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1.
表达短ie-1 dsRNA的转化细胞对家蚕核型多角体病毒的抑制作用 总被引：2，自引：2，他引：0
为了利用RNAi技术提高家蚕对核型多角体病毒(BmNPV)的抗性,根据BmNPV复制必需基因ie-1设计其相应的dsRNA,构建带有ie-1 dsRNA表达盒的转基因载体piggyantiIE-Neo,结果显示:表达短ie-1 dsRNA的稳定转化Bm细胞,对BmNPV的增殖表现出抑制作用,但在病毒感染后期,由于病毒恢复增殖导致RNAi的效果被掩盖。通过反向PCR分析外源DNA片段插入基因组位点,结果显示:在转化细胞中,外源DNA可通过随机整合或按照piggyBac特定的转座位点TTAA插入细胞基因组。 相似文献
2.
dsRNA对家蚕核型多角体病毒复制增殖的抑制效果 总被引：4，自引：4，他引：0
以家蚕核型多角体病毒(BmNPV)复制必需的极早期基因ie-1和细胞释放型病毒CRV入侵关键基因gp64为靶序列,分别人工设计并体外转录出dsRNA I1(438 bp)和dsRNA G1(337 bp),用家蚕培养细胞BmN研究目标dsRNA对BmNPV复制、增殖的抑制效果。结果表明:dsRNA I1能有效地抑制BmNPV在BmN细胞中的增殖,最大抑制效果使培养液中的病毒滴度(TC ID50)比对照降低了104.30倍;dsRNA G1能显著地抑制新形成的病毒粒子的细胞侵染能力,最高可使培养液中的病毒滴度降低103.17倍。 相似文献
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表达短lef-1dsRNA转基因家蚕对BmNPV的抵抗能力与主要经济性状 总被引：1，自引：1，他引：0
为了提高家蚕对核型多角体病毒(BmNPV)的抵抗能力,将带有BmNPV晚期表达因子基因(lef-1)dsRNA表达盒和新霉素抗性基因(neo)表达盒的转基因载体pigA3-LEF-Neo通过精子介导法导入家蚕卵,经G418和GFP双重筛选并结合分子生物学鉴定,证实获得了转基因家蚕。对G6代转基因家蚕2龄幼虫接种BmNPV,结果显示转基因家蚕的死亡率比正常家蚕(对照组)下降了10～30个百分点,表明转基因家蚕对BmNPV的抗性有所提高;对接种BmNPV的5龄转基因家蚕A、B系统的定量PCR检测结果显示,2个系统体内的lef-1 mRNA转录水平比对照组平均降低了72倍和26.5倍,最高下降了104倍,进一步表明表达lef-1 dsRNA的转基因家蚕抑制了BmNPV lef-1基因的表达。转基因家蚕的饲养成绩显示其全茧量、茧层量和茧层率等主要经济性状与正常家蚕无明显差异。 相似文献
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ie-1和lef-1基因dsRNA表达元件转染及转化细胞对家蚕核型多角体病毒增殖的抑制 总被引：3，自引：2，他引：1
通过RNAi介导可以抑制病毒增殖,将相应的RNAi元件通过转基因转入宿主有可能使宿主对病毒产生一定的抗性。根据家蚕核型多角体病毒(BmNPV)基因组中的病毒复制必需基因ie-1、lef-1设计相应的RNA干扰区段,并构建相应的转基因载体转入家蚕BmN细胞中,瞬时表达结果显示转染了转基因RNAi载体的BmN细胞均对BmNPV有一定的抑制作用。IE dsRNA在病毒滴度为10-4时有抑制作用,在病毒滴度为10-5时有比较好的作用;LEF dsRNA则在病毒滴度为10-5时有抑制作用,在病毒滴度为10-6时有较好的抑制作用。通过转基因及G418筛选后,转基因IE dsRNA细胞在病毒滴度为10-4显示出一定的抑制作用,在病毒滴度为10-5表现了明显的抑制作用;而转基因LEF dsRNA细胞在病毒滴度为10-5有一定的抑制作用,但只维持了一个时段。 相似文献
5.
