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1.
试验旨在制备原核表达鹅源新城疫病毒(NDV)JS/5/05/Go株M蛋白的多克隆抗体并进行鉴定。以鹅源NDV总RNA为模板,RT-PCR扩增M基因,亚克隆到原核表达载体pET-32a(+)获得重组质粒pET32a-M,转化E.coli BL21(DE3)菌株进行诱导表达,SDS-PAGE电泳检测表达产物;用KCl染色切胶纯化法纯化重组蛋白;采用切胶免疫小鼠的方法制备M蛋白多克隆抗体,抗体效价用间接ELISA检测,特异性用Western blot和间接免疫荧光法鉴定。结果表明,在大肠杆菌中成功表达了分子量约为55 000的重组蛋白,用切胶纯化法获得了纯度较高的重组蛋白;ELISA法检测抗体效价可达1∶102 400,Western blot和间接免疫荧光试验结果表明制备的多克隆抗体能够特异性识别纯化的M蛋白及NDV自身表达的M蛋白。 相似文献
2.
鹅星状病毒(GAstV)是当前鹅养殖业的重要病原,易引起雏鹅内脏痛风症状和死亡,造成巨大经济损失。于浙江省内采集30份病料,进行核酸检测、病原分离和测序,并克隆其ORF2序列至pET-28a原核表达载体,转化BL21菌株后经诱导获得衣壳蛋白,免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。结果显示,临床死亡雏鹅剖检均发现典型内脏痛风症状,核酸检测鉴定为鹅星状病毒阳性,且出现不同基因型鹅星状病毒混合感染情况。共分离得到ZJC14和ZJLD20两个毒株,其中,ZJLD20在鹅胚和LMH细胞中均稳定增殖,但ZJC14并不能适应LMH细胞。病毒基因组测序显示,ZJC14与ZJLD20亲缘关系较远,ZJC14属于GAstV-Ⅰ基因型,而ZJLD20为GAstV-Ⅱ基因型。重组表达载体pET28a-ORF2诱导后获得纯化目的蛋白,经免疫成功制备兔源多克隆抗体,该抗体可与目的蛋白结合。此外,间接免疫荧光和Western-blot试验结果显示,ZJLD20衣壳蛋白制备的多克隆抗体可与病毒结合反应。研究成果有利于后续对该病原致病能力的研究,同时,试验制备的ORF2衣壳蛋白与多克隆抗体为鹅源星状病毒感染的诊断试剂开发奠定了基础。 相似文献
3.
《江苏农业学报》2021,(2)
采用RT-PCR扩增获得鹅星状病毒(Goose astrovirus)的衣壳纤突蛋白基因vp27,并将其克隆至pCold-SUMO原核表达载体。重组表达载体pCold-vp27经过测序和双酶切验证正确后,转化到感受态细胞Rosetta。挑取阳性克隆子,利用异丙基硫代半乳糖苷诱导表达鹅星状病毒衣壳纤突重组蛋白,使用镍柱纯化衣壳纤突蛋白VP27,将定量的重组蛋白免疫BALB/c小鼠。利用ELISA、Western blot和IFA鉴定鼠抗衣壳纤突蛋白VP27多克隆抗体。结果显示,鼠抗衣壳纤突蛋白VP27多克隆抗体的效价大于1∶64 000,Western blot试验结果证明了鼠抗衣壳纤突蛋白VP27多克隆抗体的特异性,IFA试验结果证明鼠抗衣壳纤突蛋白VP27多克隆抗体能够识别天然的鹅星状病毒衣壳纤突蛋白VP27。 相似文献
4.
提取猪日本乙型脑炎病毒(JEV)上海分离株的基因组RNA,反转录合成cDNA,扩增JEV-NS5基因片段,亚克隆到原核表达载体pET-28(a)上,构建重组原核表达质粒pET-28(a)-JEV-NS5,转化大肠埃希氏菌BL21(DE3)菌株,IPTG诱导表达重组JEV-NS5蛋白,获得分子质量为103 ku的重组蛋白.该蛋白主要以包涵体形式表达,表达量占总菌体蛋白的35%以上,His-band Ni+纯化后,获得高纯度重组蛋白占总蛋白的比例达75%以上.以纯化的蛋白免疫小鼠,制备小鼠抗JEV-NS5抗体,抗体效价达到3×104,并能与病毒感染的样本反应,证明该蛋白具有较好的特异性. 相似文献
5.
