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金黄色葡萄球菌是引起奶牛乳腺炎的主要病原体,因其具有细胞内定殖和对抗生素极易产生耐药性的特点,使得用抗生素治疗的效果越来越差,为此疫苗防治成为首选。黏附素在金黄色葡萄球菌致病过程中起着至关重要的作用,在金黄色葡萄球菌感染的早期,黏附素是最重要的致病因子,只有当金黄色葡萄球菌黏附到宿主细胞上,毒素和荚膜才能开始表达。因此阻断金黄色葡萄球菌感染的初始阶段,特别是阻止细菌黏附到细胞和定殖在黏膜表面,将是预防和治疗奶牛乳腺炎的最有效途径。因此近些年研究者致力于黏附素的结构及功能的研究,试图以黏附素为靶点设计金黄色葡萄球菌疫苗。本研究对近几年黏附素的种类和作用,以及其相关疫苗的研究进行了综述。 相似文献
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为探究治疗奶牛乳腺炎的抗生素替代性生物制剂,研究将前期获得的特异性针对金黄色葡萄球菌毒力因子α溶血素的单链抗体scFvZZ107,在小鼠感染金黄色葡萄球菌乳腺炎模型中验证其保护作用。结果显示,3种不同剂量(5、10、15 μg)单链抗体处理组乳腺组织内细菌数量分别为25.42±1.3、3.33±0.53和4.8±0.78 lgcfu/mg,IL-1α的含量分别为49±7.91、31.37±2.26和57.34±4.48 pg/mL,IL-1β含量分别为40.91±7.39、47.81±4.78和39.2±2.28 pg/mL,IL-8的含量分别为48.64±1.86、41.65±3.07和45.74±1.56 pg/mL,与生理盐水处理组相比,单链抗体中、高剂量处理组乳腺内金黄色葡萄球菌检出量显著减少(P<0.05),且IL-1α、IL-1β与IL-8的含量均显著降低(P<0.05)。通过观察小鼠乳腺组织HE和TUNEL染色情况,与生理盐水处理组相比,scFv中、高剂量处理组乳腺组织更加完整,凋亡细胞的数量也更少,表明scFvZZ107对小鼠乳腺具有良好的保护作用。 相似文献
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不同地区致奶牛乳房炎金葡菌毒力因子的分布 总被引：1，自引：0，他引：1
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,SA)是引起奶牛乳房炎的重要病原,该致病菌主要通过毒力因子刺激乳腺组织引起炎症反应。为研究金黄色葡萄球菌重要毒力因子分布的地域性差异,本试验从上海以及云南的3个奶牛场采集奶样和环境污水,利用PCR技术对70株分离菌株和2株标准菌株进行检测。结果显示,在上海地区分离的18株金黄色葡萄球菌中,有7种毒力基因nuc(94.4%)、FnBPA(77.8%)、Hla(88.9%)、Hlb(94.4%)、ClfA(88.9%)、spa(61.1%)和coa(94.4%)的检出率超过50%;在云南分离到的19株金黄色葡萄球菌中,有8种毒力基因nuc(84.2%)、FnBPA(78.9%)、Hla(100%)、Hlb(78.9%)、ClfA(52.6%)、spa(78.9%)、set1 (57.9%)和coa(84.2%)的检出率超过50%,这说明该8种毒力因子可能是致奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌中主要的毒力因子。 相似文献
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牛金黄色葡萄球菌山东分离株β-溶血素基因的克隆及序列分析 总被引：1，自引：0，他引：1
根据GenBank上发表的金黄色葡萄球菌β-溶血素基因序列,设计了一对特异性引物。提取临床乳腺炎致病性金黄色葡萄球菌山东株zfb的全基因组DNA为PCR模板,扩增β-溶血素基因,将PCR产物纯化后连接到pMD18-T载体中。测序结果表明,扩增片断含有993 bp的ORF,可编码含330个氨基酸和1个终止子的成熟蛋白,与已报道的金黄色葡萄球菌β-溶血素蛋白的氨基酸组成同源性为99.4%。软件分析显示,克隆的金葡菌β-溶血素是一种依赖于金属离子的磷脂酶。上述结果显示,已获得金黄色葡萄球菌β-溶血素基因,为获得重组金黄色葡萄球菌β-溶血素蛋白及对其结构和功能的研究奠定了基础。 相似文献
