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新型cry7Ab基因的鉴定克隆、表达与杀虫活性 总被引：3，自引：0，他引：3
本文应用PCR-RFLP法鉴定出Bt菌株HQ40中含有cry7Ab基因,并根据cry7A全长基因序列设计特异性引物,成功克隆了该基因。该基因核苷酸序列已经在国际基因库GeneBank中登记,其登录号为EU380678,并由Bt δ-内毒素基因国际命名委员会正式命名为cry7Ab4。通过穿梭载体pSTK 将该基因导入Bt 无晶体突变株中,获得工程菌HD7Ab4。SDS-PAGE分析表明cry7Ab4 基因在其中能正常表达,并形成菱形晶体。提取工程菌HD7Ab4和野生菌HQ40晶体蛋白,并在体外用胰蛋白酶酶解活化。分别对直翅目、鳞翅目和鞘翅目的害虫进行了杀虫活性测定。生测结果表明：Cry7Ab4蛋白trypsin酶解液对鞘翅目的大猿叶甲显示了一定的杀虫活性,其野生菌蛋白及表达蛋白酶解液LC50分别为231.59µg/ml及293.79µg/ml。表达产物虽不能使鳞翅目的小菜蛾、甜菜夜蛾和亚洲玉米螟死亡,但对它们的生长发育有明显的体重抑制作用。另外对马铃薯甲虫以及榆蓝叶甲也有体重抑制作用,而对直翅目的东亚飞蝗无毒。 相似文献
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根据cry1Ia类基因的全长序列设计引物，以苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）菌Btc008的总DNA为模板扩增出片段长为2.1kb的cry1Ia的全长基因，插入大肠杆菌（Escherichia coli）表达载体pET-21b，转化大肠杆菌BL21（DE3）菌株，诱导表达出81kD的蛋白。该蛋白由719个氨基酸组成，推导的分子量为81.2kDa。该蛋白的氨基酸序列不同于已知的12种Cry1Ia蛋白，是一种新的Cry1Ia蛋白，该基因已被国际基因命名委员会正式命名为cry1Ia8。杀虫活性测定结果表明：Cry1Ia8对亚洲玉米螟（Ostrinia furnacalis）、小菜蛾（Plutella xylostella）有很强的杀虫活性，LC50分别为0.268 µg/g、2.227 µg/ml，其杀虫效果与Cry1Ab、Cry1Ac相当。对大豆食心虫（Leguminivora glycinivorella）也有较好的活性，但对鞘翅目叶甲科害虫榆兰叶甲（Pyrrhalta aenescens）没有活性。该基因的获得将为我国抗虫转基因作物和工程菌的研制提供新的基因来源，为筛选延缓昆虫抗性产生的基因组合提供了极为重要的依据。 相似文献
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陆秀君 《农业生物技术学报》2007,15(5)
从土壤中分离得到营养期对鳞翅目害虫高毒的Bt LS1菌株。分子检测菌株中存在营养期杀虫蛋白基因，进行了该基因的克隆表达。设计全长基因引物扩增得到了约2.3kb的靶片段；克隆序列分析证实为新Vip3A基因，命名为Vip3A-LS1，GenBank登录号DQ016968，Bt基因命名委员会命名为Vip3Aa22。该基因推导蛋白与其它已知同源蛋白8个氨基酸不同。构建vip3A-LS1基因的表达载体，SDS-PAGE检测约88kD目的蛋白大量表达；生物测定表明，胞内可溶性蛋白对棉铃虫和甜菜夜蛾活性最高。纯化蛋白对初孵棉铃虫和甜菜夜蛾的LC50分别为73.6和32.2µg/g。 相似文献
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嗜水气单胞菌aer毒素基因的克隆及核苷酸序列分析 总被引：2，自引：0，他引：2
以自行分离的嗜水单胞菌分离株AHCS02为研究对象,分析其产生的aer毒素基因结构.根据GenBank中aer毒素的基因序列（M16495）,设计扩增编码aer毒素成熟蛋白基因的引物,以AHCS02的基因组DNA为模板,PCR扩增出长度为1 332 bp的核苷酸片段,进行pMD18-T载体克隆.酶切鉴定后进行序列测定和分析,结果表明扩增的片段与M16495的同源性达92%,将测得的序列登录GenBank数据库,所得的序列编号为AY136943.分析推导其核苷酸编码的氨基酸序列显示：其编码443个氨基酸,为aer毒素成熟蛋白的基因,与M16495相比,氨基酸差异主要集中在422氨基酸残基至436氨基酸残基的位置上,在这个位置上共有8个氨基酸残基发生变化,其中在435和437氨基酸残基之间有一个氨基酸密码子丢失,氨基酸的同源性达95.5%.证明aer毒素基因的5＇端保守,3＇端变异较大. 相似文献
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根据GenBank中猪2型圆环病毒的核苷酸序列,设计两对引物,对来源于河南省不同地市的4株PCV2细胞培养物进行鉴定,并扩增出ORF2基因,克隆到pMD18－T载体上,获得重组质粒pMD18-T-ORF2,并对其进行测序,结果表明所克隆的ORF2基因与其它PCV2 ORF2基因核苷酸同源性在92.4%～99.6%之间,氨基酸同源性在90.6％～97.9％之间。同时采用PCR从重组质粒pMD18-T-ORF2中扩增出587bp的ORF2基因,克隆到表达载体pET-32a,成功构建了重组质粒pET-32a-ORF2,经诱导表达了ORF2基因编码的结构蛋白,表达的重组蛋白为融合蛋白,分子量为40kD,经Western-Blot检测,重组蛋白可被PCV2阳性血清识别。 相似文献
