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1.
本研究旨在对猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)N基因进行克隆构建、表达与其B细胞抗原表位性质的预测。将PEDV的N基因进行PCR扩增,克隆到原核表达载体pET-28a(+)中,经酶切验证获得阳性克隆,将阳性克隆在表达菌E. coli BL21(DE3)中表达。通过对表达条件及纯化条件的优化,获得高纯度表达蛋白。利用生物信息同源模型化软件Swiss-Pdb Viewer建立PEDV-N蛋白的3D结构,并根据生物信息学软件DNA-Star预测PEDV-N蛋白的二级结构、抗原性、亲水性和表面可及性分析,综合分析预测其B细胞抗原表位。经预测PEDV-N蛋白氨基酸序列中存在13个B细胞优势抗原表位区域。研究结果将进一步为PEDV-N蛋白体外表达产物的应用及研制基因工程疫苗提供理论基础。 相似文献
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试验旨在克隆表达羊口疮病毒安徽株023基因,对该基因进行PCR扩增、亚克隆及表达,通过蛋白表达纯化后进行SDS-PAGE和Western blot鉴定,并利用生物信息学软件预测该基因编码的蛋白的理化性质、二级结构、信号肽、跨膜结构域等。结果显示,023基因全长819 bp,编码272个氨基酸,蛋白大小约为42 ku,主要以包涵体的形式表达且有良好的反应原性。生物信息学分析表明,该蛋白是亲水稳定蛋白,其中α-螺旋(h)占27.57%,延伸链(e)占17.28%,β-转角(t)占12.13%,无规则卷曲(c)占43.01%,无信号肽区域和跨膜结构域,可能存在30个磷酸化位点,4个B细胞抗原表位,3个CTL表位和3个Th表位。研究结果不仅有助于了解羊口疮病毒023基因的结构与功能,还能为建立快速诊断的检测方法提供参考。 相似文献
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利用PCR方法扩增猪细小病毒7型(porcine parvovirus 7,PPV7)的Cap基因,将扩增产物克隆至pGEX-6P-1原核表达载体,构建重组质粒pGEX-6P-1-Cap,并进行测序鉴定。经鉴定正确后的重组质粒转化至E. coli Rosetta感受态细胞进行IPTG诱导表达,利用SDS-PAGE和Western-blot进行鉴定。同时使用生物信息学软件预测该基因编码的蛋白的理化性质、二级结构、信号肽和跨膜结构域等。结果表明,成功从病料中扩增到Cap基因并构建获得重组质粒pGEX-6P-1-Cap,诱导表达出大小约为78 ku的Cap蛋白,与预期相符。诱导获得的Cap蛋白能够与GST单抗发生特异性反应,具有良好的反应原性。生物信息学分析结果显示,该蛋白是亲水稳定蛋白,二级结构中以无规则卷曲(c)结构居多,占62.90%,α螺旋(h)、β转角(t)、延伸链(e)分别占11.09%、4.05%、21.96%,无信号肽区域和跨膜结构域,存在62个磷酸化位点,12个B细胞抗原表位,2个CTL表位和3个Th表位。本研究成功表达了PPV7 Cap蛋白并预测其生物学特性,为该蛋白质的生物学功能相关研究提供参考。 相似文献
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真核翻译延伸因子(eukaryotic translation elongation factor,eEFs)是一种重要的多功能调控蛋白,eEF1β是eEF1的组成部分,在蛋白质生物合成过程中发挥着重要的作用。本文通过RT-PCR扩增克隆小麦(Triticum aestivum L.)的eEF1β基因,并命名为TaeEF1β。氨基酸同源性分析发现,TaeEF1β具有高度保守性,且其保守结构域位于137~226 aa处。qRT-PCR结果表明,中国小麦花叶病毒(Chinese wheat mosaic virus,CWMV)侵染小麦植株后,可以诱导TaeEF1β基因转录水平的上调表达。另外,本文也进一步分析了TaeEF1β基因在小麦根、茎、叶的表达水平和CWMV侵染不同时间点的表达情况。 相似文献
5.
