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《畜牧与兽医》2020,(3):139-144
DNA、RNA和蛋白质的化学修饰都是表观遗传学重要的研究内容,近年来,随着科学技术的快速发展,基于DNA和蛋白质修饰研究基础,RNA甲基化研究在表观遗传领域已成为前沿的研究热点。在150余种RNA化学修饰中,RNA甲基化修饰约占60%以上,广泛分布于各种类型的RNA中,各种甲基化修饰在细胞内行使着不同的生物学功能,其中RNA甲基化修饰m~6A是最常见、最丰富的真核生物mRNA转录后修饰。m~6A的形成过程是由甲基转移酶复合体(METTL3、METTL14和WTAP等组成)、去甲基酶(FTO和ALKBH5)以及结合蛋白(YTHDF1/2/3、YTHDC1)动态调控,与基因表达调控密切相关。其次,m~6A可能参与了mRNA转录、选择性剪切、出核转运、翻译及降解等过程,从而导致RNA功能紊乱,进而影响一系列的动物生命活动。因此RNA甲基化修饰m~6A介导的表观遗传学调控对动物繁殖以及生长发育有着重要的意义。本文重点根据在动物方面相关研究对m~6A的动态调控及由调控过程所产生的影响进行归纳总结。 相似文献
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试验旨在研究RNA m6A修饰相关基因去甲基化酶Alk B同源蛋白5（Alk B homologue 5，ALKBH5）、去甲基化酶肥胖相关蛋白（fat mass and obesity-associated protein，FTO）、甲基转移酶样蛋白3（methyltransferase like 3，METTL3）、甲基转移酶样蛋白14（methyltransferase like 14，METTL14）和成肾细胞瘤1-结合蛋白（Wilms’tumor 1-associating protein，WTAP）在鸡骨骼肌发育过程中的表达，分析其与骨骼肌m6A甲基化水平的相关性。首先，利用实时荧光定量PCR技术检测m6A甲基化相关基因在金茅花鸡12（E12）、14（E14）、16（E16）、18（E18）胚龄和1日龄腿肌和胸肌组织中mRNA表达水平，以及其在鸡成肌细胞50%、100%增殖期和1、2、3、4、5 d分化期的mRNA表达水平；随后，利用m6A甲基化试剂盒检测金茅花鸡E12和1日龄腿肌和胸肌组织中m6A甲基化修饰水平，与m6A甲基化相关基因表达水平进行相关性分析。结果显示，m6A去甲基化基因ALKBH5和FTO mRNA表达水平在骨骼肌发育过程中显著上调（P<0.05），即在E12、E14低表达，E16、E18逐渐上调，1日龄达到最高。m6A甲基化写入基因METTL14、METTL3和WTAP mRNA表达水平在E12、E14、E16逐渐上升，E18下降，随后至1日龄表达量回升。在细胞增殖过程中，ALKBH5、FTO、METTL14、METTL3和WTAP基因表达均上调；在细胞分化过程中ALKBH5和FTO基因表达水平显著上调（P<0.05），在分化第5天达到最高。METTL14、METTL3和WTAP基因mRNA表达水平在细胞诱导分化的1、2、3、4 d表达量呈下降趋势，而在诱导分化的第5天有所回升。甲基化水平检测结果显示，腿肌和胸肌m6A甲基化水平变化趋势一致，均在胚胎发育过程中显著下降（P<0.05），至1日龄达到最低。相关性分析结果显示，鸡骨骼肌RNA m6A甲基化水平与m6A去甲基化修饰基因ALKBH5、FTO mRNA表达水平呈显著负相关（P<0.05）。综合以上试验结果，推测m6A甲基化修饰与鸡骨骼肌发育相关，而去甲基化基因ALKBH5、FTO可能通过调控RNA m6A甲基化水平，影响鸡骨骼肌发育。本研究结果为进一步研究m6A甲基化修饰调控鸡骨骼肌生长发育的功能和分子机制提供理论依据。 相似文献
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BmVMP23已被预测为一种编码家蚕卵黄膜蛋白的基因,该基因在家蚕"明"死卵突变体(l-em)中呈显著下调表达,并已证明其终止密码子后的序列发生了变异。为研究变异位点是否位于BmVMP23的3'-UTR区段及序列变异对该基因表达的影响,通过RACE扩增获得BmVMP23的全长cDNA序列,证实突变位点位于BmVMP23的3'-UTR区段。在此基础上,以突变体l-em及正常型的BmVMP23 3'-UTR序列为实验模型,构建以EGFP为报告基因的重组载体pMD18-T(A3-EGFP-SV40)、pMD18-T[A3-EGFP-3'UTR(WT)]和pMD18-T[A3-EGFP-3'UTR(l-em)],并将其分别转染BmN细胞观察EGFP的表达。结果显示,转染pMD18-T(A3-EGFP-SV40)和pMD18-T[A3-EGFP-3'UTR(WT)]质粒的细胞均能检测到绿色荧光,而转染pMD18-T[A3-EGFP-3'UTR(l-em)]质粒的细胞检测不到绿色荧光。上述结果证实BmVMP23的正常表达须具有完整的3'-UTR,由此认为"明"死卵突变体中BmVMP23基因表达量的降低是因其3'-UTR的变异引起的。 相似文献
