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[目的]研究谷氨酸脱氢酶的表达对L-丝氨酸产率及发酵效率的影响.[方法]从谷氨酸棒杆菌模式菌株C.glutamicum ATCC39135中克隆出gdh基因,以大肠杆菌-黄色短杆菌穿梭表达载体pEC7为基础,构建重组质粒pEC7G,并转化黄色短杆菌B.flavum C -11,获得重组菌株C-11G.[结果]重组菌株C-11G的GDH酶活力提高32.7;,产酸率为15.28 g/L,比原宿主菌提高了33.80;.[结论]成功构建重组菌株C-11G,所克隆的gdh基因有较高表达活性,并对L-丝氨酸产量的提高有促进作用. 相似文献
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磷酸丝氨酸转氨酶(Phosphoserine aminotransferase,SerB)是L-丝氨酸生物合成中的关键酶,应用PCR技术从大肠杆菌JM109(E.Coli JM109)中扩增出磷酸丝氨酸转氨酶基因,将其与表达载体pEC 7连接.通过电转化方法,将重组质粒转入黄色短杆菌(Brevibacterium flavum C-11,BfC-11)中,经酶活检测和摇瓶发酵培养,含有重组表达质粒的BfC-11B的磷酸丝氨酸转氨酶的活力和L-丝氨酸产率均比原宿主菌BfC-11有所提高,为构建L-丝氨酸高产基因工程菌的研究奠定了基础. 相似文献
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磷酸丝氨酸转氨酶(serC)基因的克隆与原核表达 总被引：1，自引：1，他引：0
[目的]检测磷酸丝氨酸转氨酶(serC)基因在大肠杆菌中能否高效表达.[方法]根据GenBank所公布的serC基因序列设计一对特异性引物,以E.coliJM109基因组为模板PCR扩增目的基因片段,将得到的目的基因定向克隆至大肠杆菌/黄色短杆菌穿梭表达载体pEC7中,构建重组表达载体并转化宿主菌E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE分析.[结果]通过PCR扩增得到约1 100 bp的DNA片段,经测序后分析该基因与已发表的serC基因具有99.27;的同源性;对重组表达载体进行酶切和PCR方法鉴定正确的命名为pEC7- C;重组表达载体转化宿主菌,SDS-PAGE分析可见约41 kD与理论大小一致的目标蛋白条带.[结论]重组表达载体转化后E.coli BL21中蛋白表达量比原始菌株的蛋白表达量高,证明 serC基因在E.coli BL21(DE3)中成功表达,为进一步构建L-丝氨酸高产基因工程菌奠定了基础. 相似文献
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侧孢短芽孢杆菌碱性蛋白酶基因BLG4在枯草芽孢杆菌WB600中的高效表达 总被引：1，自引：0，他引：1
侧孢短芽孢杆菌G4菌株在侵染线虫的过程中可以分泌蛋白酶,降解线虫体壁,从而帮助细菌侵入宿主体内.在本文中,侧孢短芽孢杆菌的胞外蛋白酶BLG4基因经克隆后插入到改造后的枯草芽孢杆菌表达载体pWT22中,构建重组表达质粒pWT22-BLG4.构建成功的重组质粒通过化学转化法转入枯草芽孢杆菌蛋白酶缺失菌株WB6000中,转化... 相似文献
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《安徽农业科学》2020,(11)
[目的]建立纳塔葡糖酸醋杆菌遗传操作系统,为采用基因工程方法改造该类菌株,提高纤维素产量,提升纤维素品质提供参考依据。[方法]通过优化培养基确定菌株电转化感受态制备条件,采用质粒或者线性化片段在不同电压下进行转化,优化最佳转化条件。[结果]采用添加了1%纤维素酶的C2培养基进行1次摇瓶转接,可有效制备纳塔葡糖酸醋杆菌电转化感受态;采用携带同源臂及Kan抗性基因的环状质粒或者线性化片段均实现了对纳塔葡糖酸醋杆菌葡萄糖脱氢酶基因(GDH)的同源双交换基因敲除;GDH基因的敲除降低了工程菌株发酵产纤维素膜过程的葡萄糖酸产生,提高了细菌纤维素的最终产量及品质。[结论]成功建立了纳塔葡糖酸醋杆菌遗传转化方法和基因敲除方法。 相似文献