基于探讨利用转基因RNA干涉技术使家蚕获得对核型多角体病毒抗性的目的,将家蚕核型多角体病毒(BmNPV)的DNA聚合酶基因、蛋白激酶(PK1)基因以及bro-d和orf1629基因的部分编码片段,分别以其反向重复的形式与家蚕Actin3启动子连接,构建了基于piggyBac转座子载体的转基因表达载体,通过显微注射于家蚕卵,获得了36~107个G1蛾区,得到了20~23头转基因阳性家蚕。经Southern杂交及RT-PCR分析表明,BmNPV的4个反向重复片段都已经导入家蚕基因组中,并且可以进行转录。攻毒实验结果表明,BmNPV的DNA聚合酶基因和PK1基因反向重复片段对病毒的增殖有抑制作用,从而使家蚕对BmNPV具有一定抗性;而BmNPV的bro-d和orf1629基因反向重复片段对病毒的增殖没有抑制作用。针对特定病毒的转基因RNAi技术有望使家蚕获得对该病毒的抗性。 相似文献
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piggyBac转座子介导的家蚕细胞转基因研究初探 总被引：5，自引：4，他引：1
为探讨稳定转化家蚕细胞表达外源基因的新方法,以家蚕核型多角体病毒(BmNPV)极早期蛋白基因(ie-1)启动子元件驱动新霉素抗性基因(neor),并克隆至具有绿色荧光蛋白基因(gfp)标记的昆虫转座子载体piggyBac中,构建转基因载体pigA3-IE-Neo。以该载体转染家蚕BmN细胞,用终浓度800μg/mL的遗传霉素(geneticin,G418)筛选3个月,获得了稳定转化的细胞,呈现绿色荧光的细胞数达80%以上。通过PCR鉴定证实了细胞基因组DNA中neor基因和gfp基因的存在。 相似文献
8.
家蚕核型多角体病毒(BmNPV)是对养蚕业危害最严重的病原之一,采用传统育种方法培育家蚕抗性品种存在经济性状和抗性呈负相关的矛盾。为了确定转基因方法能否突破该瓶颈,对先前利用家蚕品种大造建立的增量表达内源性抗病毒基因Bmlipase-1的转基因家蚕系统LI-A的主要经济性状进行调查。结果显示,LI-A的4、5龄幼虫逐日体质量及产茧量性状成绩与正常大造之间没有明显的差异,表明转基因抗病毒家蚕系统LI-A在抗性提高的同时,经济性状没有受到影响。 相似文献
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化学诱变的BmNPV对家蚕细胞和虫体感染性的初步研究 总被引：2，自引：0，他引：2
前文报道化学诱变剂对家蚕核型多角体病毒 (BmNPV)多角体形态有明显的诱变作用 ,诱变的BmNPV基因组对某些限制性内切酶的酶切电泳谱发生变化。本文研究进一步表明 :诱变BmNPV感染家蚕Bm N细胞的病变特征与对照相比没有明显不同 ,但形成不定形超大多角体的空斑时间延迟2～ 3d;诱变BmNPV感染家蚕幼虫后 ,病蚕体内各组织病变损害的感染程度 (易感性 )与对照基本相同。研究结果提示 ,诱变的BmNPV对家蚕培养细胞、虫体组织的感染性无显著变化 相似文献
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中国野桑蚕抗病毒蛋白基因(Lipase)的克隆与活性鉴定 总被引：1，自引：0，他引：1
从中国野桑蚕幼虫中肠细胞克隆获得了抗家蚕核型多角体病毒BmNPV的脂肪酶基因(Lipase)cDNA(GenBank:AY945212)。该基因cDNA大小906 bp,编码301个氨基酸,蛋白质分子质量约为28.9 kD。进一步克隆了其全长基因组,结果表明该基因由2 147 bp组成,包含4个外显子和3个内含子。该基因在野桑蚕体内的表达具有组织特异性,仅限于野桑蚕中肠组织表达,且在幼虫龄中表达水平较高,而在幼虫眠期和熟蚕期几乎没有表达。通过基因体外表达获得的重组蛋白Lipase,能够有效抑制BmNPV病毒对家蚕的感染,说明该蛋白具有较强的抗BmNPV的生物学活性。 相似文献
