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1.
研究目的是探讨电穿孔技术在意大利蜜蜂卵基因转化中应用的可能性。实验用质粒pEGFP-Nl对意大利蜜蜂卵电转导条件优化进行系统研究,然后利用所得到的电穿孔优化条件,对大量意大利蜜蜂早、晚期卵进行绿色荧光蛋白基因转移研究。实验结果获得1组较佳电学参数:脉冲电压750 V/cm,脉冲时间160μs,电击次数1;意蜂早期卵阳性表达率为0.31%~0.90%,晚期卵为0.00%~0.30%。结果表明电穿孔法可以促使意大利蜜蜂卵摄入外源基因,且意大利蜜蜂早期卵电转导效果比晚期卵好。 相似文献
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将pGFP-2质粒线性化,利用精子介导,通过人工授精技术导入意大利蜜蜂处女王,然后将授精王介绍到无王群繁殖后代。结果:试验群产生了一群绿色荧光阳性蜜蜂;对阳性蜂群后代分析发现,1~2日龄幼虫能检测到荧光,提取蜜蜂DNA进行PCR扩增得到预想的片断,通过RT-PC分析,从转录水平上证实转导的外源基因获得表达。结论:以绿色荧光蛋白(GFP)基因为报告基因,通过精子介导法能够生产克隆转基因蜜蜂。 相似文献
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蜂王浆介导外源基因转移的初步研究 总被引：1，自引：0，他引：1
采用DNA延滞实验研究蜂王浆与DNA的结合能力,然后通过蜂群哺育和人工培育两种方式,对1日龄工蜂幼虫进行短期饲喂,初步研究蜂王浆介导绿色荧光蛋白基因的方法和转移情况.结果表明:在蜂群环境下,蜂王浆中的外源DNA短期内不会完全被分解;但用蜂王浆作媒介并未实现蜜蜂基因转染,蜜蜂能否通过蜂王浆介导实现基因转移,还需进一步探讨. 相似文献
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采用RT-PCR方法,从口蹄疫病毒中扩增出长约600 bp的核苷酸片段.纯化后与载体pMD18-Tsimple连接,重组质粒经PCR鉴定及DNA测序,结果表明克隆的片段为口蹄疫病毒L基因.将质粒pMD18-L与表达载体pEGFP-N1分别用BamHⅠ+XhoLⅠ双酶切,将所获目的基因与带有酶切位点的载体连接,经酶切、PCR鉴定及DNA测序,结果表明重组表达质粒pEGFP-L构建成功.将转染的BHK-21细胞,经荧光鉴定和RT-PCR检测,证实L基因在BHK-21细胞中得到表达. 相似文献
6.
采用水动力转染技术将含有家鸡PPARγ基因的真核表达质粒、表达该基因siRNA的干扰质粒注射到小鼠体内,并利用RT-PCR方法检测PPARγ基因在小鼠脏器中的表达情况,以建立检测重组质粒瞬时表达和筛选siRNA序列的有效方法。结果表明:注射重组质粒pcDNA3/PPARγ后家鸡PPARγ基因在小鼠的肝脏中高效表达;同时注射重组质粒pcDNA3/PPARγ和表达该基因siRNA序列的干扰质粒pGenesil-1/PPARγshRNA1后,家鸡PPARγ基因在小鼠肝脏中的表达明显地受到抑制。与传统的真核细胞转染技术相比,水动力转染技术具有快速、简单、方便、高效、安全、成本低等优点,可作为外源重组DNA表达的检测和siRNA的筛选等一种有效的方法。 相似文献
7.