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【目的】研究奶牛养殖场中金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,SA)的分离效率,快速评估分离株致临床型乳腺炎的风险。【方法】使用葡萄球菌选择培养基结合CHROM SA显色培养基对乳样中的SA进行靶向分离,经斯皮尔曼等级相关系数分析,建立定量测定分泌性溶血素评价SA毒力的方法。【结果】对采集的64份临床型乳腺炎、157份隐性乳腺炎和213份健康乳样进行SA分离,从中分别分离出27株、21株和17株SA菌;对应样本分离株中,溶血素分泌量≥1 500 VH50 U/mL(强毒力)的菌株分别为9株(33.3%)、1株(4.8%)和2株(11.8%)、溶血素分泌量在1 000~1 500 VH50 U/mL(中等毒力)的菌株1株(4.8%)、13株(61.9%)和4株(23.5%)、溶血素分泌量<1 000 VH50 U/mL(弱毒力)的2株(11.8%)、7株(33.3%)和11株(64.7%)。临床型乳腺炎的发生与感染溶血素分泌量≥1 000 VH50 U/mL(中、强毒力)菌株呈正相关(ρ=1,P=0.006 9),与感染溶血素分泌量<1 000 VH50 U/mL(弱毒力)菌株呈负相关(ρ=-1,P=0.10)。【结论】靶向分离方法提高了SA分离效率,可真实反应奶牛养殖场中SA感染率;定量测定溶血素可用于SA毒力评价,根据中、强毒力菌株的感染情况可以初步预测临床型奶牛乳腺炎发生风险,配合临床药物敏感性试验有可能提高SA性临床型乳腺炎的治愈率,减少耐药株的扩散。 相似文献
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金黄色葡萄球菌β溶血素研究进展 总被引：1，自引：0，他引：1
金黄色葡萄球菌β溶血素是一种具有磷脂酶C活性的外毒素,具有白细胞毒性、溶血活性等特征,并且对奶牛乳房炎也具有一定的致病性。因此,β溶血素在免疫预防和细胞生物学领域的研究具有很大的价值。对其理化性质与细胞膜作用机制进行介绍,对其毒力、致病性等最新研究进展进行综述。 相似文献
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金黄色葡萄球菌是引起奶牛乳腺炎的主要致病菌,其表面的纤连素结合蛋白(FnBP)在介导金黄色葡萄球菌侵入寄主细胞的过程中发挥着重要作用.因此,FnBP成为奶牛乳腺炎亚单位疫苗研究中的重要靶标.本研究根据Genbank中纤连素结合蛋白B基因(fnbB)D区编码序列设计引物,以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板,PCR扩增D2-D3区,将该片段回收后与pCAMBIA3301植物表达载体同时进行Nco Ⅰ和Eco 065 Ⅰ(BstEⅡ)双酶切,酶切片段回收后进行连接,将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞,通过菌落PCR、酶切鉴定等方法筛选阳性克隆,将阳性克隆送公司测序确定DNA序列.结果表明,阅读框架正确,氨基酸序列无突变,成功构建金黄色葡萄球菌fnbB基因D2-D3区植物表达载体.该研究为研制奶牛乳腺炎转基因植物口服疫苗奠定了基础. 相似文献
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【目的】分离纯化基因工程重组蛋白金黄色葡萄球菌溶血素(α-hemolysin,α-HL)并检测其生物学活性,为疫苗研发奠定基础。【方法】对含pET32a+-α-HL质粒的BL21(DE3)进行诱导表达,诱导成功后,将重组菌BL21(DE3)培养物用超声波裂解,并用凝胶过滤层析法对该基因工程蛋白进行分离纯化,用Bradford法及兔红细胞分别测定纯化产物的蛋白含量和溶血比活。【结果】纯化产物在SDS-PAGE电泳中53ku处呈现出单一清晰带,达电泳级纯度。纯化产物含量约为0.1277mg/mL,溶血比活为8192HU/mg。【结论】成功获得了金黄色葡萄球菌α-HL,且所获的α-HL具有良好的溶血活性。 相似文献
