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1.
针对小鼠ERO1α基因构建短发卡RNA(Short hairpin RNA,shRNA)慢病毒载体。根据NCBI中小鼠ERO1α基因序列,设计3条针对ERO1α的shRNA序列和1条阴性对照shRNA序列。将shRNA序列连接到慢病毒载体pCD513B-U6上,同时进行PCR鉴定及测序,分别命名为pCD513B-ERO1α-shRNA和pCD513B-NC-shRNA。将构建好的重组质粒和包装辅助质粒共转染HEK 293T细胞,包装产生慢病毒。将所得病毒悬液进行浓缩,同时梯度稀释转导HEK 293T细胞,检测病毒滴度。浓缩后的慢病毒转导RAW 264.7细胞,通过RT-qPCR和Western blot技术进行有效片段的筛选。之后,将筛选的慢病毒转到多种细胞系或者原代细胞,用RT-qPCR和Western blot技术检测ERO1α基因的表达情况。PCR及测序结果表明,重组慢病毒干扰载体pCD513B-ERO1α-shRNA构建成功,所包装的慢病毒其病毒滴度为5×10~7 TU/mL～10×10~7 TU/mL。RT-qPCR和Western blot结果表明,pCD513B-ERO1α-shRNA-3抑制ERO1α表达的效果最好,干扰效率在80%左右。pCD513B-ERO1α-shRNA-3能够转导多种细胞,并显著抑制ERO1α的表达,干扰效率在70%～90%。成功构建针对小鼠ERO1α基因的shRNA重组慢病毒载体,为进一步研究ERO1α功能奠定了技术基础。 相似文献
2.
为研究长链非编码RNA AK005183在精子发生中的功能,设计、合成了干扰AK005183表达的shRNA序列,并构建其干扰表达重组慢病毒载体CD513B-U6-AK005183,将干扰表达质粒及对照质粒分别转染NIH3T3细胞系,实时定量PCR检测CD513B-U6-AK005183质粒对AK005183的表达具有较好的干扰效果。利用第三代慢病毒包装系统,将CD513B-U6-AK005183、pGag-Pol、pRsv-rev、pVSV-G质粒共转染293T细胞系,包装得到滴度为5×106 TU/mL的干扰表达重组慢病毒。用CD513B-U6-AK005183慢病毒转导GC-1spg细胞系,检测到AK005183的表达下调64%。表明本研究成功构建并包装得到高效干扰长链非编码RNA AK005183表达的重组慢病毒,将为深入研究长链非编码RNA在精子发生过程中的功能奠定了基础。 相似文献
3.
【目的】构建猪神经介素B受体(NMBR)基因慢病毒过表达载体,并检测其在猪Leydig细胞中的表达,为研究NMBR基因过表达在猪睾丸间质(Leydig)细胞中的功能提供参考。【方法】根据猪NMBR基因(GenBank登录号:KM058699)CDS序列设计并合成特异性酶切引物,通过RT-PCR扩增获得猪NMBR CDS全长序列,构建pMD19-T-NMBR质粒;通过Xba Ⅰ和EcoR Ⅰ对pCD513B-1和pMD19-T-NMBR质粒双酶切,构建pCD513B-1-NMBR重组质粒;将pCD513B-1-NMBR重组质粒与辅助质粒共转染人胚肾细胞(HEK-293T),转染48 h后通过荧光倒置显微镜观察细胞中绿色荧光蛋白(GFP)情况,收集细胞培养液上清获得猪NMBR基因过表达慢病毒,并通过倍比稀释法测病毒效价;然后将猪NMBR基因过表达慢病毒转染猪Leydig细胞,转染48 h后观察细胞中GFP表达,收集细胞并通过实时荧光定量PCR检测NMBR mRNA的表达情况。【结果】通过RT-PCR成功扩增获得猪NMBR CDS全长序列,大小为1 173 bp;pMD19-T-NMBR重组质粒双酶切为2条特异性条带,条带大小分别与pMD19-T质粒和猪NMBR CDS序列片段大小一致,表明成功构建pMD19-T-NMBR质粒;通过双酶切获得线性化的pCD513B-1和NMBR序列;RT-PCR和测序结果表明,成功构建慢病毒过表达载体pCD513B-1-NMBR;pCD513B-1-NMBR转染48 h后,HEK-293T细胞中呈现大量绿色荧光,表明病毒包装成功,病毒效价约为4×106 TU/mL;NMBR基因慢病毒转染猪Leydig细胞48 h后,80%以上细胞有GFP表达,表明大部分细胞成功转染慢病毒;实时荧光定量PCR检测结果表明,转染慢病毒后能够极显著增加NMBR mRNA的表达(P＜0.01)。【结论】本试验成功构建了猪NMBR基因慢病毒过表达载体,并证实猪NMBR基因过表达慢病毒能够增加猪Leydig细胞NMBR基因的表达,为研究NMBR基因过表达在猪Leydig细胞中的作用奠定基础。 相似文献
4.
