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花生种子全长cDNA文库的构建和鉴定 总被引：3，自引：0，他引：3
以花生品种闽花5号各发育时期的种子为材料分离mRNA,利用SMART技术合成双链cDNA。利用限制性内切酶SfiⅠ酶切。将经过分级分离得到的cDNA连接到质粒载体pDNR-LIB,成功构建花生种子全长cDNA文库。将所得到初级文库扩增后进行保存,检测扩增文库滴度为1.7×109cfu/mL。PCR鉴定重组子,发现重组率接近100%,插入片段集中分布在0.5~2.0 kb。插入片段的平均大小在1000 bp左右,这说明该文库既可以满足低丰度基因的筛选,也可保证获得全长cDNA。 相似文献
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本试验以亚麻(Linum usitatissimumL.)品种Argos为材料,分离了高纯度的RNA。用简并引物以RT-PCR的方法,克隆了亚麻CAD基因cDNA部分序列,长度为477bp,构建了pGEM-T-CAD质粒。用限制性内切酶EcoRI酶切pGEM-T-CAD质粒和载体pGEM-7Zf(-),进行连接,构建成中间表达载体pGEM-7Zf(-)-CAD质粒。用限制性内切酶XbaI和BamHI双酶切中间表达载体pGEM-7Zf(-)-CAD质粒和pBI121载体,进行连接,构建了亚麻CAD基因反义植物表达载体pBI121-antiNTCAD。 相似文献
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亚麻CAD基因克隆及反义表达载体的构建 总被引：1，自引：0，他引：1
本试验以亚麻(Linum usitatissimum L.)品种Argos为材料,分离了高纯度的RNA.用简并引物以RT-PCR的方法,克隆了亚麻CAD基因cDNA部分序列,长度为477bp,构建了pGEM-T-CAD质粒.用限制性内切酶EcoR I酶切pGEM-T-CAD质粒和载体pGEM-7Zf(-),进行连接,构建成中间表达载体pGEM-7Zf(-)-CAD质粒.用限制性内切酶Xba I和BamH I双酶切中间表达载体pGEM-7Zf(-)-CAD质粒和pBI121栽体,进行连接,构建了亚麻CAD基因反义植物表达载体pBI121-antiNTCAD. 相似文献
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从大豆(花生豆1号)未成熟种子中提取总RNA，逆转录形成cDNA第一条链。根据genebank中大豆llS球蛋白Gy5的cDNA序列设计引物，用PCR方法扩增Gy5的cDNA序列，克隆到pUC19质粒载休上，并测定其全序列。用限制性内切酶PstI和EcoRI酶切重组质粒，将目的片段与质粒pCAMBIA1301连接，构建成植物表述载体并转化到农杆菌中，以便于以后的研究利用。 相似文献
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花生网斑病菌和黄曲霉菌对花生几丁质酶诱导的研究 总被引：1，自引：0，他引：1
用网斑病菌和黄曲霉菌对17个花生品种室内接种结果表明,J11和金花1012为高抗黄曲霉品种,而莒南2号和抗青9号为高感黄曲霉品种.鲁花8号和花选9号对网斑病抗性较好,群育101和金花1012抗性最差.对多个花生品种的几丁质内切酶和外切酶活性进行测定表明,花生几丁质酶既有内切酶活性也有外切酶活性,且均可通过病菌诱导活性增加.通过比较几丁质酶活性与花生网斑病、黄曲霉发病程度表明,花生几丁质酶活性与花生抗网斑病和黄曲霉的程度成正比.说明花生几丁质酶是与花生抗网斑病、黄曲霉病密切相关的一种抗性相关(PR)蛋白. 相似文献
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为构建花生果皮差异表达基因消减文库，分离花生果皮差异表达cDNA片段，本研究采用抑制消减杂交技术，以花生种仁cDNA为Driver，果皮cDNA为Tester，进行两次消减杂交和两次抑制性PCR，将第二次PCR产物与pGEM-T easy 载体相连，电击转化大肠杆菌，成功构建果皮差异表达cDNA文库。所长出菌落中89.2%为白色克隆。采用PCR法对重组子进行鉴定，发现其中单一扩增条带的克隆约占83.5%， 片段大小集中分布于250～750bp之间。 相似文献
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利用Trizol法提取接种PRsv 4 d的番木瓜种苗总RNA,分离纯化mRNA,反转录合成双链cDNA,双链cDNA末端经Pfu-DNA聚合酶补平,与EcoR I接头连接,XhoI酶切消化产生粘端.用Sepharose CL-2B柱分离纯化去除小分子cDNA片段,再与pMyr酵母表达载体连接,转化受体菌XL10-Gold,构建了接种PRSV番木瓜种苗胞质酵母双杂交cDNA文库.所获得的原始文库的克隆总数为1.8×106cfu,重组率为100%,文库滴度为2.6×109cfu/mL.对随机选取的34个克隆进行PCR鉴定,结果表明插入片段长度均大于O.5 kb且集中在1 kb左右.文库质量鉴定结果表明,该文库具有较好的库容量、较高的重组率以及较大的插入片段. 相似文献
