长过程中肝脏中的表达量不同,30日龄不同组织表达量各有变化特点. 相似文献
5.
《中国动物传染病学报》2017,(3)
分别根据猪血清淀粉样蛋白3(serum amyloid A3,SAA3)基因序列以及猪三磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)基因全长序列设计特异性扩增引物,进行PCR扩增,并将PCR扩增片段连接至相应载体上构建重组质粒。两个重组质粒经测序鉴定和纯化后,倍比稀释作为标准曲线样品,用于实时荧光定量PCR中SAA3、GAPDH标准曲线的制备,并进行反应的灵敏性、特异性和重复性检测。结果显示,标准曲线线性关系R2均在0.98以上;特异性检测显示该引物可以特异性检测到猪SAA3、GAPDH扩增曲线;组内和组间变异系数均小于5%,说明本研究成功建立猪SAA3的荧光定量PCR检测方法。运用建立的荧光定量RT-PCR对正常以及感染猪繁殖与呼吸综合征病毒的肺泡巨噬细胞和猪组织进行检测,可检测到猪SAA3的表达,正常组与接毒组之间显示出明显的表达差异。本研究初步建立了检测猪SAA3基因的SYBR Green荧光定量RT-PCR的方法,为后续对猪传染性疾病与猪SAA3之间相互关系的研究提供了一种特异、灵敏的检测方法。 相似文献
6.
用PCR方法扩增出鸡减蛋综合征病毒（EDSV）Hexon基因保守片段,经琼脂糖凝胶电泳及序列测定分析扩增产物的特异性。以构建的阳性重组质粒作为标准品,建立SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR反应的扩增曲线和溶解曲线,并绘制标准曲线。结果表明,建立的EDSV荧光定量PCR标准曲线Ct值与1×10^1～1×10^6拷贝/μL的基因拷贝数呈现良好线性关系,灵敏度可达10拷贝,且特异性及重复性良好;说明本试验建立的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法可用于EDSV的诊断及病原的定量分析。 相似文献
7.
根据猪源干扰素刺激基因PPBP(pro-platelet basic protein)基因全长序列,使用引物设计软件Primer Premier5.0设计合成特异性引物,经过PCR扩增,将基因扩增的片段连接到相应的载体上,成功构建重组质粒p3XFLAG-CMV-7.1-PPBP。重组质粒经过筛选、鉴定以及纯化后,经10倍系列稀释作为质控样品,用于实时荧光定量PCR中PPBP标准曲线的构建,并检测重复性、灵敏性和特异性。结果显示标准曲线线性关系R20.99;特异性试验中也能检测到PPBP扩增曲线;组间和组内变异系数均小于5%。使用建立的SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR检测PRRSV感染组织和未感染组织中PPBP的表达情况,能够检测出组织中PPBP的含量存在差异。本研究初步建立了检测猪PPBP基因的SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR的方法,为后续猪传染性疾病和猪PPBP之间相互关系的研究提供一个特异灵敏的检测和手段。 相似文献
8.
试验旨在建立一种非洲猪瘟病毒（ASFV）的荧光定量PCR检测方法,根据ASFV P72基因核苷酸序列,通过基因克隆技术在质粒载体中克隆一段ASFV P72基因片段,设计一对特异性引物以及探针,通过带有基因序列的重组质粒绘制曲线,构建了一种ASFV荧光定量PCR检测手段。结果显示,该方法具有较高的敏感度,标准曲线线性关系较好,相关系数达到0.999 8,重复性较佳,变异系数小;且以其他疾病核酸为模板均未出现扩增曲线,特异性较好。研究表明,该荧光定量PCR方法能够为ASFV的检测提供帮助。 相似文献
9.
本研究旨在建立一种能够快速、简便、灵敏地检测猪星状病毒的基于SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。根据已报道的猪星状病毒ORF2基因序列,设计并合成1对引物,通过PCR扩增ORF2基因片段,将测序正确的ORF2基因片段克隆入pMD18-T载体,转化大肠杆菌DH5α,经测序鉴定后得到阳性重组质粒,作为标准品模板建立SYBR GreenⅠ荧光定量PCR标准曲线和熔解曲线,并对其灵敏性、特异性和重复性进行验证。结果表明,猪星状病毒荧光定量PCR的标准曲线Ct值与模板浓度呈良好的线性关系,熔解曲线特异,灵敏度可达1×101拷贝,是普通PCR检测方法的100倍,特异性和重复性较好。本次建立的猪星状病毒荧光定量PCR检测方法具有快速、简便、敏感等优点,有重要的实用价值。 相似文献
10.