针对绵羊Myostatin基因特异性序列,设计4对shRNA,并合成高表达载体。将干扰质粒和高表达载体瞬时共转染HEK293细胞,应用Real-time PCR鉴定干扰效率,将筛选到最有效的shRNA表达载体和pDONR221载体进行BP重组反应,以获得含干扰序列的入门载体。然后将含干扰序列的入门载体和慢病毒表达的目的载体pLenti6/BLOCK-iT-DEST进行LR重组反应,以获得含干扰序列的慢病毒表达载体。qPCR检测病毒物理滴度。结果本试验成功构建绵羊Myostatin基因RNAi慢病毒载体,病毒的滴度为：9.3×109 TU/mL。为研究Myostatin基因对肌肉生长的影响提供了稳定感染细胞载体。 相似文献
5.
构建禽白血病病毒(ALV)衣壳蛋白p15基因慢病毒表达载体,并检测其在鸡肝癌细胞系(LMH)中的表达情况,以探讨p15基因对病毒复制、免疫信号通路的影响。以真核表达质粒pCAGGS-p15为模板扩增p15全长基因,经双酶切后克隆到慢病毒载体plvx-IRES-ZsGreen1上,构建成plvx-p15-Flag慢病毒表达质粒,将该质粒与辅助质粒共转染293T细胞产生慢病毒,将细胞上清中的病毒感染LMH细胞,检测p15蛋白表达情况。慢病毒载体在293T细胞上包装完成后,病毒滴度为2.25×105 TU/mL。慢病毒感染LMH细胞,基因和蛋白水平检测结果表明,p15蛋白表达良好。表达ALV p15基因的慢病毒包装成功,并且能够感染鸡源LMH细胞。该载体的构建为进一步研究p15蛋白的生物学功能提供工具。 相似文献
6.
《中国畜牧杂志》2015,(3)
构建冷诱导RNA结合蛋白(CIRP)过表达慢病毒载体,并对其进行病毒包装、鉴定与滴度测定,为进一步研究CIRP功能提供基础工具。本研究从4℃冷处理8 h的SD大鼠睾丸组织中获得CIRP的cDNA序列测序后,将其克隆入LV5质粒中,经双酶切及测序鉴定;利用脂质体将鉴定的阳性重组LV5-cirp表达载体与pGag/Pol、pRev、pVSV-G 3个质粒共转染到HEK-293T细胞,72 h收获上清,包装产生慢病毒。将所得病毒悬液梯度稀释后感染293T细胞,检测病毒滴度,以及采用Western blot方法验证基因表达情况。结果表明:经琼脂糖凝胶电泳鉴定、PCR鉴定、酶切及测序结果证明成功构建了LV5-cirp重组质粒,序列比对与设计序列符合率100%,并成功包装成慢病毒,病毒滴度为6.30×108TU/m L;将制备成功的CIRP慢病毒过表达载体感染293T细胞后,Western blot检测结果显示细胞中CIRP蛋白表达水平显著高于正常细胞以及慢病毒阴性对照组(P0.01)。本实验成功构建CIRP慢病毒过表达载体并完成了慢病毒包装及滴度的测定,为今后的研究提供了基础工具。 相似文献
7.
8.
构建并筛选针对干扰绵羊NYD-SP27基因的shRNA慢病毒载体。使用RNAi Target Sequence Selector软件设计并合成针对绵羊NYD-SP27基因的4条shRNA表达序列(shRNA1、shRNA2、shRNA3、shRNA4)及1条阴性对照序列(NC),分别将其连接到载体pLentiLox3.7(PLL3.7)中,得到4个shRNA干扰载体NYDSP27-shRNA及1条阴性对照载体NC-shRNA,同时将构建好的干扰载体及辅助质粒瞬时共转染至HEK-293FT细胞中,收集病毒液纯化后感染SP27-21细胞,48h后用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测NYD-SP27相对表达量,将干扰效果最好的载体用于进一步的研究中。结果表明,构建了重组慢病毒干扰载体,并成功包装成干扰慢病毒NYDSP27-shRNA-LV以及用来感染BHK-SP27-21细胞,48h后用实时定量PCR筛选出高效干扰绵羊NYD-SP27的片段NYDSP27-shRNA-1。为进一步研究NYD-SP27基因表达下调对绵羊精子发育的影响奠定了基础。 相似文献
9.