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牛乳中金黄色葡萄球菌山东分离株(zfb)β-溶血素(h/b)的克隆、表达及溶血活性分析 总被引：1，自引：1，他引：0
[目的]实现牛乳中金黄色葡萄球菌β-溶血素在大肠杆菌中的高效表达,并分析重组β-溶血素的溶血活性.[方法]PCR扩增牛乳中金黄色葡萄球菌山东分离株β-溶血素基因,构建原核表达载体pET32a+/hlb,并在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,用96孔血凝板测定重组蛋白的溶血效价,以血琼脂平板法检测重组蛋白的CAMP反应.[结果]测序结果表明,扩增片段含有993 bp的ORF,可编码含330个氨基酸的成熟蛋白;SDS-PAGE分析重组蛋白表达水平,IPTG诱导后表达的融合蛋白分子量为57 kD,表达量占菌体总蛋白的23.9%;溶血效价分析,金葡菌β-溶血素对绵羊红细胞的溶血效价为278 HU·mg-1,对奶牛红细胞的溶血效价为9×103Hu·mg-1;重组蛋白在血琼脂平板上和无乳链球菌能发生明显的CAMP反应.[结论]成功表达了牛乳中金黄色葡萄球菌β-溶血素,该毒素对奶牛红细胞的溶血活性明显大于绵羊红细胞,显示出牛源金黄色葡萄球菌β-溶血素的特性明显不同于人源金黄色葡萄球菌β-溶血素,为进一步研究其致病与免疫机理、疫苗设计提供了理论基础.此外,重组蛋白还可用来特异性诊断、鉴别无乳链球菌,为兽医临床诊断提供新的方法. 相似文献
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《中国农业科学》2009,42(1):324-330
【目的】实现牛乳中金黄色葡萄球菌β-溶血素在大肠杆菌中的高效表达,并分析重组β-溶血素的溶血活性。【方法】PCR扩增牛乳中金黄色葡萄球菌山东分离株β-溶血素基因,构建原核表达载体pET32a+/hlb,并在大肠杆菌BL21（DE3）中诱导表达,用96孔血凝板测定重组蛋白的溶血效价,以血琼脂平板法检测重组蛋白的CAMP反应。【结果】测序结果表明,扩增片段含有993 bp的ORF,可编码含330个氨基酸的成熟蛋白;SDS-PAGE分析重组蛋白表达水平,IPTG诱导后表达的融合蛋白分子量为57 kD,表达量占菌体总蛋白的23.9%;溶血效价分析,金葡菌β-溶血素对绵羊红细胞的溶血效价为278 HU?mg-1,对奶牛红细胞的溶血效价为9×103 HU?mg-1;重组蛋白在血琼脂平板上和无乳链球菌能发生明显的CAMP反应。【结论】成功表达了牛乳中金黄色葡萄球菌β-溶血素,该毒素对奶牛红细胞的溶血活性明显大于绵羊红细胞,显示出牛源金黄色葡萄球菌β-溶血素的特性明显不同于人源金黄色葡萄球菌β-溶血素,为进一步研究其致病与免疫机理、疫苗设计提供了理论基础。此外,重组蛋白还可用来特异性诊断、鉴别无乳链球菌,为兽医临床诊断提供新的方法。 相似文献
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金黄色葡萄球菌粘附素Fnbp A功能区基因的克隆和原核表达 总被引：1，自引：0，他引：1
【目的】克隆和表达奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌纤连蛋白连接蛋白A(Fnbp A)的功能基因。【方法】采集奶牛急性乳腺炎乳样,分离金黄色葡萄球菌,提取其DNA作为模板,利用设计合成的特异性引物,对金黄色葡萄球菌进行FnbpA功能基因的PCR扩增。回收目的基因并连接到T载体,鉴定后进行测序,然后将FnbpA基因连接到pET-32a(+)质粒中,经鉴定后转化大肠杆菌BL21感受态细胞,IPTG诱导后采用SDS-PAGE分析蛋白质的表达情况。【结果】PCR产物经电泳成像,仅金黄色葡萄球菌在1.7 kb处出现特异性条带,测序发现其与GenBank公布的FnbpA序列的同源性为98%;蛋白诱导表达SDS-PAGE分析发现,在80 ku处出现特异性条带。【结论】试验成功地克隆到FnbpA基因,并在大肠杆菌中获得高效表达,蛋白量为33.4%,为进一步研究金黄色葡萄球菌粘附素基因工程疫苗奠定了基础。 相似文献