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家蚕脂肪酶Bmlipase-1在家蚕中肠组织特异性表达,具有抵抗家蚕核型多角体病毒(BmNPV)感染的活性。以对BmNPV具有不同抗性水平的6个家蚕品种为材料,利用荧光定量PCR(qRT-PCR)技术,检测Bmlipase-1基因在不同家蚕品种5龄期健康幼虫中肠组织的表达水平及感染BmNPV后的5龄期幼虫中肠组织中该基因的表达水平变化,探究该基因表达水平与家蚕对BmNPV的抗性水平的关系。结果表明:不同家蚕品种间Bmlipase-1的表达水平差异显著,抗性较强的品种,其表达水平较高,6个供试品种5龄幼虫中肠组织中的Bmlipase-1表达水平依次为NIL.LVR>P50>CVDAR18>nsd.NIL>892>306,抗性较强品种NIL.LVR 5龄期的平均表达量约为抗性较弱品种306的8.2倍;BmNPV能够诱导Bmlipase-1的表达,但不同品种间该基因的诱导表达差异显著,仍表现为抗性较强的品种该基因的诱导表达水平较高,NIL.LVR经BmNPV感染诱导后Bmlipase-1在5龄期的平均表达量约为抗性较弱品种306平均诱导表达水平的12.4倍。推测Bmlipase-1的表达水平与蚕体自身对BmNPV的抗性水平有一定的关联性。 相似文献
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为解析家蚕AN品系高抗BmNPV的分子机制,采用家蚕抗性品系AN与易感品种C108杂交及多代回交,结合累代BmNPV攻毒选择,构建了高抗BmNPV的近等基因系C108＿AN;在5龄起蚕经口添食BmNPV多角体1×108 mL-1悬浊液浸渍桑叶对C108及C108＿AN攻毒,对感染后12、24、36、48、60 h的中肠组织进行转录组测序发现,C108＿AN样本中检出BmNPV基因个数与表达量均大幅减少,病毒虽然能够侵染但不能完成复制;转录组中编码230 aa的家蚕病毒核衣壳蛋白基因(命名为BmVNCP)在C108＿AN样本中显著高表达,表明与BmNPV抗性可能具有关联性。在BmN细胞中过表达BmVNCP基因可以抑制BmNPV的增殖,在BmN细胞中进行靶向BmVNCP的CRISPR/Cas9基因编辑,未能观察到BmNPV增殖和vp39基因表达的稳定增加;BmN细胞内过表达BmVNCP基因可以明显提高宿主IMD信号通路中Dredd基因的表达水平,对FADD基因转录水平无影响,PGRP-LB和PGRP-LF基因表达量极低以致qRT-PCR无法检出。... 相似文献
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利用细菌转座子构建适于家蚕的Bac-to-Bac快速基因表达系统 总被引：9，自引：6，他引：3
为了较好地解决家蚕杆状病毒基因表达系统(BmNPV expression system)在重组病毒构建和纯化过程中存在的重组率低、空斑分析技术繁琐、花费时间长等缺点,借鉴国外AcNPV Bac-to-Bac快速基因表达系统工作原理,对家蚕BmNPV基因组进行了改造。通过同源重组的方法,将含有单拷贝数细菌F复制子、插入有细菌转座子整合靶位点、编码LacZα肽的部分DNA片段和抗性选择标记基因的基因片段重组入家蚕BmNPV基因组,替换多角体蛋白基因,获得了家蚕BmNPV病毒穿梭载体BmBacm id;并利用供体质粒上的表达盒和细菌转座子以及细菌转座子的基因定位转移作用,在细菌体内实现外源目的基因向家蚕BmNPV基因组上的转移整合,快速完成重组BmN-PV病毒的构建。 相似文献
