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奶牛气管抗菌肽是一种具有较强抗菌活性的抗菌小肽。实验从奶牛气管组织中提取总RNA,反转录成c DNA,以此为模板,用奶牛气管抗菌肽特异性PCR引物扩增奶牛气管抗菌肽基因,然后将其连入载体p CMV-C-e GFP中构建奶牛气管抗菌肽的真核表达载体b TAP-GFP,并将此载体转染进奶牛乳腺上皮细胞中,分别运用荧光蛋白观察和细菌记数等方法检测b TAP-GFP蛋白在细胞中的表达及其对大肠杆菌的抗菌活性。试验结果表明,试验成功的建立了奶牛气管抗菌肽的真核表达载体b TAP-GFP,并且此重组载体能在奶牛乳腺上皮细胞中正常表达具有抗大肠杆菌活性的b TAP-GFP蛋白。 相似文献
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为研究L型氨基酸转运载体1（L type amino acid transporter 1,LAT1）对奶牛乳腺中β-酪蛋白表达的作用,本试验采用PCR技术体外扩增奶牛LAT1基因并构建LAT1真核表达载体,采用脂质体转染技术将LAT1真核表达载体转染奶牛乳腺上皮细胞,并于转染48 h后采用Western blotting技术检测LAT1过表达后乳腺上皮细胞中LAT1、4F2hc和β-酪蛋白的表达变化。荧光显微镜检测结果显示,LAT1真核表达载体成功转染奶牛乳腺上皮细胞;Western blotting检测结果显示,LAT1过表达的奶牛乳腺上皮细胞中LAT1极显著增加（P<0.01）,β-酪蛋白的表达显著升高（P<0.05）,4F2hc表达变化不显著（P>0.05）。这些结果提示LAT1对奶牛乳腺上皮细胞乳蛋白合成具有促进作用。 相似文献
4.
研究旨在构建具有高效抗菌、活性持久的奶牛乳腺特异性表达质粒,探索研制新型抗菌制剂,为利用基因工程技术防治奶牛乳房炎提供重要材料。根据GenBank中奶牛溶菌酶基因(lysozyme,Lyz)mRNA序列(GenBank号:NM_180999.1)设计引物,从奶牛乳腺上皮细胞中RT-PCR扩增Lyz基因编码序列,将其克隆到携带增强型绿色荧光蛋白通用型表达载体pEGFP-N1中测序。重组质粒pEGFP-N1-Lyz经Ase I+Hind III双酶切除CMV启动子,将奶牛乳腺特异性表达β-乳球蛋白基因(BLG)启动子同源重组替换到Ase I和Hind III酶切位点,构建奶牛溶菌酶基因(Lyz)乳腺特异性表达质粒pBLG-EGFP-N1-Lyz,采用脂质体法转染奶牛乳腺上皮细胞(BMEC)、人肾脏上皮细胞(HEK293T),荧光显微镜检测转染细胞中绿色荧光蛋白的表达情况。结果表明,重组表达质粒pBLG-EGFP-N1-Lyz测序结果与目的片段长度相符,转染至BMEC细胞和HEK293T细胞,在奶牛乳腺上皮细胞观察到绿色荧光, HEK293T细胞未观察到绿色荧光,奶牛Lyz基因乳腺特异性表达质粒构建成功。 相似文献
