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牙鲆Toll样受体1基因全长cDNA的克隆及特征分析(英文) 总被引：1，自引：0，他引：1
[目的]克隆牙鲆TLR1(Toll like receptors)全长基因,并对其结构特征和表达规律进行分析。[方法]采用同源克隆和快速扩增cDNA末端技术,从牙鲆头肾组织中克隆出TLR1基因cDNA全长序列,并对该基因进行生物信息学和表达模式分析。[结果]牙鲆TLR1基因cDNA全长2947bp,开放阅读框(ORF)2418bp,编码805个氨基酸,包括26个氨基酸组成的信号肽、2个跨膜区、6个富含亮氨酸重复结构域(LRR)和一个TIR结构域(Toll/interleukin(IL)-1receptor)。该蛋白的分子量为91.15kDa,等电点为6.49。氨基酸序列同源性分析显示,牙鲆TLR1基因与其他脊椎动物的TLR1基因序列全长同源性达到69%~35%,TIR序列的同源性达到84%~62%。在系统发生树上牙鲆的TLR1基因首先与斜带石斑鱼聚类。通过荧光定量qRT-PCR检测,结果显示牙鲆TLR1基因的mRNA主要表达于肝脏、心脏和脾脏等组织。[结论]该研究结果为进一步研究TLR1基因的功能和开发牙鲆免疫增强剂奠定了基础。 相似文献
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[目的]克隆牙鲆TLR1(Toll like receptors)全长基因,并对其结构特征和表达规律进行分析。[方法]采用同源克隆和快速扩增cDNA末端技术,从牙鲆头肾组织中克隆出TLR1基因cDNA全长序列,并对该基因进行生物信息学和表达模式分析。[结果]牙鲆TLR1基因cDNA全长2 947 bp,开放阅读框(ORF)2 418 bp,编码805个氨基酸,包括26个氨基酸组成的信号肽、2个跨膜区、6个富含亮氨酸重复结构域(LRR)和一个TIR结构域(Toll/interleukin(IL)-1 receptor)。该蛋白的分子量为91.15 kDa,等电点为6.49。氨基酸序列同源性分析显示,牙鲆TLR1基因与其他脊椎动物的TLR1基因序列全长同源性达到69%～35%,TIR序列的同源性达到84%～62%。在系统发生树上牙鲆的TLR1基因首先与斜带石斑鱼聚类。通过荧光定量qRT-PCR检测,结果显示牙鲆TLR1基因的mRNA主要表达于肝脏、心脏和脾脏等组织。[结论]该研究结果为进一步研究TLR1基因的功能和开发牙鲆免疫增强剂奠定了基础。 相似文献
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利用cDNA-AFLP技术,从芜菁花叶病毒(TuMV)侵染的不结球白菜(Brassica campestris ssp.chinensis Makino)幼叶中分离到1条编码谷胱甘肽还原酶的基因片段,通过电子克隆得到其cDNA全长为1 503 bp,编码501个氨基酸,命名为Nhc-cGR1。对该基因进行生物信息学分析,并利用实时定量PCR研究其在TuMV侵染和水杨酸(SA)、茉莉酸(JA)、乙烯(ET)诱导下的表达情况。结果表明:该基因作为病原相关基因参与了TuMV病害响应,并通过增加自身表达量来激活细胞内的信号转导途径,诱导各种防卫反应相关基因的表达;同时,SA和JA抑制该基因的表达,外施ET能诱导其正向表达。 相似文献
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以苹果砧木山定子(Malus baccata)为试材,根据小金海棠(Malus xiaojinensis Cheng et Jiang)中克隆得到的尼克烟酰胺合成酶基因Mx Nas1(登录号:DQ403256)的全长序列设计特异引物,通过RT-PCR方法从山定子c DNA中克隆到Nas1基因并命名为Mb Nas1,该基因全长为978 bp。预测该基因可编码325个氨基酸,理论等电点为5.26,相对分子质量为36.09 ku。Real-time PCR结果表明,正常供铁(EDTA-Na Fe,40μmol/L)时,该基因在山定子水培苗的新叶、老叶、根、茎的韧皮部中均有表达,在木质部表达量较低;缺铁处理(4μmol/L)时,该基因在根和新叶中的表达加强,第6天达到最高值,之后开始下降;在老叶中表达逐渐减弱;高铁处理(160μmol/L)时,该基因在根和新叶中的表达减弱,在第9天达到最小值,之后有所上升;在老叶中表达逐渐增强。基因枪亚细胞定位试验表明,Mb Nas1蛋白质定位在细胞质膜上。 相似文献