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用天然毒素蛋白杀灭害虫是农林病虫害防治的一个重要发展方向。利用家蚕核型多角体病毒(BmNPV)多角体蛋白基因的部分序列与蝎毒素蛋白基因(BmK ITa1)融合表达,SDS-PAGE分析通过融合表达策略构建的含有蝎毒素蛋白基因的重组病毒具有较高的蝎毒素蛋白表达水平,重组病毒vBmBac(polh-)PH5B/35B-BmK ITa1.6His,在家蚕BmN细胞内的BmKITa1蛋白表达水平分别为0.4、0.2 mg/mL。以家蚕和棉铃虫为供试昆虫,探讨融合蝎毒素蛋白的杀虫效果,结果表明:经口添食含融合蝎毒素蛋白的BmN细胞液对不同龄期家蚕幼虫均具有毒性,尤其对低龄幼虫的毒性较强,蚁蚕添食后的死亡率达80%;给1龄期的家蚕和棉铃虫幼虫经口添食含有不同剂量融合蝎毒素蛋白的BmN细胞破碎液,当添食剂量在2.8μg/头时,家蚕的死亡率即达100%,棉铃虫的死亡率达74%。研究结果提示:BmNPV多角体蛋白编码基因的部分序列与蝎毒素蛋白基因融合表达,可提高蝎毒素蛋白的表达水平,且重组病毒表达的蝎毒素蛋白具有较好的杀虫活性,在较低剂量下即可对低龄昆虫产生良好的杀灭效果。 相似文献
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云南蚕区部分家蚕品种资源对BmNPV抵抗性的初步调查 总被引：1，自引：0，他引：1
家蚕核型多角体病毒(BmNPV)是云南蚕区对家蚕危害最严重的病毒病病原。为了筛选对BmNPV具有较强抵抗能力的家蚕品种资源作为抗病育种素材,以云南省保存的18个家蚕品种(品系)为材料,于3龄起蚕经口接种BmNPV,调查不同品种(品系)对BmNPV的抵抗性。不同家蚕品种对BmNPV的抵抗能力存在显著差异,供试品种中云8B的抵抗能力最强,发病率仅为28.9%,而红云B的发病率却高达100%,品种间发病率最大相差71.1个百分点;发病率55%以下的品种多数为日系品种,但品种间发病率最高(红云B)和最低(云8B)的均为日系品种。一些对BmNPV抵抗能力较强的品种全茧量较高,但品种对BmNPV的抵抗能力与全茧量没有严格的相关关系。 相似文献
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利用杆状病毒Bac-to-Bac系统在家蚕表达猪繁殖与呼吸综合征病毒的E蛋白和M蛋白 总被引：2，自引：0，他引：2
猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是一种严重危害养猪业的传染性病原。PRRSV病毒的E蛋白和M蛋白基因是开发PRRSV病毒新型疫苗的目标基因。利用杆状病毒Bac-to-Bac表达系统,将PRRSV病毒的E蛋白和M蛋白的基因亚克隆到杆状病毒转移载体pFastBacHTb中,获得重组转移质粒pFastBacHTb-E和pFastBacHTb-M,转化大肠杆菌Bm DH10 Bac感受态细胞,获得重组杆粒BmNPV Bacmid-E、BmNPV Bacmid-M,将这些重组杆粒转染家蚕培养细胞Bm5,获得重组病毒BmNPV-E和BmNPV-M。将2种重组病毒分别接种5龄起蚕,用SDS-PAGE和Western blotting方法在重组Bacmid DNA转染的Bm5细胞和感染重组病毒的家蚕幼虫血细胞中分别检测到分子质量约20 kD和18 kD的E蛋白和M蛋白,表明PRRSV病毒的E蛋白和M蛋白在家蚕培养细胞及幼虫体内获得了表达,为利用家蚕-杆状病毒表达系统研制PRRSV的新型疫苗与诊断试剂奠定了基础。 相似文献