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本研究旨在检验构建的stat5表达载体对奶牛乳腺上皮细胞泌乳能力的影响。构建真核表达载体pcD-NA3.1+-stat5-αS1,稳定转染到奶牛乳腺上皮细胞中。利用细胞活力分析仪、HPLC、Real-time PCR和WesternBlotting技术检测乳腺上皮细胞转染前后stat5基因和蛋白的表达量、细胞活力及乳糖和酪蛋白分泌情况。结果表明,与空白细胞和空白载体组相比,非磷酸化STAT5蛋白和stat5基因的表达量增加(P<0.01),乳糖含量提高(P<0.05),细胞活力和增殖能力增强(P<0.01),酪蛋白和磷酸化STAT5(pSTAT5)表达增多(P<0.05)。结果提示,构建的载体pcDNA3.1+-stat5-αS1在乳腺上皮细胞中高效表达,显著提高乳腺上皮细胞的泌乳能力。 相似文献
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研究产PV-杀白细胞素(PVL)金黄色葡萄球菌ATCC49775、pvl缺陷株△pvl 49775和相应的回补株C-△pvl 49775以及体外重组的PVL(rPVL)对奶牛乳腺上皮细胞的损伤作用,为系统研究金黄色葡萄球菌感染奶牛乳腺上皮细胞的机制提供依据。采用原核表达的方法构建金黄色葡萄球菌LukS-PV和LukF-PV重组质粒并分别转化大肠杆菌BL21,诱导表达纯化后对其进行Western blot鉴定;用Live/Dead细胞荧光染色和Annexin V-FITC/PI双染法检测ATCC49775、△pvl 49775、C-△pvl 49775和rPVL对奶牛乳腺上皮细胞凋亡的影响。成功构建pET28a-LukS-PV、pET28a-LukF-PV重组表达载体,经诱导表达纯化后获得的LukS-PV浓度为0.6 mg·mL~(-1),LukF-PV浓度为1.15 mg·mL~(-1)。rPVL主要诱导奶牛乳腺上皮细胞凋亡(P0.01),金黄色葡萄球菌ATCC49775、△pvl 49775和C-△pvl 49775均能诱导奶牛乳腺上皮细胞明显凋亡和坏死,但pvl阳性菌株ATCC49775和C-△pvl 49775诱导的奶牛乳腺上皮细胞凋亡率和坏死率明显高于△pvl 49775(P0.05)。结果表明原核表达的rPVL对奶牛乳腺上皮细胞表现出较强的毒性;pvl缺陷株△pvl 49775诱导奶牛乳腺上皮细胞凋亡和坏死的能力比pvl阳性菌株ATCC49775和C-△pvl 49775低,说明PVL在金黄色葡萄球菌感染奶牛乳腺上皮细胞过程中有重要作用。 相似文献
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克隆奶牛S100A12基因并在大肠杆菌中高效表达.采用RT-PCR扩增奶牛外周血白细胞中S100A12基因,构建原核表达载体pCold TF-S100A12,在大肠杆菌BL21(DE3)中IPTG诱导表达并纯化.SDS-PAGE和Westernblotting分析显示S100A12基因以融合蛋白形式表达,表达量占菌体总蛋白的46.7％,纯化的重组蛋白(80 mg/L).琼脂扩散法测定重组蛋白对乳腺炎主要致病菌大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌活性.结果显示:重组蛋白对大肠杆菌有抗菌活性,而对金黄色葡萄球菌无抗菌活性.本研究为S100A12蛋白抗体制备及基因功能研究奠定了基础. 相似文献
8.