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Gao Y Fencil KJ Xu X Schwedler DA Gilbert JR Herman RA 《Journal of agricultural and food chemistry》2006,54(3):829-835
Cotton plants were genetically modified through the introduction of a synthetic gene that encodes a Bacillus thuringiensis insecticidal protoxin referred to as Cry1F(synpro). This protoxin is a chimeric, full-length delta-endotoxin of 130 kDa, comprised of the core toxin of Cry1Fa2 protein and parts of the nontoxic portions of Cry1Ca3 and Cry1Ab1 proteins, all of which originated from Bacillus thuringiensis. The Cry1F(synpro) expressed in cotton plants confers resistance to lepidopteran pests. The current study was conducted to characterize the Cry1F(synpro) protein expressed in the transgenic cotton event 281-24-236. Results showed that the full-length Cry1F(synpro) produced in the transgenic cotton plants was sensitive to the host cell protease cleavage, resulting in a truncated, biologically active form (core toxin) with an apparent molecular mass of 65 kDa. This truncated toxin was purified by immunoaffinity chromatography from the cotton leaf extract. N-terminal sequencing, peptide mass fingerprinting by MALDI-TOF MS, and internal peptide sequencing by MS/MS confirmed the identity of the truncated core toxin of Cry1F. The mechanism of truncation was explored with Cry1F(synpro) derived from a recombinant Pseudomonas fluorescens. The transgenic cotton-produced Cry1F showed equivalent insecticidal activity to that of Pseudomonas fluorescens-derived Cry1F. 相似文献
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茶树β-葡萄糖苷酶cDNA克隆和原核表达 总被引：9，自引：0，他引：9
摘要：对与萜烯类香气前体及与抗病虫害有密切关系的茶树(Camellia sinensis ) β-葡萄糖苷酶cDNA进行克隆和原核表达。结果表明，该酶cDNA全长序列为1 475 bp(GenBank登录号为AF537127)，与其它植物同源性为40%～60%。α-螺旋构象14.33%、β-折叠构象25.43%，存在多个氨基酸功能结构域。利用pET-32a表达载体构建的重组质粒，转化到大肠杆菌(Escherichia coli )菌株BL21zztrxB（DE3）中，诱导产生63 kD的融合蛋白，表达产物具有正常的生物学活性，能催化葡萄糖苷键的水解反应；诱导表达结果显示，主要在细胞质中以可溶性蛋白形式进行表达。 相似文献
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通过对植物中已知巯基蛋白酶抑制剂(cystatin)的保守性分析,设计1对简并引物,从陆地棉栽培种中棉所29(GossypiumhirsutumL.cv.Zhongmiansuo29)cDNA中克隆出1条巯基蛋白酶抑制剂基因片断,经测序和对测序结果在有关数据库中检索分析,发现该片段与1条中棉(G.arboreumL.)EST及1条雷蒙德氏棉(G.raimondiiL.)cDNA同源性高达96%。三者编码蛋白的氨基酸同源性达100%,且完全符合CPI的特征;所克隆基因片段的氨基酸序列与NBCI蛋白质数据库中登录的豇豆、向日葵、玉米、水稻中CPI均有高度同源性,表明该片段包含编码陆地棉CPI的完整序列。 相似文献