为了更加精确地对鲤春病毒(Spring viremia of carp virus,SVCV)进行定量检测,试验以Taq Man探针法为基础,提取鲤春病毒总RNA,反转录为cDNA后进行PCR扩增,得到目的条带并回收,将目的片段与pMD18-T载体连接导入大肠杆菌DH5α感受态细胞中,提取质粒并进行实时荧光定量RT-PCR测定,利用反应得到的Ct值与各浓度梯度质粒模板拷贝数的对数值绘制标准曲线。结果表明:以鲤春病毒cDNA为模板进行PCR扩增,获得清晰的目的条带,与预期相同;对鲤春病毒G蛋白重组质粒进行实时荧光定量RT-PCR扩增,所得扩增曲线有较好的重复性,各浓度梯度扩增曲线有明显的规律性,低浓度质粒模板扩增明显;获得的标准曲线有明显的线性关系,曲线回归系数为0.992。说明实时荧光定量RT-PCR方法敏感性较高、稳定性好、可靠精确,可以作为鲤春病毒检测的定量方法。 相似文献
11.
《中国动物传染病学报》2016,(3)
本研究针对猪GLRX1设计特异性引物,将PCR扩增片段分别连接至T-easy载体上构建重组质粒,经筛选、鉴定纯化后,10倍梯度稀释作为质控样品,用于实时荧光定量PCR中GLRX1标准曲线的构建,并进行反应的灵敏性、特异性和重复性试验。结果显示标准曲线线性关系R2值均在0.99以上;特异性结果表明只能检测到猪GLRX1扩增曲线;组内和组间变异系数均小于5%。本研究初步建立了检测猪GLRX1基因的SYBR Green荧光定量RT-PCR的方法,为后续对猪传染性疾病与猪GLRX1之间相互关系的研究提供了一种特异、灵敏的检测方法。 相似文献
12.
牛支原体TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立 总被引：1，自引：0，他引：1
《中国兽医学报》2017,(6):1059-1064
本研究旨在建立一种快速检测牛支原体(Mycoplasma bovis)的实时荧光定量PCR检测方法。根据GenBank中收录的牛支原体OPPD/F基因序列(登录号:AF130119),利用Primer 5.0软件设计特异性引物与TaqMan探针,以重组质粒作为绝对定量模板,构建检测牛支原体的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。结果显示该检测方法线性关系良好,标准曲线的相关系数R2=0.994,扩增效率E=1.280。荧光定量PCR法检测的敏感性是常规PCR的10倍;特异性良好,检测9种相关细菌和病毒均为阴性;重复性好,组内及组间样本检测Ct值均小于2%。牛支原体TaqMan实时荧光定量PCR检测方法较之于常规PCR方法有快速、特异性强、敏感性高、稳定性好的优点。 相似文献
13.
《中国兽医学报》2020,(3)
根据TBEV NS5基因序列设计特异性引物,构建标准品,优化荧光定量PCR的反条件和反应体系,将标准品按10~(8 )～10~1拷贝/μL梯度稀释,建立标准曲线。同时分析其敏感性和特异性,并对155份牛血清样品进行检测验证。结果显示,建立了TBEV基于SYBR GreenⅡ荧光定量PCR的检测方法。标准曲线在8个浓度梯度间呈现良好的线性关系,扩增效率为97%,组间和组内变异系数均低于2%且无非特异杂峰。敏感性检测显示,荧光定量检测下限为10~1拷贝/μL,灵敏度比半巢式PCR高10倍。该方法对LCMV、SFTSV及TBEV毒株进行检测,仅TBEV出现特异性扩增。临床样品检测结果显示,荧光定量PCR检出TBEV阳性率为14.2%,比半巢式PCR检测阳性率提高了5.2%,两者检测一致率为63.6%。结果表明,成功建立TBEV基于SYBR GreenⅡ荧光定量PCR的检测方法,为蜱传病防控奠定基础。 相似文献
14.
15.
《中国兽医杂志》2019,(9)
根据GenBank中穴兔Keap1基因序列设计了特异性引物,经PCR扩增,从新西兰兔肝脏中扩增出Keap1基因的C端并连接至T载体上,获得重组质粒pMD-19T-Keap1C。以重组质粒作为质控标准品,通过标准曲线构建、敏感性、特异性和重复性检验,建立了检测兔Keap1基因的实时荧光定量PCR方法,并分析了Keap1基因mRNA在兔各组织中的表达差异。结果显示,Keap1基因检测的Ct值与标准品呈良好的线性关系,扩增效率为103%,R~20.99。利用建立的实时荧光定量PCR方法对新西兰兔各组织中Keap1基因mRNA表达水平进行检测,结果显示,Keap1基因在脑、心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏中均有表达,且肝脏中表达量最高,脾脏中表达量最低。本试验建立了兔Keap1基因的荧光定量PCR方法并检测了其mRNA在兔各组织中的表达情况,为后续开展兔Keap1-Nrf2-ARE信号通路的研究奠定了基础。 相似文献
16.