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为了了解家蚕受BmNPV侵染后中肠蛋白质组变化规律,探讨家蚕抗BmNPV的基因。经过对秋丰、白玉等9个不同系统的家蚕品种抗性比较试验,筛选获得BmNPV感染发病率相差72个百分点的抗性品种P50和感性品种306。采用蛋白质双向电泳技术分析比较了P50和306两品种经口接种BmNPV当天（5龄第1天）的家蚕与第4天（5龄第4天）家蚕的中肠组织蛋白质变化图谱,结果发现这两个品种感染病毒当天各有10个互不相同的特异蛋白斑点,感染第4天后306品种发现33个特异蛋白斑点,P50发现14个特异蛋白斑点,两品种的特异蛋白斑点也各不相同。这些蛋白斑点可能分别与抗性品种的抗性和感性品种的易感性有关。 相似文献
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ie0基因是家蚕核型多角体病毒(BmNPV)的一个晚期基因,该基因编码氨基酸序列的高度保守性及多种结构域提示其在病毒感染过程中的重要性。利用Red同源重组技术,分别对BmNPV ie0基因编码不同结构域的序列以及完整序列进行敲除构建ie0缺失型病毒,以野生型病毒为对照,研究ie0序列完全或部分缺失对病毒转录、复制及对宿主细胞致病能力等方面的影响。结果表明ie0基因完整序列或编码各结构域的序列缺失后均会对病毒产生不同影响:宿主细胞中完全缺失型和部分缺失型病毒滴度均有不同程度降低;完全缺失型和部分缺失型病毒基因组的拷贝数均与野生型病毒无显著差异;部分缺失型病毒的晚期和极晚期基因转录水平变化与ie0基因完全缺失型病毒相一致,均显著低于野生型病毒,并且缺失锌指结构域编码序列的影响最为明显。MTT检测结果也显示ie0基因完全缺失后病毒对宿主细胞的致病能力有所下降。亚细胞定位显示IE0蛋白在细胞质、细胞核中均有分布,但主要位于细胞质。综上所述,ie0基因为BmNPV病毒增殖、基因组复制的非必需基因,但对病毒晚期和极晚期基因的转录具有调控作用,影响最为显著的为锌指结构域的编码序列,且该基因的缺失会导致病毒对宿主细胞的致病能力有所下降。 相似文献
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家蚕丝腺具有高效合成与分泌蚕丝蛋白质的能力,探究利用转基因方法开发家蚕丝腺为生物反应器生产高附加值外源蛋白质的技术途径。将Ⅰ型类人胶原蛋白基因(HCool-Ⅰ)和胶原蛋白羟基化修饰所必需的脯氨酰4-羟化酶α-亚基基因(BmP 4Hα)通过piggyB ac转座子及显微注射方法,同时转入家蚕早期胚胎,在丝素轻链基因fib-L启动子驱动下转入的2个外源基因在家蚕幼虫后部丝腺获得表达。利用反向PCR和生物信息学等方法鉴定、分析转基因家蚕基因组中有19个外源piggyB ac的整合位点,分别位于基因的外显子区域、内含子区域和基因间区,可定位至家蚕的15条染色体上。实时荧光定量PCR检测不同整合位点的转基因家蚕品系幼虫后部丝腺中HCool-Ⅰ基因mRNA转录量存在极显著差异,转录量最高和最低的品系间相差23倍左右;转基因家蚕后部丝腺中BmP 4Hα基因mRNA的转录量比野生型家蚕高出2万多倍。利用SDS-PAGE检测转基因家蚕G3代5龄5 d幼虫的后部丝腺总蛋白质在55 kD和64 kD处分别存在特异性蛋白条带,表明BmP 4Hα和HCool-Ⅰ蛋白已在G3代转基因家蚕丝腺中获得表达。 相似文献