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利用组成型表达载体pMG36e电转化乳酸乳球菌ML23的研究 总被引：3，自引：0，他引：3
为了探明乳酸菌电转化的最适条件,提高电转化效率,本试验以大肠杆菌-乳酸菌穿梭型质粒pMG36e为载体,以乳酸乳球菌ML23为受体,利用电转化方法研究了受体菌株的生长状态与细胞壁处理方式、质粒浓度、电场强度、复苏培养基组成与复苏培养时间、受体菌株的限制修饰作用对电转化效率的影响。结果表明:含2%甘氨酸和0.5 mol/L蔗糖的MRS培养基培养至对数生长中期的细胞,在电场强度11.0 kV/cm、电阻200Ω、电容25μF下电击转化,转化后细胞在SMRS培养基中培养2 h,获得了较高的电转化效率。采用受体菌株修饰的质粒进行电转化,转化效率又提高了15倍以上,达1.05×105CFU/μg DNA。 相似文献
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胶状溶杆菌OH17菌株遗传操作系统的构建 总被引：1，自引：0，他引：1
《南京农业大学学报》2017,(4)
[目的]建立胶状溶杆菌(Lysobacter gummosus)OH17菌株的遗传操作系统,通过基因重组方法来研究调控基因的功能及次级代谢产物的生物合成途径。[方法]分别将整合型突变质粒p JQ-pilR和用于同源重组的、包含参与抗菌物质生物合成的DNA片段的质粒p SEVA321-pilR,通过电转化法各自导入L.gummosus OH17之中。[结果]通过电转化获得正确转化子,结合基因重组获得突变菌株,采用PCR验证和酶切验证重组质粒的导入和目标基因pilR的缺失,进一步对突变菌株的发酵产物进行了HPLC分析,结果表明突变株合成热稳定抗真菌因子(heat-stable antifungal factor,HSAF)能力明显下降,通过将pilR回补,其合成HSAF的能力得到一定程度恢复。[结论]成功构建了L.gummosus OH17遗传操作系统,包括基因定位缺失突变系统和基因功能互补系统,为以后对OH17及其他胶状溶杆菌进行代谢产物合成及其调控基因的功能研究奠定了遗传操作基础。 相似文献
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[目的]利用响应面法对黄色短杆菌c-11发酵培养基进行优化,以提高L-丝氨酸产率.[方法]先采用Plackett - Burman实验法对发酵培养基8个因素(蔗糖、酵母膏、硫酸铵、KH2 PO4、MgSO4、生物素、VB1和碳酸钙)的效应进行评价,筛选出主要因素.之后采用最陡爬坡试验逼近主要因素(蔗糖、酵母膏和硫酸铵)的最大响应区域.在此基础上,采用Box - Behnken结合响应面法(RSM)确定主要因素的最佳水平,并通过二次方程回归分析.[结果]蔗糖浓度为83 g/L、酵母膏浓度为31 g/L和硫酸铵浓度为29 g/L时,此时模型稳定点预测值L-丝氨酸产量为22.27 g/L,验证值为22.65 g/L,预测值与验证值之间吻合较好.[结论]优化后的发酵培养基使c-11菌株的L-丝氨酸产量提高了28.11;. 相似文献
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野生型根癌农杆菌对马铃薯的遗传转化研究 总被引：1，自引：0，他引：1
用不同的野生型根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)T37、B6、TFA16YET、FA16YK对马铃薯普通栽培种甘农薯1号的块茎圆片、茎段、叶切片、试管苗,美国引进品种褐皮.布尔班克的块茎圆片以及新型栽培种NW-174实生苗的子叶及下胚轴等组织进行了离体侵染和整株侵染实验,发现:不同的菌种对同一组织以及相同的菌种对不同组织的侵染效果均不同。在供试菌株中,以TFA16YE的转化效果最好。对NW-174新型栽培种实生苗的子叶、下胚轴进行的侵染实验表明,这两种组织的转化率较高。结果表明,在离体转化程序中,外植体的生理状态、发育阶段以及供试菌株的代谢活性及培养条件等均是影响转化效率的重要因素。 相似文献