为获得针对番鸭细小病毒VP3蛋白的多克隆抗体,根据已发表的该病毒基因序列设计一对引物,利用PCR扩增出VP3基因,将其克隆到原核表达载体p ET-32a,转化感受态细胞BL21(DE3)。经IPTG诱导后,SDS-PAGE检测重组蛋白。将重组蛋白切胶免疫BALB/c小鼠,制备抗番鸭细小病毒部分结构蛋白的多克隆抗体。结果显示成功获得VP3基因,构建的原核表达重组质粒成功表达预期的重组蛋白,免疫小鼠获得的多克隆抗体能与番鸭细小病毒及VP3蛋白反应。表明制备的多克隆抗体可用于MDPV的检测,并为进一步研究MDPV奠定了基础。 相似文献
6.
猪Sus scrofa domestica日本乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus,JEV）是引起母猪繁殖机能障碍的重要病原之一,其NS1蛋白参与病毒复制和组装、调节宿主免疫反应功能。提取猪日本乙型脑炎上海分离株的基因组RNA,反转录合成cDNA,扩增该病毒的NS1基因片段,亚克隆到原核表达载体pET-28（a）上,构建重组原核表达质粒pET-28（a）-JEV-NS1,转化大肠埃希菌Escherichia co1i BL21（DE3）菌株,IPTG诱导表达重组JEV-NS1蛋白,获得分子量大小为46 kDa的重组蛋白。为了提高表达量,JEV-NS1基因的958~1 245 bp被截短。聚丙烯酰氨凝胶电泳（SDS-PAGE）分析表明:JEV-NS1表达量明显提高,纯化后含量达到总蛋白的85%以上。纯化后的蛋白免疫ICR小鼠Mus musculus,制备了小鼠抗JEV-NS1多克隆抗体,western-blotting验证了JEV-NS1的抗原性和抗体的特异性。图6参13 相似文献
7.
[目的]对猪繁殖与呼吸综合征病毒HBKM2毒株核蛋白编码基因ORF7进行研究,为进一步了解其编码蛋白的功能和研制新的血清学诊断方法奠定基础。[方法]采用RT—PCR方法扩增HBKM2株的DR胛基因,然后利用DNAStar软件包对克隆的序列进行序列分析,将ORF7基因克隆到大肠杆菌原核表达载体pGEX—KG上,构建重组表达质粒pKG—N。将重组质粒转化到大肠杆菌B121。并经IPTG诱导表达,最后利用Western-blot对表达蛋白的免疫反应活性进行鉴定。[结果]HBKM2毒株的0R刀基因长约372bp;序列分析表明与高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的同源性达99％以上;SDS—PAGE表明克隆的0R几基因在大肠杆菌中获得了高效融合表达：Western-blot分析表明,重组蛋白GST—N能够与PRRSV高免猪血清发生特异性的免疫反应。[结论]成功地扩增了ORF7基因。且GST-N融合蛋白能在大肠杆菌中高效表达。 相似文献
8.
为获得猪圆环病毒Ⅱ型 ORF3编码蛋白,研究该蛋白的特性及功能,根据 GenBank 数据库中PCVⅡ的基因组序列设计引物,利用 PCR 从病料基因组 DNA 中扩增 PCVⅡ河南地方株 ORF3,将其克隆至表达载体 pET 32a 中进行诱导表达,SDS PAGE 电泳检测重组蛋白表达情况,采用 Ni＋NTA 亲和纯化表达产物,透析复性后免疫日本大白兔制备多抗血清,并采用 ELISA 和 Western blot方法检测多抗血清的效价和特异性。结果显示,PCR 扩增获得全长315 bp 的 ORF3,重组质粒经测序和双酶切证实构建正确;SDS PAGE 结果显示,ORF3能够在大肠杆菌中表达,产物的分子量约为30 ku,以包涵体形式存在;纯化的重组蛋白具有较好的抗原性,制备的多抗血清抗体效价达1∶12800以上,抗体特异性高,能与表达的 ORF3编码蛋白结合。成功克隆了 PCVⅡ河南地方株 ORF3并实现原核表达,获得纯化的重组 ORF3编码蛋白。 相似文献
9.
《新疆农业大学学报》2018,(4)
为制备马腺疫链球菌(Streptococcus equi subspecies equi)GAPDH蛋白的多克隆抗体,研究其免疫保护作用。以S.equi分离株为研究对象,利用PCR技术扩增其GAPDH基因并构建原核表达质粒,转化至大肠杆菌。诱导表达重组蛋白,对纯化后的蛋白进行SDS-PAGE及Western blotting分析。以纯化后的GAPDH重组蛋白免疫小鼠,用酶联免疫吸附法、攻击保护试验检测其免疫效果。结果显示,成功构建了pET-28a-GAPDH原核表达载体,纯化获得30 kDa重组蛋白。该蛋白质能特异性识别该菌抗血清,诱导小鼠产生较高水平的特异性抗体IgG,在初次免疫后第45天,抗体水平效价可达1∶24 300,攻击保护率可达87.5%。该GAPDH重组蛋白具有良好的免疫原性和免疫保护效果。 相似文献
10.