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从碱茅根cDNA文库分离得到Put－Cu／Zn—SOD全长cDNA,其序列全长为2700bp,该基因的开放读码框为长615bp,所编码的蛋白由204个氨基酸组成,其预测分子量约为20．6kD、理论等电点约为5．63。Put－Cu／Zn—SOD氨基酸序列与水稻Cu／Zn-SOD序列有较高的同源性为87％。将Put-Cu／Zn—SOD基因构建到酵母表达载体pYES2,并转化至酵母（INVSc1）。对pYES2-Put-Cu／Zn—SOD转化酵母进行盐碱、氧化胁迫实验。结果表明：重组酵母的抗盐碱、氧化能力明显高于对照（pYES2转化酵母）,结果显示了碱茅的Cu／Zn—SOD基因在酵母表达中,具有提高酵母抗盐碱和耐氧化能力。 相似文献
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为研究产气荚膜梭菌在淡水鱼中的分布及毒素型,随机采取同一水库的鲤鱼、鲢鱼、鲫鱼、鲶鱼、黄鳝等淡水鱼样品420尾,细菌学方法分离肠内容物中的产气荚膜梭菌,PCR方法检测分离菌株的毒素基因确定毒素型,PCR扩增片段克隆后进行核苷酸序列分析并且与Genebank相应基因进行同源性比较。结果：自75份肠内容物样品中分离出产气荚膜梭菌;58株为C型（α、β毒素基因）,13株为A型（α毒素基因）,4株为B型（α、β、ε毒素基因）;三型菌株均能扩增出特异性2条带;检出基因与Genebank相应基因的同源性为98.15－99.29%。在淡水鱼检出产气荚膜梭菌的α、β、ε、β2毒素基因,在B型产气荚膜梭菌中扩增出2毒素基因均属首次,本研究对水体环境的污染及人类的食品安全有一定的指导意义。 相似文献
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玉米大斑病菌G蛋白β亚基编码基因的克隆与表达 总被引：1，自引：0，他引：1
玉米大斑病菌（Setosphearia turcica）属半知菌亚门丝状真菌，是严重威胁玉米生产的重要植物病原真菌。本研究克隆了玉米大斑病菌G蛋白β亚基编码基因Stgb-1。Stgb-1基因全长1296bp，由5个外显子和4个内含子组成；开放阅读框（ORF）为1056bp，编码351个氨基酸，蛋白质计算分子量为39.081kDa。STGB1蛋白推导氨基酸序列与Cochliobolus heterostrophus（100%）、Cryphonectria parasitica（80%）、Aspergillus fumigatus（81%）等丝状真菌的G蛋白β亚基编码基因均具有较高的同源性。同时，利用RACE技术和Genomic Walking技术获得了Stgb-1基因3’-末端cDNA和DNA的3’端侧翼序列，BlastN结果表明其cDNA 3’-UTR为136bp，poly(A)由9个A构成。此外，构建了pET28a-Stgb-1原核表达载体，SDS-PAGE检测和Western blot鉴定结果表明，目的蛋白在E.coli BL21菌株中已成功实现了诱导表达，为进一步研究蛋白结构与功能的关系奠定了基础。 相似文献
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苏云金芽孢杆菌cry2Aa基因的克隆、表达与活性 总被引：9，自引：1，他引：9
B-8-G和Ly30是我国自行分离的对多种重要农业害虫具有高毒力的苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）菌株,经PCR-RFLP鉴定均含有cry2Aa基因.根据cry2Aa全长基因序列设计特异引物,以B-8-G总DNA为模板扩增其中的cry2Aa全长基因,与大肠杆菌（Escherichia coli）表达载体pET-21b相连接,获得含有cry2Aa全长基因的重组质粒pET2Aa,该基因在大肠杆菌BL21菌株能够正常表达65 kD蛋白.通过构建Ly30总DNA文库方法从中筛选获得cry2Aa基因,将其连接至Bt-E.coli穿梭表达载体pHT315上,转化Bt无晶体突变株HD-73中,该基因能正常表达65 kD蛋白,并形成立方体状晶体.这两种基因序列已被国际Bt基因命名委员会分别正式命名为cry2Aa9和cry2Aa10.杀虫生物活性测定结果表明cry2Aa基因表达产物对黄胫小车蝗（Oedaleusinfernlis）、尖音库蚊（Culex pipiens）、黑翅伊蚊（Aedes melanopterus）、水稻二化螟（Chilo suppressalis）和小菜蛾（Plutellaxylostella）幼虫均具有显著的毒杀作用.首次报道cry2Aa10基因表达蛋白对蝗虫、库蚊具有杀虫活性.这些基因的获得,将为高效工程菌和抗虫转基因植物的研制提供了新的基因资源. 相似文献
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张文飞 ;吴红萍 ;徐志霞 ;金映虹 ;吴仲琦 ;钤江朝 ;黄楠楠 ;金文杰 ;贾璐羽 ;栗新峰 ;王宁 ;赵丛 ;刘肖静 ;刘洁 ;刘明月 ;刘义凤 ;王锐萍 《广西农业生物科学》2014,(3):472-477