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类花生致敏原3(iso-ARah3)是花生致敏原3的同系物,其表达活性与干旱及黄曲霉侵染相关。本研究通过RT-PCR技术从花生种子cDNA文库中克隆获得iso-ARah3的开放阅读框(ORF),全长1533bp,编码510个氨基酸,N端预测有20个氨基酸的信号肽序列。通过序列比对发现,该克隆序列有1处缺失突变,其N端210个氨基酸序列与胰蛋白酶抑制因子的同源性较高,达83.60%。通过构建原核表达载体pET28a-isoARah3,转化进大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达,利用SDS-PAGE检测表明,融合蛋白His-isoARah3获得高效表达,分子量约54kD。His-isoARah3经纯化和富集,对新西兰兔进行4次免疫,纯化获得的iso-ARah3多克隆抗血清,通过间接ELISA检测,表明获得了效价比(1∶512000)很好的抗体。通过对融合蛋白的诱导前和纯化后样品进行Western Blot分析,结果显示仅在纯化样品相应位置(54kD)有明显信号,表明所制备的抗体具有很高灵敏度和特异性。本研究结果为深入研究花生iso-ARah3基因的功能奠定了基础。 相似文献
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三个花生二酰甘油酰基转移酶基因的克隆与序列分析 总被引：1，自引：0，他引：1
二酰甘油酰基转移酶在植物油脂合成途径中具有重要的作用。本研究通过构建花生种子全长cDNA文库,结合大规模EST测序和RACE克隆等方法,从花生中克隆得到了三个DGAT基因,分别命名为AhDGAT1-1、AhDGAT1-2和AhDGAT3-3。其中AhDGAT1-1全长为2020bp,ORF为1539bp,理论分子量为58.6036kD,理论等电点为8.83;AhDGAT1-2全长为2553bp,ORF为1581bp,理论分子量为60.6598kD,理论等电点为8.94;AhDGAT3-3全长为1377bp,ORF为1023bp,理论分子量为36.911kD,理论等电点为8.17。将这三个基因在GenBank上注册,注册号分别为KC736068,KC736069和KC736067。 相似文献
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以强优势玉米杂交种豫玉22发育时期的雌穗为材料构建cDNA文库,为进一步研究和分离杂种优势相关基因构建技术平台。选择玉米雌穗发育过程中的4个时期(生长锥伸长、小穗分化、小花分化和花丝始伸期)的雌穗组织分别构建了4个定向cDNA文库,依据基因组DNA饱和杂交的原理,将从4个独立的cDNA文库中提取的质粒混合,通过基因组DNA亲和体系饱和杂交,获得雌穗全发育时期均一化cDNA文库。该文库平均插入片段1.3kb,含有3×104个克隆。对文库中随机的150个克隆进行测序,81.6%的序列为非冗余序列,11.2%的序列含有两个或两个以上的拷贝,并且主要来自多基因家族转录本,说明此文库的均一化有效。对测序结果进行功能聚类分析,发现文库序列涉及水解酶、转移酶、核苷酸结合蛋白、蛋白激酶、转录因子等基因,涉及环境应答、蛋白代谢、物质转运、个体发育等多个生化途径,说明该均一化文库基因覆盖度较高。该文库还包含有大量的未知基因,有待进一步的发掘和研究。 相似文献
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植物KNOX（Knotted1-like homeobox）可通过蛋白质相互作用参与调控落果、纤维细胞发育、次生细胞壁发育、开花等事件。为筛选剑麻叶中与AhKNOX2相互作用的蛋白,采用SMART同源重组技术构建剑麻叶片酵母双杂交表达文库,利用AhKNOX2为诱饵筛选与之相互作用的蛋白。结果表明：文库总容量为3.9×106 CFU,转化效率为9.15×105 CFU/μg pGADT7-Rec,插入片段大小主要分布于0.5~3.0 kb之间,重组率为92%,保存的文库细胞密度为1.35×108/mL,文库滴度为2.22×107CFU/mL。构建的pGBKT7-AhKNOX2诱饵载体存在自激活性,5 mmol/L的3-氨基- 1,2,4-三唑（3-Amino-1,2,4-triazole,3-AT）能抑制诱饵载体的自激活,通过筛选获得了16个与AhKNOX2相互作用的蛋白。本研究成功构建剑麻叶片酵母表达文库,并筛选获得与AhKNOX2相互作用的蛋白,该结果为进一步研究AhKNOX2在剑麻中的功能奠定前期基础,为培育高纤维产量的剑麻新品种提供基因资源和理论基础。 相似文献
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花生蛴螬中肠组织cDNA文库的构建 总被引：1，自引：0，他引：1
利用Qiagen试剂盒提取花生害虫华北大黑鳃金龟幼虫蛴螬中肠总RNA,并纯化mRNA,然后按照Stratagene试剂盒合成双链cDNA,经过凝胶柱层析,收集符合要求的cDNA片段,加工后与Uni-ZAP XR Vector连接,经Gigapack Ⅲ Gold体外包装,即获得蛴螬的cDNA文库,未扩增文库滴度1.95×106pfu/mL,重组率为99.7%,扩增后文库滴度达1.34×109pfu/mL,插入cDNA片段的长度平均为1.34kb,表明成功构建了高质量的蛴螬中肠cDNA文库。 相似文献
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感染高粱花叶病毒甘蔗叶片cDNA文库构建及评价 总被引：1，自引：0，他引：1
为了研究甘蔗花叶病与甘蔗寄主致病的互作分子机制,利用SMART技术成功构建了感染高梁花叶病毒甘蔗叶片的cDNA文库,用于后续酵母双杂交互作蛋白筛选试验.采用Omega公司Plant RNA Kit提取感染高粱花叶病毒甘蔗叶片总RNA,经过Oligotex纯化获得mRNA,将其反转录成cDNA第一链,再在DNA聚合酶作用下,通过长距离PCR扩增双链cDNA.经SfiI酶切并去除短片段后,连接到pGADT7-SfiI载体上,成功获得初级cDNA文库,最后以初级文库100万克隆为基数扩增,得到扩增文库并提取质粒.经检测构建的文库容量为1.6×106 cfu,文库滴度2.2× 106 cfu/mL,文库cDNA插入片段长度主要分布在700～2 000 bp,文库重组率约为96％.结果表明,该文库质量较好,为筛选分离抗病功能基因及开展寄主与病毒互作的研究奠定了基础. 相似文献