《中国畜牧兽医》2016,(10)
为研究L型氨基酸转运载体1(L type amino acid transporter 1,LAT1)对奶牛乳腺中β-酪蛋白表达的作用,本试验采用PCR技术体外扩增奶牛LAT1基因并构建LAT1真核表达载体,采用脂质体转染技术将LAT1真核表达载体转染奶牛乳腺上皮细胞,并于转染48h后采用Western blotting技术检测LAT1过表达后乳腺上皮细胞中LAT1、4F2hc和β-酪蛋白的表达变化。荧光显微镜检测结果显示,LAT1真核表达载体成功转染奶牛乳腺上皮细胞;Western blotting检测结果显示,LAT1过表达的奶牛乳腺上皮细胞中LAT1极显著增加(P0.01),β-酪蛋白的表达显著升高(P0.05),4F2hc表达变化不显著(P0.05)。这些结果提示LAT1对奶牛乳腺上皮细胞乳蛋白合成具有促进作用。 相似文献
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链球菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌是引起奶牛乳腺炎的3大病原菌，在链球菌属中无乳链球菌是引起奶牛乳腺炎的重要病原菌之一，由无乳链球菌导致的乳腺炎约占隐性乳腺炎发病率的56.25%。无乳链球菌入侵奶牛乳腺的过程主要包括感染、黏附上皮细胞、侵入上皮细胞、损伤机体和免疫逃避等过程。无乳链球菌的毒力因子具有附着和侵袭机体细胞的作用，使菌体在奶牛乳腺表面形成生物被膜，进而干扰机体的正常免疫功能并引起疾病。本文主要阐述了无乳链球菌在入侵乳腺组织过程中发挥主要作用的毒力因子的种类、作用机制以及调控过程，旨在通过抑制其相关毒力因子的活性，从而阻断无乳链球菌在乳腺中感染和传播，进而为预防和治疗链球菌型乳腺炎提供新的思路。 相似文献
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为探讨脾源性酪氨酸激酶(spleen tyrosine kinase,SYK)的表达与奶牛乳腺发育和泌乳功能之间的关系,试验采用Western blotting和激光共聚焦显微技术对泌乳期高乳品质、低乳品质及干乳期的中国荷斯坦奶牛乳腺组织中SYK的表达含量和表达部位的变化进行研究。结果表明,干乳期奶牛乳腺组织中SYK的表达显著高于泌乳期奶牛乳腺组织(P<0.05),泌乳期高乳品质、低乳品质奶牛乳腺组织中SYK的表达差异不显著(P>0.05);在干乳期SYK主要在乳腺导管上皮细胞的胞质中表达,而在泌乳期SYK在腺泡上皮细胞中表达。结果提示SYK是乳腺上皮细胞增殖与分化的调节因子,主要参与干乳期乳腺组织的重建过程。 相似文献
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中药王不留行增乳活性单体及催乳素对奶牛乳腺上皮细胞特异性miRNA的影响 总被引：3，自引：1，他引：2
本试验旨在研究中药王不留行增乳活性单体邻苯二甲酸二丁酯及催乳素对奶牛泌乳中期乳腺上皮细胞miRNAs表达的影响;荧光定量RT-PCR检测增乳活性单体邻苯二甲酸二丁酯及催乳素作用后乳腺上皮细胞miRNAs表达变化;王不留行增乳活性单体邻苯二甲酸二丁酯及催乳素均抑制原代培养的泌乳中期奶牛乳腺上皮细胞miRNA-143、miRNA-125和miRNA-195表达;邻苯二甲酸二丁酯可抑制miRNA-21表达,催乳素对miRNA-21表达的影响尚不确定。首次阐明中药王不留行增乳活性单体邻苯二甲酸二丁酯和催乳素能引起乳腺上皮细胞miRNAs表达变化。 相似文献
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《中国兽医学报》2016,(8):1307-1311