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本文旨在研究猪睾丸ACE启动子驱动的SPAG6 shRNA在猪睾丸支持细胞（ST）中的干扰作用。利用PCR法从ST细胞基因组中扩增猪睾丸ACE启动子,构建重组质粒ACE-pIRES2-DsRed、ACE-pGL3-basic,通过红色荧光蛋白表达和双荧光素酶报告基因检测试验检测猪睾丸ACE启动子在ST细胞中的转录活性;根据SPAG6 mRNA靶序列设计合成3条siRNA序列,通过脂质体转染至ST细胞,利用实时荧光定量PCR及Western Blot检测siRNA的干扰效率;基于人miR-30a结构设计SPAG6 shRNA,构建重组载体ACE-sh-SPAG6-pcDNA3.1,Western Blot检测其对SPAG6的干扰效果。结果表明,成功构建重组质粒ACEpIRES2-DsRed、ACE-pGL3-basic,并证明猪睾丸ACE启动子在ST细胞中具有较强的转录活性;各试验组均能对靶基因SPAG6 mRNA的表达产生抑制作用,以siRNA-3的作用最佳。siRNA-3转染48 h后,SPAG6蛋白表达量显著下降（P<0.001）,成功筛选出SPAG6基因的最佳干扰序列;成功... 相似文献
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《畜牧与兽医》2015,(6):54-59
利用在线预测软件对牛C4A基因的5'侧翼区序列进行生物信息学分析,成功构建了一系列表达载体,利用双荧光素酶报告基因检测系统分析牛C4A基因的5'侧翼区启动活性。分别通过定点突变技术构建突变质粒,研究调控C4基本表达和诱导表达的转录因子结合位点。利用EMSA技术验证转录因子在研究细胞系中存在与否。结果显示,C4A基因启动子序列转录起始位点上游169 bp为报告基因荧光值最高的片段,即为启动子核心区;其中SP1(-169~-158)、E-box(-122~-117)和AP-1(-80~-71)是调控C4基本表达的主要转录因子结合位点,且3个转录因子在Hep G2细胞系中真实存在。 相似文献
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本研究通过构建腺病毒介导的体外超表达载体，探究腺苷甲硫氨酸转移酶2A（methionine adenosyltransferase 2A，MAT2A）基因在猪肌内脂肪细胞分化中的作用。根据GenBank中猪MAT2A基因mRNA序列（登录号：NM_001167650.1）设计引物，提取猪脂肪组织细胞总RNA并反转录获得cDNA，以此为模板进行PCR扩增并连接到pAdTrack-CMV腺病毒穿梭载体中，对重组质粒pAd-MAT2A进行测序鉴定；pAd-MAT2A载体经PacⅠ限制酶酶切线性化，经质粒大片段回收纯化后转染293A细胞进行病毒包装；采用实时荧光定量PCR检测MAT2A基因表达情况，并提取蛋白进行Western blotting分析，取分化第8天的细胞进行油红O染色。结果表明，穿梭载体pAdTrack-CMV-MAT2A构建成功，并能与骨架载体pAdEasy-1实现同源重组；腺病毒载体pAd-MAT2A转染293A细胞后，病毒滴度达到1E+6 PFU/mL，可满足侵染猪肌内脂肪细胞的需要。实时荧光定量PCR和Western blotting结果显示，MAT2A基因mRNA和蛋白水平均显著上调。油红O染色结果显示，过表达MAT2A基因可促进猪肌内脂肪细胞内脂滴聚积。结果表明，腺病毒介导的MAT2A基因过表达在猪肌内脂肪细胞中呈上调趋势，MAT2A基因可促进脂质积累。 相似文献
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N6-甲基腺嘌呤（N6-methyladenosine，m6A）修饰是现阶段发现的真核生物体内最广泛的RNA表观遗传修饰方式，近年来研究显示，m6A在真核生物间具有较高的保守性，在基因表达及细胞命运调控中发挥着关键作用，且对mRNA的可变剪接、定位、翻译及稳定性有较大影响。现有的m6A修饰检测技术可以较为准确、高效地检测出生物样本中的m6A修饰丰度，并能快速、简便地进行m6A修饰的高通量测序，以及在单碱基分辨率下检测m6A修饰在RNA上的位置。尽管m6A修饰相关调控蛋白对畜禽复杂经济性状的影响近年来已有少量报道，但其中的作用机制仍未得到充分阐明。大量人类及模式生物上的研究表明，m6A修饰相关蛋白能够影响生长发育、繁殖、热应激、炎症及癌症等生物学过程，为探究畜禽m6A修饰参与复杂性状调控机制提供一定的借鉴意义。作者主要从m6A甲基化修饰相关蛋白（甲基转移酶、去甲基化酶及读取蛋白）、m6A检测技术、m6A对哺乳动物复杂性状的调控机制、m6A与其他表观修饰的互作机制等方面进行阐述，为m6A在畜禽遗传育种中的应用提供新的见解。 相似文献