旨在对猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)Nsp5基因进行原核表达,利用生物信息学软件,预测其编码蛋白的结构和功能,为了解PEDV致病机理奠定基础。本研究克隆PEDV/LY/2014/04毒株的Nsp5基因,亚克隆进pET-28a(+)原核表达载体,PCR和酶切验证重组质粒的构建,重组质粒pET-28a(+)-Nsp5转入E.coli BL21(DE3)中,SDS-PAGE检测Nsp5的表达和His band Ni+纯化情况,Vector NTI Advance等软件对Nsp5蛋白氨基酸组成、抗原表位、二级和三级结构进行预测和分析。结果表明,成功克隆并构建了重组质粒pET-28a(+)-Nsp5,表达重组蛋白大小约22 ku,且主要以包涵体形式存在,His band Ni+纯化后获得高纯度重组蛋白。Nsp5蛋白是由196个氨基酸残基组成的多肽,其分子质量的理论值为21 820.07 u,理论等电点(pI)为8.734,略偏碱;二级结构骨架中α-螺旋(h)占55.61%,β-折叠(t)占7.65%,无规则卷曲(c)占20.92%,延伸链(e)占15.82%;Nsp5蛋白质的三级结构中,中间段以α-螺旋为主作为骨架,C端多个复杂二级结构构成该蛋白的酶活性中心;B细胞抗原表位的预测,表明有15个潜在的B细胞优势表位。本研究为猪流行性腹泻病毒Nsp5蛋白质的生物学功能相关研究提供数据支持。 相似文献
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本研究旨在克隆猪链球菌rpoE基因,并通过生物信息学软件预测分析猪链球菌rpoE基因编码蛋白功能及其调节机制。以猪链球菌基因组为模板扩增rpoE基因,成功测序后通过生物信息学软件预测该基因编码蛋白的理化性质、抗原表位等。结果表明,成功克隆的猪链球菌rpoE基因全长582 bp,编码一种富含谷氨酸、天冬氨酸及丝氨酸的亲水性胞质蛋白;二级结构分析显示,RpoE蛋白主要结构元件为α-螺旋和无规则卷曲,分别占52.3%和36.3%。综合分析认为,RpoE蛋白上存在5个优势抗原表位。 相似文献
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本研究克隆了撒坝猪MCUR1基因,对其进行生物信息学分析,并通过实时荧光定量PCR检测其在撒坝猪、大白猪不同组织中的表达水平。根据GenBank上公布的猪的MCUR1基因序列(登录号:XM_003128183.4)设计引物,通过PCR扩增及测序获得撒坝猪MCUR1基因CDS序列,该序列全长1 095 bp,编码364个氨基酸;MCUR1蛋白的分子式C1787H2949N533O503S14,相对分子质量40.398 ku,理论等电点(pI)10.27,不稳定系数55.70,脂肪指数95.99,平均亲水性为-0.213,属于亲水蛋白;MCUR1蛋白没有信号肽和跨膜结构,含有2个螺旋卷曲结构,主要在细胞质中发挥生物学功能;含有32个磷酸化位点;含有一个CpG island;二级结构由58.24%的α-螺旋,4.12%的β-转角,30.22%的无规则卷曲,7.42%的延伸链构成;猪MCUR1基因编码区序列与牛、鸡、狗、山羊、人、猴、鼠、绵羊的同源性分别为85.3%、68.0%、83.6%、87.9%、84.4%、80.3%、76.8%、88.2%,与绵羊、山羊、牛的亲缘关系较近,与鸡的关系较远;在肝脏中的表达量最多,肺脏中的表达量最少。在大白猪的背最长肌中MCUR1的表达量高于撒坝猪的背最长肌(P<0.01)。 相似文献
8.