苏云金芽孢杆菌作为应用最为广泛的生物农药,已经成为化学合成农药必要的补充或替代品,其杀虫蛋白基因已成功的应用到转基因抗虫作物中。本文基于海南五指山和吊罗山热带原始雨林区土壤样品筛选分离的Bt菌株资源,利用第二代测序技术Illumina对分离的特异Bt菌株的杀虫基因进行全面分析,鉴定出新型Bt杀虫蛋白基因25个,其中包括5个新型的营养期杀虫蛋白基因（vip）和3个新型cyt基因。本研究表明第二代DNA测序技术可以高效用于挖掘Bt杀虫基因资源,而获得的新型杀虫蛋白基因将进一步丰富我国能够应用的杀虫基因种类。 相似文献
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本文采用RT-PCR方法,从齿肋赤藓（Syntrichia caninervis）总RNA中获得ALDH21基因cDNA序列,连接到pMD19-T载体上并转化E.coli DH5α,阳性克隆经PCR鉴定后测序,将测序结果与GenBank中山墙藓（Tortula ruralis）和小立碗藓（Physcomitrella patens）相关基因序列进行同源性比对。结果表明,实验成功克隆了S.caninervis的ALDH21基因的cDNA序列（GenBank登录号：GQ245973）,为一个完整的ORF,其长度为1452bp。该序列与T.ruralis和P.patens的cDNA序列同源性分别为98%和78%,推导的氨基酸同源性分别为97%和87%。生物信息学分析表明该蛋白质分子量为52.98kD,等电点pI为5.96,编码483个氨基酸,具备ALDH21蛋白家族特征;半定量RT-PCR结果表明：ALDH21在干旱胁迫状态时的表达量显著高于水合状态,说明ALDH21基因可能参与干旱胁迫应答。本文为进一步研究齿肋赤藓ALDH21基因的抗旱机理提供理论依据。 相似文献
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利用差异显示法研究水稻耐淹涝相关基因 总被引：7，自引：0，他引：7
应用mRNA差异显示法对耐淹材料籼稻(Oryzasativassp.indica)FR13A和敏感籼稻(O.sativassp.indica)IR39595-503-2-1-2在淹涝胁迫下的基因差异表达进行了分析。结果显示,从40对引物中共扩增出1428条片段,筛选到102条在耐淹涝材料和敏感材料间差异明显的基因片段,差异率为7.1%。其中有42条差异带来自耐淹涝材料,有7个差异片段已通过Northern杂交验证在耐淹涝材料FR13A中表达。进一步克隆测序并进行数据库比对分析表明,有4个与水分胁迫产生的应答反应和生理生化变化有关,其中一个与ATP结合蛋白高度同源,另3个与异柠檬酸酶脱氢酶、NADH脱氢酶和乙醛酸转移酶部分序列高度同源,其余3个为新的cDNA片段。 相似文献
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从阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae)UW4菌株提取细菌总DNA,根据已报道的阴沟肠杆菌ACC脱氨酶(1-aminocy-clopropane-1-carboxylicaciddeaminase)基因序列设计简并引物,通过PCR扩增获得1条约1.02kb特异片段,把该片段连接到pGEM-Tvector上进行测序。序列分析结果表明,该基因编码区全长为1017bp,共编码338个氨基酸残基,与报道的序列相比仅存在8个核苷酸的差异,同源性达99.1%;将其翻译成氨基酸序列后发现,仅引起了4个氨基酸残基的变化,氨基酸同源性为98.2%。利用DNASIS软件对蛋白质二级结构进行分析比较,发现其蛋白质二级结构及其单元与报道的序列完全一致。将其插入原核表达载体pET-28b进行诱导表达,发现其表达蛋白在分子量约39kD处比对照多出一明显条带;经Westernblot分析检测,发现此带即为His-ACDS融合蛋白。 相似文献
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从杜长大母猪的股骨骨髓中提取基因组RNA，用RT-PCR 扩增抗菌肽PMAP-37 基因，获得1 条约282 bp 的片段，以pGEM-T Easy vector 为载体，将该基因片断克隆到大肠杆菌(Escherichia coli )DH5α 中。从筛选的阳性克隆中分离出PMAP-37 基因，测定其序列。分析表明，该片段为PMAP-37 cDNA 的部分序列，编码167 个氨基酸组成的多肽。研究得到的基因片段与报道的猪骨髓抗菌肽PMAP-37 cDNA 部分序列同源性达到98%。以PMAP-37 基因片段的克隆为基础，构建了优化的半定量RT-PCR 法，以18S rRNA 为内标，研究不同体重猪骨髓抗菌肽PMAP-37 基因表达的差异。结果发现，从刚出生到20 kg，PMAP-37 基因表达呈上升趋势，在20～40 kg，PMAP-37 基因表达呈下降趋势，40～60 kg，PMAP-37 基因表达又呈上升趋势，在60～90 kg，PMAP-37 基因表达呈下降趋势。 相似文献