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[目的]克隆籼稻谷氨酸脱羧酶(GAD)基因的全长cDNA,并进行序列分析和植物表达载体构建,为改良水稻的营养保健品质奠定基础.[方法]根据已知植物GAD基因的保守区域设计引物,以高GABA籼稻品系“新-9-4”的胚芽为材料,利用RT-PCR和RACE技术克隆GAD基因的全长cDNA;扩增其编码序列,构建双T-DNA植物表达载体.[结果]扩增获得长1962 bp的籼稻GAD基因全长cDNA(OsiGAD),包含1479 bp的开放阅读框,编码492个氨基酸.OsiGAD与已报道的水稻GAD基因OsGAD1、OsGAD2、OsGAD3的核苷酸序列同源性分别为67.1%、69.4%、98.3%,推导氨基酸序列的同源性分别为77.6%、70.1%、100.0%.OsiGAD蛋白序列具有磷酸吡哆醛结合位点和与钙调蛋白结合的C端延伸区域;构建了其具有水稻胚乳特异表达特性的双T-DNA植物高效表达载体pCDMAR-OsiGAD-hpt,选择标记基因和OsiGAD-因分别位于此载体的两个不同T-DNA区.[结论]克隆获得的籼稻GAD基因OsiGAD长1962 bp,并成功构建了其双T-DNA植物高效表达载体. 相似文献
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大菱鲆hepcidin抗菌肽基因的克隆及在大肠杆菌中的高效表达 总被引：1，自引：0，他引：1
通过同源克隆结合RACE的方法从大菱鲆(Scophthal mus maximus)肝脏中克隆了大菱鲆hepcidin抗菌肽基因全长cDNA(GenBank accession number AY994074)。大菱鲆hepcidin基因cDNA全长778bp,包含有1个273bp的开放阅读框,编码1个长90氨基酸的前体肽。将大菱鲆hepcidin抗菌肽基因的成熟肽序列重组至原核表达载体pGEX-4T-1中,用IPTG诱导后,SDS-PAGE电泳显示在29ku处有特异性蛋白条带出现,表达的融合蛋白主要以包涵体形式存在,融合蛋白约占总蛋白的26%。Western-blotting分析发现表达的融合蛋白可以特异性地与GST抗体相识别。这些结果表明大菱鲆hepcidin抗菌肽基因成功实现了原核表达。 相似文献
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《山东农业科学》2019,(11):1-7
为更好了解L-半乳糖内酯脱氢酶及编码基因在软枣猕猴桃中的生理功能及作用,以‘魁绿’软枣猕猴桃果实cDNA为模板,用RT-PCR及RACE技术,获得L-半乳糖酸-1,4-内酯脱氢酶基因AaGalLDH(GenBank:KP145007.1)。序列分析表明该基因全长为2 394 bp,开放阅读框为1 833 bp,编码610个氨基酸,与其它植物GalLDH氨基酸序列具有78%～95%的同源性。编码的蛋白序列具有GalLDH蛋白家族典型的保守结构域。进一步将该基因连接到原核表达载体并转化大肠杆菌进行诱导表达,经Western Blotting验证,目的基因在pET-28a表达系统中有表达,但基本为不溶性表达。这为进一步研究该酶蛋白的体外表达和功能以及选育高品质软枣猕猴桃品种奠定了基础。 相似文献
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采用RT-PCR和RACE技术,成功克隆了唐鱼(Tanichth ys albonubes)热休克蛋白60基因cDNA全长序列,命名为TaHSP60(GenBank登录号:HM234132).研究表明:该基因序列全长为2 486 bp,5′端非翻译区(URT)102 bp,3'URT 656 bp,开放阅读框(ORF)... 相似文献