探讨获得外源基因高效转染山羊胎儿成纤维细胞(gFFCs)的方法,为筛选出体细胞核移植的供核细胞,制备转基因山羊提供技术基础。该研究以绿色荧光蛋白基因(GFP)为报告基因,采用脂质体LipofectaminTM LTX+PLUSTMReagent介导,对细胞接种量、质粒DNA用量、脂质体与质粒DNA比例、脂质体-DNA复合物与细胞作用时间进行优化,荧光显微镜下统计转染后24h的转染效率。结果显示：在24孔培养板中,每孔接种细胞6×104个,24h后进行转染,质粒DNA每孔0.6μg,脂质体与质粒DNA比例为4.5：1.0,脂质体-DNA复合物与细胞作用时间为6 h时,转染效率最高,达到81.2％。 相似文献
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目的:建立山羊精子介导转染外源DNA的方法,并探索精液离心与否与添加异种精清对转染效率的影响.方法:将采集的山羊精液经过离心处理与标记的线形化pEGFP-N1质粒共育转染,分别用免疫组化的方法检测转染效率、PCR和Southern blotting检测转染外源DNA在精子的结合部位和结合率;同时将实验分为3组,分别为鲜精直接转染、离心后转染和离心山羊精液添加猪精清转染,用免疫组化方法检测转染外源DNA效率.结果:精子核后帽区是结合转染外源DNA的主要部位;3种处理的阳性转染率分别为(26.19±3.25)%、(62.04±7.87)%和(17.04±9.34)%;DNaseⅠ消化后的阳性转染率分别为(11.50±5.05)%、(34.00±5.87)%和(10.00±4.24)%.离心组与未离心组和添加猪精清组差异极显著(p＜0.01).结论:山羊精子具有自发性结合外源DNA的能力;羊精清和异种精清明显降低精子结合外源基因的效率. 相似文献
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根据家兔基因密码子使用偏好性,对引自GenBank的秀丽隐杆线虫fat-1基因编码序列进行密码子优化,通过全基因合成的方法获得优化后的fat-1基因(命名为opfat-1);从秀丽隐杆线虫中RT-PCR扩增获得fat-1.将扩增的fat-1和合成的opfat-1基因分别构建到绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP-C1中.采用脂质体LipofectamineTM转染法将fat-1和opfat-1基因转入家兔胎儿成纤维细胞(Rabbit fetal fibroblast cells,rFFCs)中.对比不同DNA和转染试剂用量以及细胞暴露于DNA、转染试剂中作用时间探讨影响rFFCs转染效率的参数,经过优化,最优的rFFCs转染条件为:LipofectamineTM用量2～3μl,DNA量0.8～1.0μg,LipofectamineTM与DNA、细胞共培养时间为8 h.通过绿色荧光标记和RT-PCR检测转染细胞中融合蛋白和目的基因的表达.密码子优化的opfat-1与fat-1相比,体外瞬时表达效率有极为显著的提高;G418抗性筛选获得转基因单克隆细胞,RT-PCR初步验证fat-1和opfat-1基因均在家兔胎儿成纤维细胞中稳定转录表达. 相似文献
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为从中华蜜蜂蜂毒中扩增蛋白酶(Protease)基因,根据意大利蜜蜂蜂毒蛋白酶基因(GenBank登录号NM_001011584)的保守区设计引物,从中华蜜蜂(Apis cerana cerana)工蜂毒腺中快速抽提总RNA,将从毒腺中扩增出的产物克隆到pGEM-T easy 载体上,导入大肠杆菌JM109,阳性克隆经双酶切鉴定后测序,将测序得到的中华蜜蜂蛋白酶基因与已知的意大利蜜蜂核苷酸序列比较,同源性为95.22%.氨基酸序列分别与意大利蜜蜂、玉米螟、胡蜂、冈比亚按蚊、棉铃象甲虫、埃及斑蚊、热带爪蟾、棕尾别麻蝇、广盐螯虾、亚马逊蝮蛇进行同源性比较,同源性分别为91.71%、46.70%、41.94%、41.21%、39.56%、38.38%、37.35%、36.17%、34.24%、28.49%.本试验首次成功从中华蜜蜂工蜂毒腺中扩增到长度为545 bp、编码蛋白酶的基因片段, 所得序列已提交GenBank,登录号为:EF547156,这为以后克隆该基因全长序列以及利用基因工程技术进行蜂毒产业化开发奠定一定的基础. 相似文献