目的:应用SYBR G reen I染料法建立检测Mad2 mRNA表达的实时荧光定量PCR的方法,并探讨小鼠卵母细胞减数分裂成熟中Mad2 mRNA的表达。方法:采用实时荧光定量PCR的方法,以SYBR G reen I为荧光染料,梯度稀释的重组质粒为模板制作标准曲线,并以此方法分析了小鼠卵母细胞减数分裂成熟过程中Mad2 mRNA表达的动态变化。结果:建立了实时荧光定量检测方法分析小鼠卵母细胞中Mad2 mRNA的表达,该方法灵敏、特异,扩增效率接近100%。进行了标准曲线的制作,以及对目的基因Mad2转录水平的绝对定量。结论:实时荧光定量PCR是检测基因表达水平的理想选择,在小鼠卵母细胞减数分裂成熟过程中Mad2 mRNA表达存在动态变化。 相似文献
17.
《中国兽医杂志》2015,(1)
根据Gen Bank中龚地弓形虫529 bp重复序列设计引物,以弓形虫RH株基因组DNA为模板,常规PCR扩增出长度212 bp的特异性保守序列,将其克隆到p GEM-T Easy载体中构建重组质粒标准品;以10倍倍比稀释的质粒标准品为模板,进行SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR扩增并制作标准曲线,建立弓形虫荧光定量PCR检测方法。将该方法用于临床病死猪的弓形虫检测。结果表明:用重组质粒制作的标准曲线循环阈值与模板浓度有良好的线性关系,溶解曲线特异相关系数0.997,平均试验间变异系数2.30%,能检出约0.05个速殖子;检测弓形虫YZ-1株与YZ-2株均为阳性,而检测水牛梭形肉孢子虫、犬等孢球虫、柔嫩艾美耳球虫基因组DNA均为阴性;检测24头病死猪,弓形虫阳性率为70.8%,略高于常规PCR方法的检出率(66.7%),但检测的69个组织样品中,荧光定量PCR方法的检出率(50.7%)明显高于常规PCR方法的检出率(34.8%)。 相似文献
18.
为了建立基于SYBR Green Ⅰ的快速检测副猪嗜血杆菌(HPS)的实时荧光定量PCR方法,参照GenBank公布的HPS的infB基因序列(DQ:781933.1),设计特异性引物;提取HPS基因组,进行PCR扩增,回收目的片段;构建阳性标准模板,建立标准曲线;验证其敏感性、重复性和特异性。结果显示,本试验得到了阳性标准质粒,并建立了标准曲线,线性关系在102copies/μL～108copies/μL检测范围内良好;该方法敏感性达到10copies/μL,比常规PCR高100倍,重复性试验变异系数均小于2.5%,同时对HPS具有良好的特异性。结果表明,本试验建立的副猪嗜血杆菌SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法可用于临床对HPS的快速诊断和定量检测。 相似文献
19.
《中国动物传染病学报》2017,(5)
根据鼠轮状病毒(Murine rotavirus,MRV)EB-C8/G16P毒株VP1基因(GenBank登录号:KJ477127.1),设计引物和Taq Man探针,确定标准曲线,建立MRV荧光定量PCR方法,检测其特异性、敏感性和稳定性。结果显示,建立的MRV荧光定量PCR方法标准曲线的线性关系良好,R2值可达0.99;最低可检测到10 copies/μL,是常规PCR的100倍;与常见的小鼠病毒株均无特异性扩增;批内和批间变异系数均小于2%,表明该方法重复性好。将建立的荧光定量PCR初步对246份小鼠肠道样品病料进行检测,结果均为阴性。本研究建立的MRV荧光定量PCR方法特异性、灵敏性良好,可为鼠轮状病毒的流行病学调查、检测以及制定国家标准和地方标准提供可靠的数据和适用的监测方法。 相似文献
20.
为建立一种快速、特异的Ⅰ型鸭肝炎病毒（DHV-Ⅰ）SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法,根据GenBank已登录的DHV-Ⅰ型疫苗株C80（DQ864514.3）的非编码区基因序列设计1对特异性引物,经RT-PCR扩增出230bp的靶序列,并克隆到pMD18-T载体上,构建重组质粒;将纯化的重组质粒10倍梯度稀释后作为标准阳性模板,进行SYBR GreenⅠ荧光定量PCR扩增并建立标准曲线,对其敏感性、特异性和重复性进行评价。结果显示,建立的标准曲线的循环阈值与模板浓度呈现良好的线性关系（R2=0.998 2）,产物Tm值为87.2～87.9℃,检测灵敏度为71.5拷贝/μL。对55份疑似病料进行检测,荧光定量检测48份为阳性,而用常规PCR方法只能检出39份阳性,ELISA方法只检出30份阳性。这表明所建立的DHV-Ⅰ的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法具有特异、灵敏、快速和重复性良好等优点,可用于临床DHV-Ⅰ感染的快速检测,为DHV的分子诊断、流行病学调查及定量分析奠定了基础。 相似文献