为评价毒死蜱和百菌清的单剂毒性和联合毒性,以斑马鱼为受试生物,采用静态法和实时荧光定量PCR方法,研究毒死蜱和百菌清单剂,以及二元组合时对斑马鱼胚胎的急性毒性和对斑马鱼幼鱼性腺轴相关基因的影响。结果显示,毒死蜱和百菌清对斑马鱼胚胎分别表现为中等和高等毒性,96 h-LC50(半致死浓度)分别为2.139 mg·L-1和0.353 mg·L-1。毒死蜱和百菌清联合作用类型为协同作用,联合暴露时,对斑马鱼胚胎的96 h-LC50分别为0.38 mg·L-1和 0.063 mg·L-1。中浓度(26.7 μg·L-1)和高浓度(106.7 μg·L-1)的毒死蜱可以诱导斑马鱼幼鱼体内芳香化酶基因(CYP19α)、卵黄蛋白原基因(VTG1、VTG2)和雌激素受体基因(ERα、ERβ1、ERβ2)不同程度的上调表达;低浓度(1.1 μg·L-1)百菌清诱导斑马鱼体内VTG1、VTG2、ERβ1和ERβ2基因的上调表达;低浓度(6.7 μg·L-1毒死蜱+1.1 μg·L-1百菌清)二元组合会引起斑马鱼体内VTG1、ERβ1、ERβ2和ERα基因下调。说明毒死蜱和百菌清对斑马鱼幼鱼具有雌激素内分泌干扰效应,但毒死蜱和百菌清二元组合对斑马鱼幼鱼的雌激素内分泌干扰效应降低。在评估农药对水生生物的危害时,应充分考虑复合污染时的联合效应。 相似文献
9.
猪伪狂犬病是由猪伪狂犬病毒(porcine pseudorabies virus,PRV)引起的一种急性、热性传染病。自2011年底以来,PRV发生了变异,传统的PRV弱毒疫苗已不能对PRV变异株提供完全保护,这给我国PR防控带来了巨大挑战。为了解安徽省PRV流行特征及其主要毒力基因遗传变异情况。利用PCR技术、细胞接种试验、电子显微镜观察、间接免疫荧光试验及兔体接种试验等方法,对安徽省临诊病例中疑似PRV感染的病猪进行病原检测及PRV分离鉴定,并通过设计6对特异性引物对PRV分离株主要毒力基因(gE、gI、TK、gB、gC、gD)进行克隆及测序分析。2016—2018年安徽省临诊病例中共分离鉴定15株PRV;PRV分离株主要毒力基因序列均与2011年后国内PRV变异株同源性较高;与2011年前国内PRV经典株序列比对,PRV分离株gE、gB、gC及gD基因存在多个位点的一致性替换、插入或缺失,且gE、gC基因多位点突变位于其重要的抗原表位区。本研究分离的15株PRV均为变异株,变异株已成为安徽省主要的流行毒株。15株PRV分离株的gI、TK基因序列较为保守,而gE、gC蛋白抗原表位区域氨基酸的突变可能导致其毒力及抗原性发生改变。部分PRV分离株与邻近地区PRV序列同源性均为100%,可能与频繁跨省调运生猪、跨区引种等原因有关。 相似文献
10.
主要组织相容复合体（major histocompatibility complex,MHC）是一类具有高度多态性的分子,在脊椎动物的先天免疫应答中起到重要作用。根据已报道鱼类的MHCⅠα基因序列设计特异性引物,通过RT-PCR和RACE技术克隆三角鲂MHCⅠα基因cDNA序列全长,命名为Mete-UAA,并对其进行生物信息学分析。结果显示,Mete-UAA全长为2 102 bp,包含1 044 bp的开放阅读框,编码347个氨基酸。编码的MHCⅠα蛋白质预测分子量为38 699.18,等电点5.23,含有16个氨基酸组成的信号肽,具有亲水性,定位于细胞膜上,具有1个N-糖基化、3个O-糖基化和39个磷酸化的潜在位点。氨基酸序列同源性比对发现,Mete-UAA氨基酸序列与团头鲂同源性最高为75.79%,与草鱼同源性稍低于团头鲂,为75.25%。Mete-UAA具有MHCⅠα的典型结构特征,包含1个前导肽、3个胞外结构域、1个跨膜区和1个胞质区。二级结构分析显示,Mete-UAA蛋白质中α-螺旋、β-转角、延伸链和无规则卷曲所占的比例分别为25.94%、9.22%、26.80%和38.04%。基于转录组学分析表明,感染嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)后三角鲂MHCⅠα基因表达呈总体下降趋势。本研究从三角鲂肝中成功克隆MHCⅠα基因,分析了其生物信息学特征,为后续研究MHCⅠα参与调控三角鲂先天免疫应答的机制提供理论基础。 相似文献