《福建农林大学学报(自然科学版)》2019,(6)
本试验旨在原核表达、纯化羊口疮病毒ORF080蛋白并鉴定其反应性.根据GenBank已发表的羊口疮病毒OV-GO株ORF080基因序列(登录号:KP010354),将密码子优化后合成该序列并克隆至pET-32a(+)原核表达载体中,构建pET-32a(+)-ORF080重组质粒.经双酶切和测序鉴定后转化至大肠杆菌Rossetta感受态细胞中,用IPTG诱导,诱导产物经SDS-PAGE鉴定,重组蛋白以可溶性和包涵体两种形式获得表达.采用镍柱对可溶性重组蛋白进行纯化,再经SDS-PAGE和蛋白质免疫印迹双重鉴定.SDS-PAGE检测结果显示,在57 ku处出现单一重组蛋白条带;蛋白质免疫印迹鉴定证实该纯化的蛋白能与抗组氨酸标签的抗体和羊口疮阳性血清发生特异性反应,证明成功表达并纯化出具有良好反应性的ORF080蛋白.试验结果为进一步对ORF080蛋白结构、功能及基因工程疫苗的研究提供参考. 相似文献
11.
通过原核表达系统表达尼罗罗非鱼热休克蛋白Hsc70,纯化该蛋白并制备其多克隆抗体。对尼罗罗非鱼热休克蛋白进行生物信息学分析,设计特异性引物,扩增出Hsc70基因,通过双酶切与pET-28a构建重组质粒表达载体,并转入大肠埃希菌B21中通过诱导剂IPTG进行原核诱导表达,表达产物用SDS-PAGE鉴定并用镍柱进行纯化。将纯化后的重组蛋白免疫日本大耳兔制备多克隆抗体,用ELISA测定抗体效价,Western blot检测抗体特异性。结果表明,原核表达系统成功表达了尼罗罗非鱼热休克蛋白Hsc70,重组蛋白分子量约为75 ku,主要以包涵体形式表达。经镍柱纯化得到高纯度的Hsc70;该蛋白免疫日本大耳兔获得特异性多克隆抗体,效价为1∶2 048 000;Western blot检测到一条75 ku的特异性条带,表明该抗体能特异性地识别尼罗罗非鱼Hsc70蛋白。尼罗罗非鱼Hsc70蛋白在大肠埃希菌中成功表达,制备的重组蛋白和多克隆抗体为深入研究尼罗罗非鱼Hsc70的功能提供了分子工具。 相似文献
12.
【目的】通过筛选灰飞虱cDNA酵母表达文库发现原肌球蛋白（tropomyosin,Tm）能与水稻黑条矮缩病毒（Rice black-streaked dwarf virus,RBSDV）P10蛋白发生互作。研究旨在克隆灰飞虱原肌球蛋白基因（Tm）,将其在原核细胞中进行表达,纯化Tm蛋白,免疫大白兔并制备其多克隆抗体,为进一步分析Tm在灰飞虱与RBSDV互作过程中的作用提供抗体条件。【方法】根据与之高度同源的Tm基因信息确定灰飞虱Tm的开放阅读框（open reading frame,ORF）。提取灰飞虱总RNA,采用RT-PCR方法从灰飞虱中克隆Tm的ORF,连接至pMD-18T载体后进行测序分析,利用DNAstar软件分析该基因序列及其编码的蛋白特性。将测序验证正确的Tm通过EcoR V和BamH I限制性内切酶酶切连接至原核表达载体pET-32a (+)。重组质粒转化大肠杆菌BL21 (DE3),经终浓度为0.4 mmol?L-1的IPTG诱导表达4 h后检测Tm融合蛋白的表达情况。离心收集诱导表达的大肠杆菌菌液,进行超声波破碎处理,收集上清及沉淀,采用SDS-PAGE分析融合蛋白的表达。利用Ni-NTA Agarose纯化上清中的可溶性融合蛋白,经100 mmol?L-1咪唑洗脱和0.01 mol?L-1 PBST溶液透析后获取纯化的Tm融合蛋白,免疫大白兔,制备多克隆抗血清,并采用间接ELISA法检测抗血清效价。纯化的Tm融合蛋白及灰飞虱总蛋白经SDS-PAGE分离后,用制备的Tm多克隆抗体进行Western blotting检测,分析抗体的特异性。【结果】序列分析显示,灰飞虱Tm的ORF大小为852 bp。采用RT-PCR克隆获得此ORF并进行测序分析,结果表明扩增所得灰飞虱Tm的ORF长为852 bp,编码283个氨基酸,理论分子量大小为32.6 kD。序列比对结果发现所编码蛋白在不同物种间保守。将Tm ORF克隆入pET-32a (+)表达载体后在大肠杆菌BL21 (DE3)中进行诱导表达,表达产物经SDS-PAGE分析显示,融合蛋白大小约为55 kD,主要以可溶性蛋白形式表达,在包涵体中也有少量表达。纯化上清中的可溶性Tm融合蛋白,免疫大白兔,制备了多克隆抗体。抗体效价测定结果显示该抗体具有较好的灵敏度,效价大于1﹕409 600。采用制备的Tm多克隆抗体检测纯化的Tm融合蛋白及灰飞虱总蛋白,分别检测到1条约55 kD和约37 kD的特异性条带,表明该抗体有较强的特异性。【结论】克隆获得了灰飞虱Tm的ORF,并在大肠杆菌BL21 (DE3)中进行了诱导表达,纯化获得了Tm融合蛋白,制备了高效价的Tm多克隆抗体。 相似文献
13.