为研究金黄葡萄球菌(S.aureus)对奶牛乳腺上皮细胞(BMEC)E-cadherin表达的影响,分别采用金黄葡萄球菌及热灭活的金黄葡萄球菌菌液作用于BMEC。金黄葡萄球菌以MOI 100∶1分别感染细胞0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0,3.5,4.0h,热灭活的金黄葡萄球菌菌液以不同浓度(0,104,105,106,107,108 CFU/mL)刺激细胞,之后利用实时荧光定量PCR方法和Western blot方法检测E-cadherin mRNA及其蛋白的相对表达量。结果显示:金黄葡萄球菌在感染细胞2h之后,E-cadherin mRNA及其蛋白的表达量较未感染组显著降低(P0.05);不同浓度的热灭活的金黄葡萄球菌菌液处理细胞的E-cadherin mRNA及其蛋白的表达量较对照组显著降低(P0.05)。本研究表明,金黄葡萄球菌及热灭活的金黄葡萄球菌菌液均能够降低奶牛乳腺上皮细胞E-cadherin mRNA及其蛋白的表达。 相似文献
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采用金黄色葡萄球菌侵袭原代奶牛乳腺上皮细胞,观察该病原菌对乳腺上皮细胞Wnt/β-catenin信号通路关键蛋白和相关修复因子EGFR、TGF-β3和VEGF基因mRNA表达的影响。金黄色葡萄球菌以MOI=1∶1的比例接种奶牛乳腺上皮细胞,分别作用0,15,30,45,60,120,240 min,采用Western blot法检测乳腺上皮细胞β-catenin、Cyclin D1及c-Myc蛋白表达水平;免疫荧光法检测β-catenin的表达及核易位;荧光定量PCR检测EGFR、TGF-β3和VEGF基因mRNA表达。结果显示,β-catenin蛋白在45,60,120 min表达量升高,与0 min相比差异显著(P<0.05);Cyclin D1蛋白在45,60,120和240 min表达量升高,差异显著或极显著(P<0.05或P<0.01);c-Myc蛋白在15,30,60,120,240 min表达量升高,差异极显著(P<0.01)。修复相关因子EGFR、TGF-β3和VEGF基因mRNA的表达量在30 min均出现极显著升高(P<0.01),且VEGF基因mRNA在45,60,120和240 min均呈现极显著升高(P<0.01),EGFR基因mRNA表达量在30,45和60 min时表达量极显著升高(P<0.01)。结果表明,金黄色葡萄球菌侵袭奶牛乳腺上皮细胞后,诱导Wnt/β-catenin信号通路的转导和修复因子EGFR、TGF-β3和VEGF基因转录,该信号通路和修复因子可能参与金黄色葡萄球菌导致的炎症和细胞损伤的修复过程。 相似文献
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奶牛乳房炎是奶牛养殖业最常见的疾病之一,严重影响奶牛泌乳量和奶品质,增加奶牛淘汰率。饲养条件、环境因素及病原菌等都可诱发奶牛乳房炎,其中金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)导致的奶牛乳房炎最难治愈。金黄色葡萄球菌是一种具有高致病性、高耐药性且能通过自身分泌的酶、毒力因子介导免疫逃避作用的致病菌,其在宿主体内长期存活可导致长期慢性奶牛乳房炎的发生。笔者首先从奶牛乳腺免疫防御方面揭示奶牛乳腺在金黄色葡萄球菌入侵时所产生的一系列免疫防御手段;其次从金黄色葡萄球菌依靠自身表达的毒力因子、生物膜、表面蛋白及进化过程中产生小菌落变种、持留菌等不断增强其致病性和高耐药性方面进行阐述,揭示金黄色葡萄球菌高致病性和高耐药性的原因,以及金黄色葡萄球菌导致的奶牛乳房炎难以治愈的原因;最后进一步阐明金黄色葡萄球菌是如何在宿主强大的免疫防御作用下存活,以及通过荚膜多糖和纤维连接蛋白在乳腺定植并逃避吞噬,分泌中性粒细胞丝氨酸蛋白酶抑制蛋白、葡萄球菌蛋白A、产生细胞外囊泡等毒力因子逃避机体的免疫吞噬作用,揭示金黄色葡萄球菌具有高度环境适应力及众多免疫逃避手段。笔者从以上三方面对金黄色葡萄球菌... 相似文献
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金黄色葡萄球菌是引起奶牛乳腺炎的主要传染性病原菌.本实验采用分子克隆及蛋白表达技术,成功的表达了金黄色葡萄球菌纤维素结合蛋白A(FnBPA)D片段并对其免疫学活性进行了初步研究.表达产物免疫实验动物后,获得较高效价的抗体.用制备血清进行吞噬调理试验,抗金黄色葡萄球菌黏附等一系列试验,证明 抗体对金黄色葡萄球菌具有吞噬调理作用,也有抗金黄色葡萄球菌黏附的作用,这将为制备奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌黏附素疫苗奠定基础. 相似文献