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N6-腺苷酸甲基化(N6-methyladenosine,m6A)是真核生物mRNA的一种转录后修饰,是一个动态可逆过程,由甲基转移酶、去甲基化酶和结合蛋白催化,介导真核生物的各种生物学过程,参与多种细胞基因表达调控和疾病的病理过程。近年来,随着人们对RNA修饰认识的不断深入和和高通量测序技术的发展,人们对m6A甲基化修饰在细胞分化、动物生长发育、疾病的发生等生物学功能的探索也越来越迫切。作者介绍了m6A甲基化修饰的特征及其相关的3种酶、m6A修饰的检测技术,及其在mRNA调控、干细胞分化、肿瘤发生和转移上的生物学功能,简述了m6A甲基化修饰对畜禽(如猪、鸡)生长发育方面的调控,最后对m6A甲基化修饰在未来的研究方向及发展前景做出展望,以期为后续m6A甲基化修饰在动物生长过程中的深入研究和预防治疗疾病上的应用提供参考。 相似文献
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真核生物的基因表达调控在生物体生长发育过程中发挥着重要作用,涉及转录、翻译及mRNA和蛋白质的周转等多种生物学过程。研究表明,mRNA的3'端非翻译区（3'UTR）与转录后基因表达关系密切,3'UTR在mRNA稳定性、亚细胞定位及翻译等生物学过程中发挥着重要的调控作用。3'UTR序列的变异,可引起基因的异常表达,导致疾病发生。作者主要对3'UTR在基因表达调控、人类疫病和畜禽生产中的作用等研究进行了综述,以期为3'UTR调控机制在人类疫病诊断与治疗,以及畜禽生产中的应用提供理论依据。 相似文献
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随着人们生活水平的提高，近年来优质农业动物肉产品深受我国消费者市场青睐，而脂肪沉积是影响肉品质的重要因素。因此，阐明脂肪沉积的规律对探究动物优质肉品质形成的分子机理具有重要意义。N6-甲基腺苷修饰(m6A)是真核生物中含量最丰富的一种RNA表观遗传修饰，其与RNA运输、表达及降解等多种生物学事件密切相关。研究表明人胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白2(IGF2BP2)介导的m6A修饰在动物脂肪沉积过程中发挥着关键作用，因此本文将论述m6A、IGF2BP2及其调控动物脂肪沉积的作用及分子机制研究进展，以期未来为家畜肉品质改良提供候选基因和科学依据。 相似文献
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为了确定miR-23a是否靶向调控Smad3基因,试验利用NotⅠ和XhoⅠ酶构建包含Smad3-3′-UTR的野生型(psiCHECKTM-2-W-Smad3-3′-UTR)和突变型双荧光酶报告载体(psiCHECKTM-2-M-Smad3-3′-UTR),并在PK-15细胞中转染miR-23amimics、miR-23ainhibitor及其阴性对照,采用双荧光酶检测试剂盒检测荧光素酶活性,用实时荧光定量PCR和Western blotting法分别检测Smad3基因的mRNA和蛋白表达水平。结果表明,将含Smad3-3′-UTR的野生型和突变型双荧光酶报告载体与miR-23amimic共转染PK-15细胞,野生型报告质粒表达的荧光素酶活性显著低于其阴性对照组(P<0.05);转染miR-23amimics能显著下调Smad3基因mRNA及其蛋白表达水平(P<0.05);而转染miR-23ainhibitor组与miR-23ainhibitor阴性对照组相比,Smad3基因蛋白表达差异不显著(P>0.05)。综合上述结果可知,猪miR-23a可靶向作用于Smad3基因。 相似文献
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为了确定miR-23a是否靶向调控Smad3基因,试验利用NotⅠ和XhoⅠ酶构建包含Smad3-3′-UTR的野生型(psiCHECKTM-2-W-Smad3-3′-UTR)和突变型双荧光酶报告载体(psiCHECKTM-2-M-Smad3-3′-UTR),并在PK-15细胞中转染miR-23amimics、miR-23ainhibitor及其阴性对照,采用双荧光酶检测试剂盒检测荧光素酶活性,用实时荧光定量PCR和Western blotting法分别检测Smad3基因的mRNA和蛋白表达水平。结果表明,将含Smad3-3′-UTR的野生型和突变型双荧光酶报告载体与miR-23amimic共转染PK-15细胞,野生型报告质粒表达的荧光素酶活性显著低于其阴性对照组(P0.05);转染miR-23amimics能显著下调Smad3基因mRNA及其蛋白表达水平(P0.05);而转染miR-23ainhibitor组与miR-23ainhibitor阴性对照组相比,Smad3基因蛋白表达差异不显著(P0.05)。综合上述结果可知,猪miR-23a可靶向作用于Smad3基因。 相似文献