鹅γ-干扰素成熟蛋白的表达及其生物学活性研究 总被引：6，自引：0，他引：6
【目的】检测重组鹅IFN-γ的生物学活性。【方法】将鹅IFN-γ成熟蛋白基因分别克隆到原核表达载体pET30a，杆状病毒转移载体pMelBacA和pBlueBacHis2A。对鹅IFN-γ成熟蛋白进行原核和真核表达系统表达；利用体外活性试验检测表达产物的生物学活性。【结果】原核和真核表达系统表达了重组鹅IFN-γ成熟蛋白，并制备其原核表达产物的多克隆抗体；重组鹅成熟IFN-γ可以诱导鹅巨噬细胞产生NO，并能抑制GPMV在鹅胚成纤维细胞中的增殖。【结论】重组鹅成熟IFN-γ具有鹅巨噬细胞激活活性和抗病毒活性。 相似文献
14.
《（《农业科学与技术》）编辑部》2008,(4)
[Objective] The aim of this study was to prepare the recombination protein of rubber elongation factor and its polyclonal antibodies.[Method] The encoding gene of rubber elongation factor(REF)was amplified by RT-PCR,and cloned into the prokaryotic expression vector pDEST17 to transform into Escherichia coil BI2I-AI.The recombinant protein induced by L-Arabinose was purified by the affinity chromatography.As the immunogen,the recombination protein was used to immunize mice for preparing polyclonal antibodies,while ELISA and Western blot hybridization were used to detect the titers and specificity.[Result] The purified recombination protein of REF with high expression was used to immunize house mice for preparing polyclonal antibodies with high titer and specificity.The western blot hybridization showed that the antibody could recognize the natural REF from latex.[Conclusion] The recombination protein of REF was successfully obtained and the mouse anti REF antibody with high titer and specificity was prepared,which lays a basis for further studies on biological functions of rubber elongation factor and other membrane proteins in rubber particles. 相似文献
15.
橡胶延长因子基因的原核表达及其多克隆抗体的制备(英文) 总被引：6，自引：1，他引：5
[Objective] The aim of this study was to prepare the recombination protein of rubber elongation factor and its polyclonal antibodies.[Method] The encoding gene of rubber elongation factor(REF)was amplified by RT-PCR,and cloned into the prokaryotic expression vector pDEST17 to transform into Escherichia coil BI2I-AI.The recombinant protein induced by L-Arabinose was purified by the affinity chromatography.As the immunogen,the recombination protein was used to immunize mice for preparing polyclonal antibodies,while ELISA and Western blot hybridization were used to detect the titers and specificity.[Result] The purified recombination protein of REF with high expression was used to immunize house mice for preparing polyclonal antibodies with high titer and specificity.The western blot hybridization showed that the antibody could recognize the natural REF from latex.[Conclusion] The recombination protein of REF was successfully obtained and the mouse anti REF antibody with high titer and specificity was prepared,which lays a basis for further studies on biological functions of rubber elongation factor and other membrane proteins in rubber particles. 相似文献
16.
