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1.
[目的]建立SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测转基因烟草中外源基因拷贝数的方法,为转基因植物中外源基因拷贝数的检测提供参考.[方法]采用SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法,检测转基因烟草中外源绿色荧光蛋白基因(GFP)的拷贝数,以烟草单拷贝的内源核糖核酸还原酶基因(RNR2)作为内参基因,建立相对定量的双标准曲线法检测转基因烟草中外源基因拷贝数的方法.[结果]构建RNR2基因、GFP基因实时荧光定量PCR的标准曲线,分别为y=-0.2858x+5.6695和y=0.2826x+2.1048,R2分别为0.9994和0.9989,相关性较高.在检测的5株转基因烟草中GFP基因的拷贝数分别为5、8、19、28和45,非转基因烟草植株的GFP基因拷贝数为0.[结论]建立的转基因烟草中外源基因SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法具有简单、快速、准确等优点,可用于基因工程中对优良转化植株的筛选及外源基因表达量的快速检测和定量分析. 相似文献
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探讨TaqMan探针与SYBR Green实时定量PCR 2种方法检测转基因植物外源基因的拷贝数方法的差异。以12株T0转基因水稻为材料,分别用TaqMan与SYBR Green实时定量PCR法检测其拷贝数,然后用SAS 9.1软件对2种方法的结果进行t检验分析。通过SAS对2组数据的t检验分析,在内参基因扩增效率与目的基因扩增效率接近时,SYBR Green与TaqMan探针法的结果接近,差异不显著;当内参基因与目的基因扩增效率差异明显时,SYBR Green与TaqMan探针法差异显著。在内参基因扩增效率与目的基因扩增效率接近时,SYBR Green法测定转基因植物外源基因的拷贝数时结果接近TaqMan探针法。 相似文献
3.
[目的]利用高通量、快速、灵敏的实时荧光定量PCR法,检测转类胰岛素样生长因子1-红色荧光蛋白基因(insulin-like growth factor 1-red fluorescent protein,IGF1-RFP)绵羊中外源基因的拷贝数.[方法]以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)作为绵羊的内源参照基因,梯度稀释法.[结果]分别获得RFP和GAPDH基因的Q值与起始模板数的相关性标准曲线,R2分别为0.999和0.999,相关性高.通过比较目的基因RFP和GAPDH起始模板数,得到外源基因在转基因绵羊中的拷贝数.编号0152、0216、0217、0218的转基因绵羊拷贝数分别为3、1、1、1.[结论]以IGF-Ⅰ转基因细毛羊为研究对象,针对外源基因序列和内源参照基因序列设计特异性引物,利用实时荧光定量PCR法对IGF-Ⅰ转基因细毛羊外源基因的拷贝数进行检测,并且准确检测外源基因的拷贝数. 相似文献
4.
根据转基因油菜RT73品系转入的外源基因质粒图谱,设计品系鉴定的特异性引物,进行SYBR(R) Green Ⅰ实时PCR检测,建立转基因油菜品系鉴定的SYBR(R)Green Ⅰ实时PCR方法.同时针对油菜FatA基因设计出内源基因.结果表明:应用实时PCR技术,利用SYBR(R)Green Ⅰ染料能选择性结合双链DNA的特点,可检测到RT73品系特异性靶序列扩增所产生的荧光信号,且通过溶解曲线确定其熔点值为80.2(±0.5).SYBR(R) Green Ⅰ实时PCR能通过溶解曲线有效地区分特异性产物、非特异性产物以及引物二聚体,是鉴定转基因油菜RT73品系的新方法. 相似文献
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根据转基因油菜RT73品系转入的外源基因质粒图谱,设计品系鉴定的特异性引物,进行SYBR!Green I实时PCR检测,建立转基因油菜品系鉴定的SYBR Green I实时PCR方法。同时针对油菜FatA基因设计出内源基因。结果表明:应用实时PCR技术,利用SYBR Green I染料能选择性结合双链DNA的特点,可检测到RT73品系特异性靶序列扩增所产生的荧光信号,且通过溶解曲线确定其熔点值为80.2(±0.5)。SYBR Green I实时PCR能通过溶解曲线有效地区分特异性产物、非特异性产物以及引物二聚体,是鉴定转基因油菜RT73品系的新方法。 相似文献
6.
根据转基因油菜RT73品系转入的外源基因质粒图谱,设计品系鉴定的特异性引物,进行SYBR!Green I实时PCR检测,建立转基因油菜品系鉴定的SYBR Green I实时PCR方法。同时针对油菜FatA基因设计出内源基因。结果表明：应用实时PCR技术,利用SYBR Green I染料能选择性结合双链DNA的特点,可检测到RT73品系特异性靶序列扩增所产生的荧光信号,且通过溶解曲线确定其熔点值为80.2（±0.5）。SYBR Green I实时PCR能通过溶解曲线有效地区分特异性产物、非特异性产物以及引物二聚体,是鉴定转基因油菜RT73品系的新方法。 相似文献
7.