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为获得小麦抗叶锈病相关基因,以小麦近等基因系TcLr19所构建的非亲和cDNA文库中获得的EST序列(Contig 914)为靶序列,用RT-PCR方法和cDNA末端快速扩增技术,分离克隆到片段为3 042bp的全长cDNA序列。序列分析表明该序列符合典型单子叶植物的CC-NBS-LRR结构模式,命名为TaNLR。该基因包含一个完整的2 739bp的开放阅读框(ORF),具有连续的Poly A尾和典型的加尾信号AATTAA。ProtParam程序预测表明该基因编码912个氨基酸。发育树分析显示该氨基酸序列与大麦的NBS-LRR类抗病基因蛋白同源性最高达89%。荧光定量PCR分析表明,在小麦与叶锈菌互作中,TaNLR基因受叶锈菌诱导下调表达。本研究在TcLr19小麦中成功获得了抗病同源基因,这为明确NBS-LRR在小麦抗叶锈病中的作用奠定了基础。 相似文献
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山药SuSy基因全长cDNA序列的结构、进化和表达 总被引：1，自引：0，他引：1
【目的】阐明山药蔗糖合成酶（SuSy,EC 2.4.1.13）基因家族的成员及其功能。【方法】利用RT-PCR和RACE技术从大薯（Dioscorea alata ）地下块茎中分离到1个SuSy基因（DaSuSy1）全长cDNA序列,并用DANSTAR和Clastal W等软件分析该序列的结构特征和分子进化,采用RT-PCR和Northern杂交对该基因的时空表达进行分析。【结果】DaSuSy1全长cDNA序列大小为2 673 bp,其中最大开放阅读框（ORF）、5′端和3′端的非翻译区分别含有2 445 bp、7 bp和221 bp,而且3′端的非翻译区含1个24 nt的Poly（A+）尾;最大ORF可编码814个氨基酸,分子量为92.76 kD,等电点为6.42,含有蔗糖合成酶和葡糖基转移酶两个保守功能域及两个磷酸化位点,即N端的Ser10和C端的SNLDRRET781 RR(Ser774～Thr781)。该基因在全长cDNA序列、编码区cDNA序列及其编码氨基酸序列的水平上与GenBank中所选已知物种SuSy基因相应序列的同源性分别达45.3%～71.3%、45.8%～74.8%和50%～84.7%,与禾本科植物SuSy基因家族中一些成员亲缘关系最近。DaSuSy1在非光合器官中表达,其中地下块茎表达最为强烈,而且从块茎形成初前期开始表达一直增强至盛中期,此后逐渐减弱。【结论】DaSuSy1是山药SuSy基因家族成员,归为单子叶植物SuSy基因的组别,仅在非光合器官中表达编码负责蔗糖-淀粉转化功能的SuSy同工型。 相似文献
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大豆氧乙酰丝氨酸(硫醇)裂解酶(OAS-TL)催化半胱氨酸合成,是硫素代谢的关键酶。试验以东农46(高油型)和黑农35(高蛋白型)为材料,检测鼓粒期后大豆籽粒OAS-TL在3个不同硫水平(0、0.02、0.08g·kg-1土)下的生理特性,鉴定克隆了该酶基因并分析了其调控表达情况。结果表明,①OAS-TL活性随生育进程推进持续下降,2个品种籽粒OAS-TL活性表现为S20高于S0和S80处理;鼓粒前期施硫效果大于后期;②通过同源克隆获得一个编码OAS-TL基因的cDNA序列,全长1059bp,ORF长855bp,编码34.2ku的蛋白质;③半定量RT-PCR显示OAS-TL稳定态mRNA在籽粒发育早期表达较强,且处理间差异明显,发育后期表达水平逐渐降低。不同硫素处理间OAS-TL的表达有差异,S20上调表达高于S0和S80。 相似文献