[Objective] The aim of this study was to prepare the recombination protein of rubber elongation factor and its polyclonal antibodies.[Method] The encoding gene of rubber elongation factor(REF)was amplified by RT-PCR,and cloned into the prokaryotic expression vector pDEST17 to transform into Escherichia coil BI2I-AI.The recombinant protein induced by L-Arabinose was purified by the affinity chromatography.As the immunogen,the recombination protein was used to immunize mice for preparing polyclonal antibodies,while ELISA and Western blot hybridization were used to detect the titers and specificity.[Result] The purified recombination protein of REF with high expression was used to immunize house mice for preparing polyclonal antibodies with high titer and specificity.The western blot hybridization showed that the antibody could recognize the natural REF from latex.[Conclusion] The recombination protein of REF was successfully obtained and the mouse anti REF antibody with high titer and specificity was prepared,which lays a basis for further studies on biological functions of rubber elongation factor and other membrane proteins in rubber particles. 相似文献
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【目的】制备Ⅱ型鲤疱疹病毒（CyHV-2）ORF6多克隆抗体,为深入探究ORF6在CyHV-2急性感染或潜伏感染过程中的作用机制提供技术支持。【方法】利用MEGA 6.0、Adobe Illustrator CS6及BepiPred-2.0等在线软件分析CyHV-2的ORF6基因序列信息,采用PCR从CyHV-2基因组中扩增ORF6基因片段,将其连接至原核表达载体pET-28a后转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,经IPTG诱导和尿素洗涤纯化获得融合蛋白。以纯化的融合蛋白ORF6免疫健康Babl/c小鼠制备ORF6多克隆抗体,并通过Western blotting和间接免疫荧光技术鉴定ORF6多克隆抗体的特异性。【结果】CyHV-2的ORF6基因全长3003 bp,与CyHV-3和CyHV-1的ORF6氨基酸序列相似性均高于30.00%,其中与CyHV-3的相似性高达39.36%;其抗原表位最可能存在于第1~300位氨基酸序列中。将PCR扩增获得的ORF6基因片段连接至原核表达载体pET-28a可成功构建重组质粒pET-28a-ORF6,转化BL21（DE3）感受态细胞后经IPTG诱导4 h即获得融合蛋白ORF6;原核表达的融合蛋白ORF6主要以包涵体形式进行表达,其分子量为17.13 kD,经6 mol/L尿素洗涤纯化后的浓度为0.1 mg/mL。以纯化融合蛋白ORF6免疫Babl/c小鼠制备获得的ORF6多克隆抗体能特异性识别融合蛋白ORF6及CyHV-2感染的异育银鲫尾鳍细胞（GiCF）;利用制备的ORF6多克隆抗体对CyHV-2感染GiCF细胞进行间接免疫荧光分析,结果在CyHV-2感染GiCF细胞周围能观察到特异性绿色荧光,而在未感染CyHV-2的GiCF细胞周围未观察到特异性绿色荧光,进一步说明ORF6多克隆抗体可特异性识别CyHV-2。【结论】制备获得的ORF6多克隆抗体能与CyHV-2感染GiCF细胞发生特异性免疫反应,即可用于鉴定CyHV-2感染,为探究ORF6蛋白功能是否与CyHV-2潜伏感染相关打下了基础。 相似文献
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半胱氨酸蛋白酶 (cysteine proteinase,CysP)是一类重要的蛋白酶家族,广泛参与植物多种生理过程。为了分析植物CysP的特性,本实验首先通过RT-PCR技术从本氏烟中扩增获得了一个编码CysP的基因(NbCysP)序列并连接至pEASYTM-T5 Zero载体,测序验证后亚克隆至原核表达载体pGEX-6P1,命名为pGEX-NbCysP;将其导入大肠埃希菌BL21plysS中诱导表达;重组表达的NbCysP融合蛋白经过亲和层析纯化,免疫兔子制备多克隆抗体,Western印迹分析显示,该抗体能和重组NbCysP蛋白发生强烈的免疫学反应且条带单一,表明所获得的CysP抗体具有良好的特异性。上述结果为进一步鉴定植物CysP的功能特性奠定了基础。 相似文献
19.
[目的]构建传染性脾肾坏死病毒（ISKNV）ORF086基因的融合表达载体,制备抗体为进一步研究ORF086蛋白的免疫保护性提供前提条件。[方法]PCR扩增目的基因,构建重组质粒,经酶切鉴定,PCR和核酸序列分析后,IPTG诱导表达,Ni-柱纯化,注射新西兰白兔获得抗血清。[结果]扩增出ORF086基因,成功构建了重组质粒pET32a-ORF086,SDS-PAGE电泳和Western-blot分析显示,获得一条36.0 kD的融合蛋白。[结论]成功构建了原核表达载体,融合蛋白主要以包涵体的形式存在,经柱层析纯化蛋白,纯度达90%以上。 相似文献