[目的]优化反向PCR（IPCR）条件分离油菜转基因外源T-DNA的侧翼序列。[方法]以单拷贝的转基因油菜FS4为研究材料,用改良CTAB法提取转基因油菜总DNA,并进行酶切、纯化、自连接,再通过两轮巢式PCR扩增,进行序列对比。[结果]两轮巢式PCR扩增得到1个大小为4.0kb的片段,其序列与油菜数据库中BH652424和BZ044084两序列同源性分别高达97.8%和63.4%。根据序列比对结果设计特异引物对进行PCR验证的结果,也证明了FS4转基因油菜中T-DNA的确插入在该位点。[结论]优化后的IPCR条件能成功分离油菜转基因外源T-DNA的侧翼序列。 相似文献
8.
大米和米制品Bt63转基因检测PCR方法的灵敏度研究 总被引：1，自引：0，他引：1
采用普通PCR法和荧光定量PCR法对Bt63转基因大米的检测灵敏度进行对比研究。根据大米内源蔗糖磷酸合成酶基因SPS和结构特异性基因Btc的基因序列,选用特异性的引物和探针进行研究,经验证试验表明具有专一性,能用于品系鉴定。在灵敏度试验中,阳性转基因大米按照不同质量百分比进行梯度稀释,提取DNA进行PCR扩增。结果表明,普通PCR检测的灵敏度在0.1%左右,而荧光定量PCR检测的灵敏度为0.01%,是普通PCR检测的10倍以上。应用两种方法对实际样品进行检测,都得到了较明显的内源SPS基因的扩增,而Btc基因都是阴性。荧光定量PCR方法避免了电泳检测的步骤,具有更高的安全性和简便性,因此日常检测中,利用荧光定量PCR技术检测Bt63转基因大米及其产品是一种快速、灵敏和准确的检测手段。 相似文献
9.
转基因植物种植地土壤微生物区系生态变化及其外源基因的分子检测 总被引：7，自引：0，他引：7
对转基因植物种植地土壤中微生物种群数量的影响及外源基因是否转移到土壤微生物中的可能性进行检测,是转基因植物生态安全评价的重要组成部分.本研究从云南省农业科学院大棚采集了转基因西红柿及对照土壤样品12份,采用平板稀释法对该土样中的微生物进行分离鉴定,结果表明种植转基因西红柿的土样中微生物的数量和种类有一定的变化.设计35s启动子、反义基因、卡那霉素抗性标记基因等特异引物对上述土样的总DNA,以及菌株DNA进行PCR扩增,均未检测到外源基因扩增产物. 相似文献
10.
PCR检测转基因大豆 总被引：2，自引：0，他引：2
［目的］定性检测转基因大豆。［方法］以非转基因大豆和CP4-EPSPS转基因大豆为材料,以大豆内源基因Lectin和外源基因5-莽草酸-3-磷酸合成酶基因（CP4-EPSPS）为检测的目的片段,建立PCR反应体系。采用改进CTAB法提取大豆基因组DNA,并对所提DNA进行PCR扩增和电泳检测,确定转基因大豆的PCR检测限。［结果］改进CTAB法提取的大豆基因组DNA电泳条带清晰完整,转基因大豆和非转基因大豆基因组DNA均可扩增出约409 bp的条带即Lectin基因,而只在转基因大豆中检测出CP4-EPSPS特异性片段;当转基因大豆的含量为100%～0.2%时,均可扩增出特异性条带。［结论］该研究建立了转基因大豆的PCR检测方法。 相似文献
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[目的]探讨SYBR Green实时定量PCR技术应用于检测转基因植物外源基因拷贝数的可行性。[方法]使用SYBR Green实时定量PCR技术,以转CYCD3;1的拟南芥为材料,通过CYCD3;1基因与单拷贝内参基因以及转基因株系中的CYCD3;1基因与野生型植株的比较来确定外源基因的拷贝数。[结果]该法计算所得外源基因拷贝数与传统高准确性的Southern blot法结果相符。[结论]使用该法检测外源基因拷贝数简单易行,可操作性强。 相似文献
12.