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奶牛乳腺炎是奶牛场的多发病和常发病,在世界各地的养殖场均有很高的发病率。环状RNA(circular RNA,circRNA)作为近年来被广泛研究的非编码RNA在奶牛乳腺炎发生过程中也发挥了一定的作用。采集患有乳腺炎的奶牛乳腺组织和健康乳腺组织检测circ0000316的表达量,同时采用大肠埃希氏菌(Escherichia coli)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)刺激奶牛乳腺上皮细胞,建立奶牛乳腺上皮细胞炎症模型,检测炎症模型中circ0000316的表达量。结果显示,成功建立了奶牛乳腺上皮细胞炎症模型,且circ0000316在奶牛乳腺炎组织和奶牛乳腺上皮细胞炎症模型中均呈现低表达,为研究circRNA在乳腺炎发生过程中的作用奠定了基础。 相似文献
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《中国兽医学报》2016,(12):2135-2139
为了使用phiC31整合酶建立奶牛胰岛素诱导基因1(INSIG1)的稳定表达乳腺细胞系,首先从奶牛乳腺组织中克隆得到INSIG1基因的编码区,然后将克隆片段与phiC31载体进行BamHⅠ和KpnⅠ双酶切构建INSIG1-C31真核表达质粒;将其与phiC31整合酶质粒共同转染到小鼠乳腺细胞中,采用嘌呤霉素筛选细胞,荧光显微镜观察细胞绿色荧光蛋白的表达,PCR鉴定细胞基因组中INSIG1基因的表达,荧光定量PCR检测细胞中INSIG1基因的表达。结果表明,试验成功构建INSIG1-C31真核载体,与phiC31整合酶共转染小鼠乳腺细胞,经过8mg/L嘌呤霉素筛选后获得完全表达绿色荧光蛋白的乳腺细胞系;对细胞系鉴定表明INSIG1基因已经整合到细胞基因组中,与对照组相比,INSIG1基因的mRNA表达丰度增加了597.98倍(P0.001)。本研究获得了稳定表达奶牛INSIG1基因的乳腺细胞系,为深入研究INSIG1基因功能打下基础。 相似文献
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《中国兽医学报》2017,(5):828-832
为研究金黄色葡萄球菌(S.aureus)对奶牛乳腺成纤维细胞(BMFB)α-SMA及collagen-Ⅰ表达的影响,本研究分别用不同浓度的热灭活金黄色葡萄球菌(0,10~4,10~5,10~6,10~7和10~8 CFU/mL)刺激BMFB,24h后采用Real timePCR方法、Western blot方法及免疫荧光法检测α-SMA及collagen-ⅠmRNA和蛋白的表达量。结果显示,不同浓度灭活的金黄色葡萄球菌处理细胞的α-SMA及collagen-Ⅰ均能显著升高(P<0.05),其中以10~5 CFU/mL刺激组的α-SMA及collagen-Ⅰ的mRNA和蛋白的表达量最高。结果表明,金黄色葡萄球菌可以使奶牛乳腺成纤维细胞转分化为肌成纤维细胞,为揭示金黄色葡萄球菌性乳腺炎发生硬化的机理提供数据。 相似文献
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王不留行增乳活性单体对奶牛乳腺上皮细胞增殖及泌乳性能的影响 总被引：1，自引：0，他引：1
应用CASY细胞分析仪及HPLC分别检测王不留行邻苯二甲酸二丁酯对乳腺上皮细胞增殖、细胞活力及乳腺上皮细胞分泌β-酪蛋白、乳糖的影响,研究王不留行增乳活性单体邻苯二甲酸二丁酯对奶牛泌乳中期乳腺上皮细胞增殖和泌乳性能的影响。试验结果表明,王不留行增乳活性单体成份邻苯二甲酸二丁酯对奶牛乳腺上皮细胞的增殖和细胞活力提高均显著(P0.05);能显著提高乳腺上皮细胞β-酪蛋白的表达(P0.05),也能提高乳糖的分泌(P0.05,P0.05)。因此,王不留行增乳活性单体邻苯二甲酸二丁酯可显著提高乳腺上皮细胞的增殖和泌乳能力。 相似文献