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二酰甘油酰基转移酶(DGAT)是TAG合成过程中的限速酶。以晋紫苏1号为材料,采用电子克隆技术获得DGAT1基因(PfDGAT1,AF298815.1),并对PfDGAT1基因序列进行生物信息学及表达特性分析。结果表明,PfDGAT1基因序列全长为1 964 bp,开放阅读框长度为1 605 bp,共编码534个氨基酸残基;多序列比对和系统进化树分析表明,紫苏Pf DGAT1蛋白与芝麻、油橄榄的DGAT1蛋白的亲缘关系较近,序列同源性分别为89%和83%;利用实时荧光定量PCR技术分析PfDGAT1基因在紫苏不同组织中的表达特性,结果显示,PfDGAT1基因在紫苏不同组织中均有表达,但在种子中表达量最高,且随种子发育表达量呈先升高后降低的变化趋势,在开花后20 d表达量达到最高。 相似文献
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[目的]为研究香蕉果实采后成熟机理奠定分子基础。[方法]通过抑制差减杂交和cDNA微阵列相结合的方法分离获得1个香蕉PRMT基因的cDNA片断,并克隆了该基因全长cDNA序列,对其进行生物信息学分析和在香蕉不同器官与果实不同成熟时期的表达模式分析。[结果]MaPRMT1基因cDNA全长1158 bp,具有完整的开放阅读框,编码385个氨基酸,与植物中的PRMT的同源性较高,含有1个Methyltransf-11结构域。在香蕉根、茎、叶和果实中均有表达,且在茎和叶中的表达量较高。随采后天数的增加,表达量逐渐下降,但至香蕉乙烯释放高峰时最大,后又开始下降。[结论]MaPRMT1属于第1类精氨酸甲基转移酶,在香蕉不同器官和果实不同成熟期呈差异表达。 相似文献
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【目的】明确中华绒螯蟹羧酸酯酶基因(ES-CXEs)在中华绒螯蟹不同组织及在农药胁迫下的应激表达模式,为揭示其代谢解毒机制打下理论基础。【方法】采用RACE克隆ES-CXEs基因全长序列,并进行生物信息学分析;以实时荧光定量PCR检测中华绒螯蟹不同组织及在农药胁迫下ES-CXEs基因的表达变化。【结果】从中华绒螯蟹肝胰腺中克隆获得两段ES-CXEs基因cDNA序列(ES-CXE5和ES-CXE6),其中,ES-CXE5基因序列全长1889 bp(GenBank登录号MH201558),包括132 bp的5'端非编码区(5'UTR)、122 bp的3'端非编码区(3'UTR)和1635 bp的开放阅读框(ORF),推测其编码544个氨基酸序列;ES-CXE6基因序列全长3089 bp(GenBank登录号MH201555),包括282 bp的5'UTR、779 bp的3'UTR和2028 bp的ORF,推测其编码675个氨基酸序列。多序列比对分析结果显示,ES-CXE5和ES-CXE6基因均具有CXEs家族的特征序列,即催化三联体结构(S-E-H)和N-糖基化位点。ES-CXE5氨基酸序列与三疣梭子蟹、日本长额虾等甲壳类CXEs聚为一簇,而ES-CXE6氨基酸序列与水蚤类和芜菁叶蜂的CXEs聚为一簇。组织特异性表达分布显示,ES-CXEs基因在雌、雄性中华绒螯蟹不同组织中的相对表达量无显著差异(P0.05),且在肝胰腺、肌肉、精巢和副性腺中均有表达,以肝胰腺中的相对表达量最高。在安全浓度的阿维菌素、敌百虫和高效氯氰菊酯胁迫下,ES-CXEs基因在中华绒螯蟹肝胰腺中的相对表达量呈明显诱导表达趋势,且ES-CXE5基因的相对表达量高于ESCXE6基因。【结论】从中华绒螯蟹肝胰腺中克隆获得的ES-CXE5和ES-CXE6基因属于CXEs基因家族,在肝胰腺中高表达,且在农药胁迫下这两个基因的表达呈明显诱导表达趋势而参与杀虫剂的代谢解毒过程。 相似文献
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黄颡鱼DMRT1基因cDNA全长克隆及其表达分析 总被引：2，自引：0，他引：2