[目的]研究转基因拷贝数对转化植株农艺性状的影响。[方法]以农杆菌介导的遗传转化法获得的水稻转基因植株为材料,观察其株高、分蘖、扬花、籽粒形状及饱满度、抗虫性等。同时获取PCR为阳性的单株叶片进行Southern杂交,检测转入基因的拷贝数,研究转基因拷贝数对转化植株农艺性状的影响。[结果]T0代转基因植株的农艺性状有较多改变,如白化、矮化、分蘖少及种子畸型等。转基因植株的转基因拷贝数影响其农艺性状,拷贝数越多农艺性状改变越大,目标基因越容易受到抑制而不表达。在T0代表现感虫的转化植株其T1代也表现感虫。[结论]转基因植物商品化时,应选择单拷贝的转化植株。 相似文献
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采用优化的数字PCR方法分析转基因小麦外源基因拷贝数 总被引：2，自引：0，他引：2
【目的】 探索基于数字PCR的小麦基因拷贝数分析技术,提高目标基因拷贝数的分析通量,促进小麦基因组研究及基因工程研究。【方法】 采用中国农业科学院作物科学研究所小麦抗逆分子育种课题组创制的高抗小麦黄花叶病转nib8小麦为试验材料,使用小麦D基因组中的单拷贝纯合内源基因PINb-D1b（籽粒硬度基因）为内参基因,根据转化的抗病基因nib8序列设计4对特异性引物及相应探针,通过试验确定探针和引物的最优浓度,优化体系的退火温度,寻找最合适的模板浓度。然后用数字PCR检测转nib8小麦中外源基因的拷贝数;同时用Real-time PCR和Southern blot 2种不同方法分析的拷贝数结果,验证上述采用数字PCR方法分析拷贝数的准确性;以PINb-D1b内参基因检测Wx012（蜡质基因）和SSII（淀粉合成基因）2个内参基因的拷贝数,以Wx012和SSII为内参基因检测转nib8小麦中外源基因的拷贝数,验证以PINb-D1b内参基因的检测结果准确性;在nib8的不同区段设计特异性引物来检测转nib8株系拷贝数分析结果是否有差异。最终,建立基于数字PCR技术的高通量检测小麦目标基因拷贝数的分析方法。【结果】 通过试验最终确定了基于数字PCR方法的小麦目标基因拷贝数的检测体系。试验确定引物和探针的最佳终浓度分别为500和250 nmol·L-1,确定体系反应最佳退火温度为59℃,最佳DNA模板量为40 ng。以PINb-D1b作为内参基因检测转nib8小麦中nib8的拷贝数,拷贝数检测结果显示第12、16、17、23、29、30株系中nib8拷贝数分别为7个、1个、1个、1个、1个、7个;同时通过比较发现此结果与Real-time PCR以及Southern blot结果一致;在转基因株系中,以PINb-D1b为内参基因,对Wx012和SSII 2个基因进行拷贝数进行分析,同时发现采用这3种内参基因分析转nib8小麦中nib8基因拷贝数的结果一致,说明这3个内参基因都适合用于数字PCR方法;在nib8上游、中游和下游不同区段的设计引物分析拷贝数检测结果一致。【结论】 优化了基于数字PCR方法的小麦目标基因拷贝数分析方法和反应体系,确立了基于数字PCR方法的小麦目标基因拷贝数的检测体系,数字PCR分析结果稳定、可靠,检测通量明显提高,具有一定的应用前景。 相似文献
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【目的】建立一种能检测猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）含量的荧光定量RT-PCR方法,为猪传染性胃肠炎（TGE）的诊断和防治提供技术支持。【方法】根据TGEV TH98株的N基因序列设计1对特异性引物,扩增出目的片段,连接克隆载体后构建质粒标准品;对荧光定量的循环条件进行优化,建立猪传染性胃肠炎病毒荧光定量RT-PCR检测方法,对其重复性、特异性进行检测,并与普通PCR检测方法进行比较,最后应用该方法对采自陕西杨凌周边的30份临床样品进行检测。【结果】成功构建了质粒标准品,建立了检测猪传染性胃肠炎病毒的荧光定量RT-PCR方法,该方法特异性高、重复性好、敏感性比普通PCR检测方法高2个数量级,对质粒标准品的线性检测范围为1.0×107～1.0×101拷贝/μL。用建立的检测方法对从陕西杨凌周边猪场采集的30份样品进行检测,检出4份阳性,与普通PCR检测方法符合率为100%。【结论】建立的TGEV荧光定量RT-PCR方法敏感性高、特异性好、省时省力,可以对猪传染性胃肠炎病毒进行快速检测。 相似文献
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[目的]探讨SYBR Green实时定量PCR技术应用于检测转基因植物外源基因拷贝数的可行性。[方法]使用SYBR Green实时定量PCR技术,以转CYCD3;1的拟南芥为材料,通过CYCD3;1基因与单拷贝内参基因以及转基因株系中的CYCD3;1基因与野生型植株的比较来确定外源基因的拷贝数。[结果]该法计算所得外源基因拷贝数与传统高准确性的Southern blot法结果相符。[结论]使用该法检测外源基因拷贝数简单易行,可操作性强。 相似文献