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[目的]建立根癌农杆菌介导的泡盛曲霉遗传转化系统,探讨利用泡盛曲霉表达异源蛋白的可行性。[方法]从国内主要菌种库中购买泡盛曲霉菌株,根据分泌蛋白图谱分析确定合适的宿主菌,在此基础上通过药物敏感性分析确定遗传转化的选择标记,并利用构建的泡盛曲霉遗传转化体系对米黑根毛霉脂肪酶基因RML进行转化、表达研究,通过转化子鉴定及性质分析考察泡盛曲霉作为异源蛋白表达系统的可行性。[结果]通过分泌蛋白图谱分析确定泡盛曲霉CBS115.52和CICC2257作为异源蛋白表达的宿主菌;药物敏感性试验确定潮霉素抗性基因(HygBr)作为有效的遗传选择标记;在此基础上,利用根癌农杆菌介导的转化方法(agrobacterium tumefaciensmediated transformation,ATMT),将带有HygBr的质粒pHGW-amdS成功导入泡盛曲霉宿主菌CBS115.52,建立以HygBr为选择标记的泡盛曲霉遗传转化体系。利用该体系,介导米黑根毛霉脂肪酶(Rhizomucor miehei lipase,RML)的表达载体转化泡盛曲霉,通过底物水解试验、SDS-PAGE及Western blot确定RML基因已在泡盛曲霉中表达。[结论]该研究证明了根癌农杆菌介导转化泡盛曲霉作为异源蛋白的表达体系具有潜在的可行性。 相似文献
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利用改进的冻融法和电击法成功地将带有编码DREB转录因子GmDREB基因的prdGm-200双元载体分别导入根癌农杆菌EHA101、EHA105和LBA4404菌株中,同时探讨了影响冻融法和电击法转化效率的因素。结果表明:农杆菌细胞OD600约为0.6时冻融法和电击法的转化效率均较高。在利用冻融法转化农杆菌时,新制备的感受态细胞有利于提高转化效率。在进行电击法转化农杆菌时,电场强度和脉冲时间都对农杆菌的转化效率有影响。 相似文献
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农杆菌介导苹果炭疽病菌的遗传转化及转化子鉴定 总被引：1，自引：0，他引：1
【目的】优化农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导转化苹果炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）的技术体系,并对转化子进行筛选鉴定,比较其生物学特性和致病性差异。【方法】以苹果炭疽病菌LXS010101分生孢子为转化受体,利用携带重组双元载体的农杆菌进行转化;对获得的转化子进行遗传稳定性测定、PCR检测及Southern blot分析;选取一定数量的转化子,比较其菌落形态、生长速率及分生孢子发育等主要生物学性状及致病性的差异。【结果】苹果炭疽病菌的最优转化体系为：病菌分生孢子悬浮液浓度1×105个/mL,共培养温度和时间分别为22℃和24 h,共培养基中添加200 μmol•mL-1乙酰丁香酮,其转化效率达到1×105个孢子可获得439个转化子。随机选取30个转化子进行鉴定,发现T-DNA已整合进炭疽病菌基因组中,在所检测的转化子中都是以单拷贝的形式整合,且能够稳定遗传。与野生型菌株相比,转化子的菌落形态没有发生明显变化,但23.33%的菌株生长速率显著减低;转化子ATJ-3和ATJ-15不能产生分生孢子,在28个产孢菌株中,分生孢子萌发率显著减低的菌株占39.29%,附着胞形成比例显著减低和形态异常的菌株占25.00%。致病性测定结果显示,11个转化子的致病力显著降低,其中菌株ATJ-19完全丧失致病能力。【结论】优化的苹果炭疽病菌遗传转化技术体系,可用于炭疽病菌致病相关基因的克隆及致病分子机理的研究。 相似文献