利用RT-PCR和cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends,RACE)克隆了黄颡鱼DMRT1基因cDNA全长序列,并利用实时荧光定量RT-PCR技术对该基因在黄颡鱼成体不同组织及不同发育阶段的表达情况进行研究。结果表明,黄颡鱼DMRT1基因cDNA序列全长1 381bp,其中5′端非翻译区30bp,3′端非翻译区454bp[不包括poly(A)],开放阅读框885bp,编码295个氨基酸。氨基酸序列同源性分析表明,黄颡鱼DMRT1基因与革胡子鲶同源性最高(为81%),与黑鲷、虹鳟、斑马鱼、青鳉的同源性分别为60%、59%、64%和52%,与小鼠、人的同源性较低,分别为42%和44%。实时荧光定量RT-PCR分析表明:DMRT1基因在黄颡鱼胚胎发育阶段及胚后发育的1～51d仔鱼均有表达,且在胚后发育的第31天表达量最高;在成体,只在雄性精巢中特异性表达,其他组织均无表达,且性腺发育阶段的Ⅳ期精巢表达量最高,表明该基因可能在黄颡鱼雄性性腺的形成或功能维持上具有重要作用。 相似文献
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构建猪SIRT1基因全长编码区(coding region sequence,CDS)的真核表达载体,转染猪原代卵巢颗粒细胞,探讨SIRT1基因过表达对猪卵巢颗粒细胞中AMPK基因的转录及其蛋白活性的影响。测序结果表明,猪SIRT1基因的CDS区全长大小为2 229 bp,与NCBI发布的猪SIRT1基因m RNA序列(EU030283.2)一致;转染p EGFP–C1–SIRT1载体的颗粒细胞中SIRT1的m RNA表达水平和蛋白表达水平极显著高于空载体对照组(P0.01);p EGFP–C1–SIRT1转染组细胞中,AMPK–α1和AMPK–α2基因的m RNA表达量显著高于空载体对照组,且细胞中AMPKαThr172位点的磷酸化水平显著升高(P0.05)。结果表明,体外培养的原代猪卵巢颗粒细胞中的SIRT1基因过表达使AMPK的表达显著增加,影响AMPK的活性,推测SIRT1可能通过AMPK在猪卵巢颗粒细胞凋亡过程中发挥重要的调控作用。 相似文献
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[目的]克隆南美蟛蜞菊肌动蛋白基因(WtActin1),并进行生物信息学及表达稳定性分析,为南美蟛蜞菊耐热耐冷功能基因表达及调控研究提供可靠的内参基因.[方法]RACE克隆WtActin1基因,通过在线生物信息学分析软件对其氨基酸序列进行分析,并利用实时荧光定量PCR检测该基因在不同组织及温度胁迫下的表达情况.[结果]克隆获得的WtActin1基因cDNA全长1682 bp(GenBank登录号MN485900),其中5'非编码区(5'-UTR)170 bp,3'非编码区(3'-UTR)378 bp,开放阅读框(ORF)1134 bp,编码377个氨基酸残基.WtActin1蛋白分子量为41725.81 Da,理论等电点(pI)为5.31,不稳定性指数(II)为37.48,亲水性的平均值(GRAVY)为-0.166,为稳定的亲水性蛋白,无跨膜结构域和无信号肽,主要存在于细胞质中,具有Actin蛋白家族的典型特征结构,其二级结构主要由α-螺旋、β-转角、延伸链和无规则卷曲组成,三级结构同源模型为嵌合肌动(3ci5.1.A),与莴苣、橡胶草和洋蓟的同源蛋白三级结构高度相似.WtActin1基因与其他植物Actin基因核苷酸序列相似性在86.4%以上,其推导氨基酸序列相似性在94.0%以上.从基于Actin氨基酸序列相似性构建的系统发育进化树可看出,WtActin1与同为菊科的莴苣LsActin7亲缘关系最近,与传统分类学相吻合,其次是菊科的橡胶草TkActin1和锦葵科的棉花GhActin.WtActin1基因在南美蟛蜞菊根、茎、叶和花中的表达量均无显著差异(P>0.05,下同),且在高、低温胁迫下与正常温度处理的表达量也均无显著差异.[结论]WtAtin1基因属于Actin基因家族成员,在不同组织及温度胁迫下均能稳定表达,可作为内参基因用于南美蟛蜞菊耐热耐冷功能基因研究. 相似文献