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【背景】 作为我国本土重要的资源昆虫,中华蜜蜂（Apis cerana cerana,简称中蜂）对我国初冬季低温开花植物的传粉具有重要的生态价值,其传粉习性与嗅觉系统密切相关。前期对中蜂采集蜂高、低温处理后的触角转录组数据分析发现,与昆虫嗅觉相关的尼曼匹克C2型蛋白（Niemann-Pick type C2 protein,NPC2）基因家族在低温时表达量上升。【目的】 以中蜂NPC2家族基因为研究对象,克隆并分析其结构特征和表达谱以及高、低温处理下表达量的差异,为深入研究中蜂NPC2基因家族在中蜂低温适应的嗅觉感受功能提供参考。【方法】 基于中蜂高、低温转录组测序结果,利用RT-PCR克隆获得中蜂NPC2基因ORF序列,进行系统进化树分析和三维结构预测,然后通过实时荧光定量PCR分析中蜂NPC2基因在不同发育时期、组织的时空表达谱,以及高、低温时的表达量变化。【结果】 获得4个中蜂NPC2基因——AcNPC2a、AcNPC2b、AcNPC2c、AcNPC2d的ORF全长,分别为447、480、459和465 bp,编码148、159、152和154个氨基酸,预测蛋白分子量为16.12—18.53 kD,等电点分别为7.98、7.57、6.56和6.34。进化树分析显示AcNPC2与意大利蜜蜂的NPC2同源序列亲缘关系最近,与其他膜翅目昆虫NPC2也有一定相似性。实时荧光定量PCR结果显示,AcNPC2a在新出房蜂的腹部表达量最高,其次是在哺育蜂的腹部以及幼虫期;AcNPC2b在新出房蜂的胸部表达最高,在采集蜂的头部、胸部和后足也有表达;AcNPC2c在哺育蜂和采集蜂的触角中呈高丰度表达;AcNPC2d在采集蜂的头部表达量最高。经低温处理后,4个AcNPC2基因在采集蜂触角中的表达量均有所上升,但差异不显著。【结论】 AcNPC2具有NPC2蛋白的保守结构,其基因家族成员在中蜂的时空表达谱中呈现多样性,其中AcNPC2c在触角中呈高丰度表达,表明其与中蜂嗅觉感受功能关系密切。AcNPC2基因家族在低温时采集蜂触角中表达量均有所上升,表明该基因家族有可能参与中蜂的低温适应性,或与初冬季访花行为有关。 相似文献
13.
对来自福建、浙江和北京地区的中华蜜蜂囊状幼虫病毒(Chinese Sac Brood Virus,CSBV)进行了PCR鉴定,并对来自北京地区的病毒株CSBV-BJ/2010结构基因片段进行了克隆及系统进化分析.结果表明:RT-PCR方法获得了426 bp的cDNA片段;所获得序列与GenBank中CSBVLN/200... 相似文献
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亚洲部分地区东方蜜蜂mtDNA多态性研究 总被引：1，自引：0，他引：1
就云南省7个不同样点共7群东方蜜蜂蜂群开展mtDNA内切酶位点测试和分析研究,并与菲律宾的东方蜜蜂作对比分析。内切酶DraI分析7个蜂群,共发现4个内切酶位点;云南东方蜜蜂mtDNA的tRNAleu-COII基因的序列没有长度多态性,EcoRI内切酶位点共有4个,与菲律宾的吕宋岛的东方蜜蜂属于同一单倍型。另外,对来自尼泊尔、泰国、越南、老挝以及我国北京、云南等地的共13群蜜蜂mtDNA COII基因的420个碱基对进行测序分析,发现13群东方蜜蜂分析的420个碱基序列里,位点变异从0个到5个不等,变异率从0到1.19％. 用邻接法(neighbor-joining)构建的分子系统树可以看出分枝树主要分为两个类群:高纬度或高海拔的蜂群为一个类群,它们主要来自撒营盘（2）（China 4）、丽江(China 7)、北京(1)（China 1）、尼泊尔（Nepal）、北京（2）（China 2）、河口（1）（China 8）和越南（2）（Vietnam 2）。另一个类群的主要来自低纬度或低海拔的蜂群,它们主要来自撒营盘（1）（China 3）、景洪（China 5）、越南（1）（Vietnam 1）、泰国（Thailand）、河口(2) (China 6)和老挝(Laos)。该实验为我国东方蜜蜂资源的保护和开发研究提供了重要的信息和手段。 相似文献
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室内人工培育中华蜜蜂幼虫技术研究 总被引：6，自引：0，他引：6
以中华蜜蜂（Apis cerana cerana,简称中蜂）幼虫为试验材料,研究了不同饲粮配方、饲养模式和培养板对中蜂幼虫发育的影响。得出以下结果：幼虫饲粮LD1和LD3对幼虫的饲喂效果显著优于LD2;比较不同移虫模式下幼虫发育成功率：日转移法为61.1%,不转移法为70.8%;其中,在不转移饲喂模式下,使用新培养板培养的发育成功率（69.8%）显著高于重复利用的培养板培养的发育成功率（39.6%）（P〈0.01）。表明室内以LD1或LD3饲喂,采用＂不转移法＂模式,并使用新培养板,更利于中蜂幼虫的发育。 相似文献