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猪圆环病毒2型（porcine circovirus 2, PCV2）,是感染猪Sus scrofa domestica的一种单链DNA病毒。建立一种快速、灵敏的检测方法,对于PCV2感染猪的筛选和疾病预防非常重要。根据PCV2 ORF2基因保守区,设计了荧光定量聚合酶链式反应（PCR）引物,利用SYBR Green作为荧光染料建立了一种定量检测PCV2的PCR方法。结果表明:该方法具有灵敏度高、特异性强和重复性好的优点,每微升的最低检测限低至101拷贝DNA。利用该方法对34份PCV2阳性临床样本进行检测,检测符合率为100%,明显高于普通PCR方法的50.0%。因此,本研究建立的PCV2实时荧光定量PCR检测方法为该疾病的预防和控制提供一种有效的检测工具。图4表4参26 相似文献
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利用反转录PCR （RT-PCR）技术扩增出猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5基因部分片段,并克隆到pGEM-T Easy载体上,得到重组质粒作为荧光定量PCR检测的标准模板,以10倍梯度稀释模板,进行SYBR GreenⅠ荧光定量PCR扩增并制作标准曲线,建立PRRSV的荧光定量PCR检测方法。该方法检测灵敏度可达10拷贝/μL,与猪圆环病毒、猪乙型脑炎病毒、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒、猪流感病毒和猪细小病毒不发生交叉反应,具有良好的特异性和重复性;对16份临床疑似病料进行了检测,发现15份均为荧光定量PCR阳性,而常规RT-PCR只能检测出12份阳性。结果表明,建立的实时荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于临床PRRSV感染的早期诊断以及分子流行病学调查。 相似文献
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CYP71AV1和CPR基因在转基因青蒿后代中的遗传分析 总被引：1，自引：1，他引：0
为研究CYP71AV1和CPR基因在转基因青蒿后代中的遗传及表达特性,在获得共转CYP71AV1和CPR基因青蒿(GYR)T0代的基础上,对其T2代用普通PCR和Southern Blot分别检测了目标基因分离比及部分植株中目标基因拷贝数;利用实时定量PCR分析了部分植株中目标基因的转录水平;利用HPLC-ELSD测定了其青蒿素含量;对其关键农艺性状也进行了测定。结果表明虽然目标基因在世代间可以顺利遗传,但其拷贝数则有一些不规则的变化,转基因位点的纯合较难实现;目标基因的表达也受到基因组的修饰限制系统影响。T2代青蒿素含量最高的一组平均含量比对照提高46.9%,植株鲜重和叶片干重则没有显著差异。本研究为进一步获得遗传稳定的转基因青蒿株系打下了基础。 相似文献
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[目的]建立检测阪崎克罗诺杆菌中转座子拷贝数的实时定量PCR方法。[方法]以单拷贝持家基因atpD作为内参基因,建立同时含有单拷贝持家基因atpD和EZ-TN5转座子的重组质粒;建立atpD基因与EZ-TN5转座子实时定量检测的标准曲线,并利用所建立的标准曲线,对3株阪崎肠杆菌突变株中atpD基因和EZ-TN5转座子的拷贝数进行检测,并计算其比值。[结果]atpD基因与EZ-TN5转座子实时定量检测标准曲线的相关系数分别为0.999和0.998;3株突变株中atpD基因和EZ-TN5转座子拷贝数比值分别为0.98、1.17与0.91,证明突变株中转座子为单拷贝。[结论]该研究所建立的实时定量PCR方法实用性强,可替代Southern杂交用于不同细菌中EZ-TN5转座子拷贝数的检测。 相似文献
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猪圆环病毒2型（PCV2）是一种引起仔猪Sus scrofa多系统衰竭综合征、免疫抑制、皮肤肾病综合征等疾病的病原体。根据GenBank中PCV2 ORF1基因序列设计合成特异性引物和探针,以PCV2基因组DNA为模板,通过聚合酶链式反应（PCR）扩增目的片段,并将目的片段克隆至pMD18-T载体,构建阳性标准品。以阳性标准品为模板,优化荧光定量PCR反应条件,建立标准曲线,进行灵敏性、重复性和特异性验证,并应用此方法对临床样品进行检测。结果表明:阳性质粒标准品构建成功,该检测方法的引物与探针的最佳浓度皆为0.2 μmol·L-1,线性检测范围为2.1×1013~2.1×106拷贝·L-1,最低检测限值为8.828×106拷贝·L-1,且与其他相关疾病无交叉反应;各批次检测变异系数低,检测方法稳定性好。本研究建立的敏感性高、特异性好的实时荧光定量PCR方法,为PCV2的快速检测提供了新工具。 相似文献