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金黄色葡萄球菌分泌的α-溶血素是导致肺炎的重要致病因子。为进一步研究金黄色葡萄球菌α-溶血素(α-hla)的分子致病机理以及对其进行免疫预防,对α-hla第35位氨基酸进行了定点突变。用聚合酶链式反应(PCR)技术,从S.aureus wood46株基因组中扩增出α-hla基因,再利用重叠延伸PCR技术,将第35位带正电荷的组氨酸(密码子为CAC)突变为非极性的亮氨酸(密码子为CTC)。hlaH35L基因测序结果显示第35位的组氨酸突变为亮氨酸,构建的重组表达质粒pET-28a-c(+)/hla和pET-28a-c(+)/hlaH35L在E.coli BL21(DE3)中得到表达,重组蛋白α-Hla及hlaH35L大小均为33.4 kDa,α-Hla引起兔红细胞溶血,hlaH35L未引起兔红细胞溶血。成功表达并获得了失去溶血毒性的重组蛋白hlaH35L。 相似文献
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[目的]牛角地黄汤是中国传统医学中用于清热解毒凉血化瘀的基础方剂,由水牛角、地黄、赤芍、丹皮、钩藤等主要成分组成。本研究旨在研究分析牛角地黄汤及方剂中主要成分对金黄色葡萄球菌α-溶血素诱导兔红细胞溶血作用的影响。[方法]将牛角地黄汤水煎剂及其各单味中药的水煎剂分别与金黄色葡萄球菌溶血毒素作用不同时间后检测溶血活性。[结果]研究发现,无论与溶血素同时给药或是在溶血素染毒之前给药,亦或是与溶血素预先单独作用一段时间后再给药,牛角地黄汤煎剂均能抑制α-溶血素致兔红细胞破裂的溶血作用。同时还发现,方剂中的赤芍和丹皮水煎液对溶血素破坏兔红细胞致溶血的活性抑制作用最为明显,是牛角地黄汤中起主要抗溶血作用的中药组分。而牛角和地黄的水煎液在各试验条件下均未表现出抑制溶血素溶血的作用。[结论]本研究表明,牛角地黄汤具有显著的对抗溶血素诱导红细胞溶血的作用,方中起主要作用的成分是赤芍和丹皮,钩藤的这种作用则比较弱,而牛角和地黄则不是牛角地黄汤中抗溶血作用的主要成分。 相似文献
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《甘肃农业大学学报》2020,(3):1-8
【目的】旨在调查张掖地区奶牛临床乳腺炎中大肠杆菌的感染情况、大肠杆菌的耐药性以及携带的毒力基因,为研制安全有效的奶牛乳腺炎大肠杆菌基因工程疫苗奠定基础.【方法】在张掖地区8个牛场采集22头罹患乳房炎的乳样47份,经细菌学、形态学、药敏试验和生化法等分离鉴定其中的大肠杆菌.通过PCR扩增分离株的毒力因子,选择检出率较高的毒力因子连接T载体,胶回收纯化后,连接PET-32a(+)以构建原核表达载体,最后通过双酶切和测序进行鉴定.【结果】47份乳样中共鉴定出24株大肠杆菌,它们对头孢西丁,多粘菌素B,阿米卡星和妥布霉素高度敏感.毒力基因检测结果发现,在这24株大肠杆菌中iucD, OmpC, trat, ECs3703和OmpF的检出率100%,fimH的检出率为96.15%, colv的检出率为7.69%, cnf1的检出率为4.34%, flyvA, STb, irp2, sfadE, cnf2和LT1等均未检出.成功构建了fimH、OmpF、 trat和OmpC毒力因子原核表达载体,分别为PET-32a-fimH、PET-32a-OmpF、PET-32a-trat和PET-32a-OmpC.【结论】对张掖地区部分奶牛场奶牛乳腺炎的临床用药具有一定的参考意义,也为进一步研制奶牛乳腺炎大肠杆菌基因工程疫苗提供了生物材料. 相似文献