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【目的】掌握中华蜜蜂蜂毒明肽基因的生物信息,为进一步深入研究其生理功能及通过生物工程技术生产蜂毒明肽产品奠定基础。【方法】采用PCR技术克隆中华蜜蜂蜂毒明肽基因,并对所获得的基因组序列进行详细的生物信息学分析。【结果】从蜜蜂头部和胸部组织中成功扩增获得511bp的蜂毒明肽基因序列,该序列GC碱基含量仅为24%,包含一个141bp的开放阅读框,编码46个氨基酸残基;该序列与肥大细胞脱颗粒肽的同源性高达58%,存在较明显的信号肽序列和跨膜区结构。【结论】蜂毒明肽是一种小分子抗菌肽,存在较明显的信号肽序列和跨膜区结构,具有生物抗菌肽的典型特性,但需进一步加工切除信号肽序列后才能发挥作用。 相似文献
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根据中华蜜蜂Acc MRJP1表达序列标签(EST)序列,从已完成EST测序的蜂脑cDNA文库中选出3个Acc MRJP1克隆,通过PCR检测和测序筛选获得1个cDNA全长为1 302 bp、可编码433个氨基酸残基的Acc MRJP1开放阅读框(ORF),该氨基酸序列与已报道的Acc MRJP1编码序列(AY279539)的同源性为99.8%.将该Acc MRJP1基因克隆到表达载体pGEX-4T-2,转化大肠杆菌BL21中进行融合表达.SDS-PAGE电泳分析显示一条分子量大小约76 ku、占细胞总蛋白17.7%的特异性条带;以谷胱甘肽转移酶(GST)多克隆抗体为一抗作Western blot分析,检测到Acc MRJP1与GST的融合表达蛋白印迹,并通过亲和柱分离获得了纯化的表达产物,证明Acc MRJP1基因已表达成功,这为开展MRJP1的生物工程利用提供了技术基础. 相似文献
18.
苏荣 《福建农林大学学报(自然科学版)》1992,(3)
通过对500只中华蜜蜂(Apis cerana cerana)雄蜂飞行的观察,发现21-30日龄的雄蜂在下午3点左右进行飞行且飞行时间最长.在不考虑雄蜂的日龄和其它因素时,飞行的持续时间平均为35.67±20.12min.雄蜂首次飞行的日龄与其飞行的持续时间有一定的相关(r=0.612).雄蜂两次飞行间在蜂箱内停留的时间与其日龄有关,随每日飞行次数的增加呈下降的趋势.每日第1-2次飞行在箱内停留的时间显著地长于其它次飞行所停留的时间.雄蜂飞行间在蜂箱内停留的平均时间为21.22+16.53mim. 相似文献
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为了保护中华蜜蜂(Apis cerana cerana)的遗传多样性,合理开发利用中华蜜蜂资源,用新法饲养和旧法饲养对安徽皖南山区的中华蜜蜂群体温度变化及调控进行了研究。结果表明,新法和旧法饲养的中华蜜蜂蜂团中心温度分别为:春季(32.57±0.29)℃和(32.78±0.60)℃,夏季(34.03±0.33)℃和(34.26±0.31)℃,秋季(32.19±0.26)℃和(32.39±0.26)℃,冬季(26.14±0.39)℃和(27.47±0.31)℃;边缘温度分别为:春季(22.24±1.77)℃和(22.49±1.78)℃,夏季(33.71±0.64)℃和(34.08±0.66)℃,秋季(19.27±0.54)℃和(19.68±0.52)℃,冬季(14.20±0.09)℃和(14.81±0.07)℃。新法和旧法饲养的蜂团中心温度与环境温度之间差异均极显著(P<0.01);夏季和冬季新法和旧法饲养的蜂团边缘温度与环境温度之间差异显著(P<0.05),春、秋季差异不显著;冬季旧法蜂团中心与边缘温度均高于新法。在环境温度剧变条件下,通过群体的调节,冷库中繁殖群蜂团中心温度保持30.5~32.6℃;温室中断子群蜂团中心温度保持27.8~31.8℃。 相似文献
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中华蜜蜂群内工蜂监督研究 总被引：7，自引：6，他引：1
以中华蜜蜂(Apis cerana cerana)为实验材料,对处女蜂王分别进行单雄和双雄人工授精,并以自然交尾作为多雄交配对照。然后用标准的方法检测各蜂群对蜂王产的未受精卵(QUG)和工蜂产的未受精卵(WUG)的监督效果,结果表明:在自然交尾、双雄授精或单雄授精3种蜂群中,都明显存在工蜂监督现象。 相似文献