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采用RT-PCR方法克隆了鸡MTHFR(methylenetetrahydrofolate reductase, MTHFR)基因,利用生物信息学方法预测蛋白结构,应用定量PCR(qPCR)技术检测组织表达特性。结果表明,鸡MTHFR基因的cDNA序列长度为2 342 bp(GenBank登录号: KU351685),开放阅读框长1 956 bp,编码651个氨基酸;进化树分析表明,鸡MTHFR氨基酸序列与绿头鸭和鸿雁的关系较近。MTHFR氨基酸序列包含保守的MTHFR superfamily结构域,为亲水蛋白;二级结构主要是α-螺旋(38.71%)和无规则卷曲(36.41%);亚细胞定位显示,该蛋白存在于细胞质和细胞核的概率分别为60.9%和30.4%。qPCR分析表明,MTHFR基因在所检测鸡的8种组织中均有表达,其中在心脏中表达水平最高,在腿肌中的表达水平最低;叶酸缺乏试验表明,母鸡叶酸缺乏能极显著增加子代肉鸡MTHFR基因在肝脏中的表达水平(P<0.01)。研究结果可为进一步研究MTHFR基因的结构和功能以及叶酸在家禽生产中的应用提供资料。 相似文献
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采用生物信息学方法从分子水平对甘肃黑猪H-FABP基因编码蛋白质的功能和性质进行分析。采用DNA池和直接测序技术对甘肃黑猪H-FABP基因进行SNPs快速筛查及其编码区蛋白质功能预测。结果表明,甘肃黑猪H-FABP基因编码区全长402 bp,编码133个氨基酸残基,共检测出4个SNPs,分别为C734T-Intron1、T152C-Exon2、G30A-Intron2、T121G-Intron2,其中T152C-Exon2为错义突变,氨基酸由原来的异亮氨酸(Ile)转变为苏氨酸(Thr)。生物信息学预测发现,甘肃黑猪H-FABP蛋白是一种稳定的亲水蛋白,蛋白质二三级结构均以β-折叠为主的混合型蛋白。 相似文献
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草酸氧化酶(OXO)在包括核盘菌在内的多种病原体的防御和植物改良中有重大作用。以紫花苜蓿为材料,克隆得到紫花苜蓿草酸氧化酶基因MsOXO。利用烟草瞬时表达进行亚细胞定位,结果显示,MsOXO定位在细胞壁上。qRT-PCR结果显示,MsOXO在紫花苜蓿的根、茎、叶中均有表达,但在根茎中表达量较低,这可能是根颈和茎基部更易被病菌侵染的原因。外源草酸50 μmol·L-1处理根或100 μmol·L-1处理茎及外源水杨酸100 μmol·L-1处理根均可以诱导MsOXO基因的上调表达。 相似文献
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为弄清少孢节丛孢菌几丁质酶的生物学功能,对少孢节丛孢菌XJ-A1几丁质酶AO-483基因进行克隆及分子特征分析,并在大肠埃希菌中进行诱导表达;采用DNS还原糖法检测经镍柱纯化的重组几丁质酶活性,将其作用于秀丽隐杆线虫幼虫,分析其生物活性。结果显示,AO-483基因编码309个氨基酸,与少孢节丛孢菌标准株(ATCC 24927)的几丁质酶AO-483基因序列的同源性为96.88%,氨基酸序列同源性为97.73%;AO-483含有1个Glyco-hydro-18结构域,位于20~297位氨基酸,属于糖苷水解酶18家族,还含有特征序列GMLGG和LDGLDLDVE;三级结构为典型的三磷酸异构酶桶形结构。SDS-PAGE分析结果表明,重组蛋白AO-483分子质量约为52 ku,与预测大小一致;Western blot分析证实,该重组蛋白能与小鼠抗少孢节丛孢菌多克隆血清抗体发生特异性反应。经DNS还原糖法检测,该重组几丁质酶活性为223.31 U·mL-1;重组几丁质酶对秀丽隐杆线虫Ⅰ期和Ⅳ期幼虫有较强的降解活性。 相似文献