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Bacillus thuringiensis is indistinguishable from Bacillus cereus except for the production of insecticidal crystal proteins (ICPs). B. thuringiensis strains may show enterotoxin profiles and toxin levels similar to those of B. cereus strains isolated from food-poisoning cases. It is important for the food industry and farmers to consider that with the application of B. thuringiensis strains to crops, their spores may be introduced into the human food chain. In this study, 59 B. thuringiensis strains were assayed for their hemolysin BL (HBL) using a BCET-RPLA kit and their cytotoxicity to Chinese hamster ovary (CHO) cells. The enterotoxin titer was as high as that of B. cereus diarrheal-type strain ATCC 49064. In an attempt to obtain a food safety strain for bioinsecticide use, in this study, a 3.5-kb cry1Ac DNA fragment was amplified with PCR from the total DNA of B. thuringiensis subsp. kurstaki CCRC 11502 and cloned into the Bacillus expression vector pHY300PLK. The alpha-amylase promoter, amyE, was then introduced into the promoter region and, afterward, the recombinant plasmid pHYe1Ac35 was introduced into a non-enterotoxigenic and non-cytotoxic B. thuringiensis subsp. kurstaki Tt14 strain. The transformant, without any detectable enterotoxigenicity or cytotoxicity, produced Cry1Ac toxin properly, and its insecticidal activity against Trichoplusia ni larvae was found to be satisfactory. 相似文献
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WB9是我国分离自武夷山的对多种重要农业害虫具有高毒力的苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)菌株,经PCR-RFLP鉴定含有cry2Ac基因。根据cry2基因序列设计引物,以WB9质粒为模板扩增cry2Ac全长基因,与大肠杆菌(Escherichia coli)克隆载体pMD18-T连接获得含有cry2Ac全长基因的重组质粒pMD2Ac并测序。该基因在GenBank上登录号为DQ361267,被Bt国际命名委员会正式命名为cry2Ac4。通过亚克隆方法将cry2Ac4基因插入穿梭表达载体pHT315获得重组表达质粒pHT2Ac,将其转化大肠杆菌SCS110和Bt无晶体突变株HD73 Cry-,得到的工程菌能正常表达70 kD蛋白,形成方形晶体。生物测定结果表明,cry2Ac4基因表达产物对桔小实蝇(Bactrocera dorsalis Hendel)幼虫具有显著的毒杀作用,但对小菜蛾(Plutella xylostella)和致倦库蚊(Culex fatlgans)幼虫基本没有效果。 相似文献
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将苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)缺失C端154个氨基酸编码区的vip3A基因(vip3T)插入原核表达载体pQE30，构建了重组表达载体pQEvip3T，并转化大肠杆菌(Escherichia coli ) M15进行IPTG诱导表达，比较了完整的Vip3A蛋白和C端缺失的蛋白Vip3T的可溶性和杀虫活性。与Vip3A不同，融合蛋白Vip3T以不可溶的包含体形式存在，诱导表达的菌液中没有检测到可溶性Vip3T蛋白。生物测定结果表明，M15(pOTP)诱导表达的Vip3A蛋白对初孵斜纹夜蛾(Spodoptera litua)和甜菜夜蛾(S. exigua)幼虫具有较高的杀虫活性，其提纯的包含体无毒，但包含体的碱性裂解液却又恢复了对夜蛾科害虫的活性；M15(pQEvip3T)菌液、包含体及其碱性裂解液对这两种昆虫幼虫则完全无毒，说明在大肠杆菌中，Vip3A蛋白C端氨基酸可能对Vip3A蛋白的可溶性和杀虫活性具有重要的影响。 相似文献