谭碧君 《上海畜牧兽医通讯》2008,(2):15-16
慢病毒载体作为基因治疗载体发展起来,现已用于转基因动物制备.本实验用磷酸钙沉淀法将转移质粒(pCCL-hCMV-eGFP)、包装质粒(pCMVΔR8.9)、包膜蛋白质粒(pMDG(VSV-G))三质粒共转染来源于人胚肾细胞系的包装细胞-293T,转染48 h后收集病毒上清,采用6孔板培养感染细胞,荧光显微镜计数EGFP阳性细胞法测定病毒滴度.载体滴度达2×107 TU/ml左右. 相似文献
10.
研究慢病毒载体介导的RNA干扰对水牛CD14基因表达的影响,设计并筛选具有抑制作用的靶序列。将真核表达载体pDsRed-N1-buffaloCD14转染293细胞株,建立稳定表达水牛CD14基因细胞系。同时设计5条水牛CD14 shRNA(319/421/755/970/1 041)以及1条阴性对照序列(NC-1864),构建慢病毒重组质粒pSicoR-GFP-shRNA。采用磷酸钙沉淀法将三质粒共转染293T细胞包装慢病毒,并进行滴度测定。最后,通过对慢病毒感染的pDsRed1-N1-buffalo CD14-293细胞进行QRT-PCR检测,筛选具有抑制效果的shRNA。结果显示:在各感染细胞组中,外源水牛CD14基因mRNA的表达均受到不同程度的抑制,其中,CD14 shRNA-970靶点的干扰效率最高,达到79.3%(P<0.01)。成功筛选出具有较高抑制效果的水牛CD14 shRNA靶序列,为研究CD14基因在布氏杆菌所致炎症反应中的作用,建立家畜布氏杆菌病防治新方法奠定了基础。 相似文献
11.
慢病毒介导的RNAi具有转移基因效率高,作用持久稳定等特点,成为基因治疗和基因功能研究的重要工具。本试验中将在细胞水平验证可以抑制禽流感病毒(AIV)PA、NP和PB2基因表达的miRNA克隆到pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR载体,构建多靶点miRNA表达载体(pcDNA6.2/PA+NP+PB2);鉴定正确后通过BP/LR重组反应将GFP和靶向AIV串联miRNA转座到慢病毒表达载体pLenti6/DEST,命名为pLenti6/PA+NP+PB2;鉴定正确后与辅助包装质粒共转染293FT,72h收集细胞上清进行病毒浓缩;采用梯度稀释法和real-timePCR法测定病毒滴度;通过感染MDCK细胞、CEF细胞及猪胎儿成纤维细胞,评价重组慢病毒的感染效率。结果,酶切和测序表明pcDNA6.2/PA+NP+PB2和pLenti6/PA+NP+PB2构建成功;浓缩后梯度稀释法检测病毒滴度为4×107TU/mL,real-timePCR法检测病毒滴度为1×108TU/mL;病毒感染MDCK细胞和猪胎儿成纤维细胞的感染效率显著高于CEF细胞的感染效率。结果表明,我们成功制备了表达靶向AIV多靶点miRNA重组慢病毒,并发现以VSVG替代了env囊膜后慢病毒对CEF细胞敏感性较低,为进一步研究AIV的防控和慢病毒介导的抗AIV转基因动物模型奠定了基础。 相似文献
12.
《家畜生态学报》2021,(6)
为了建立稳定干扰牛β-连环蛋白的牛肾细胞(MDBK)系,针对牛β-连环蛋白基因的mRNA设计3对shRNA引物序列,分别构建shRNA慢病毒干扰载体;将牛β-连环蛋白过表达载体和shRNA载体共转染293T细胞,检测shRNA的沉默效率;将筛选有效干扰β-连环蛋白的shRNA载体进行慢病毒包装,并利用包装好的重组慢病毒感染MDBK细胞,通过嘌呤霉素抗性筛选获得单细胞克隆,传代培养后检测β-连环蛋白的表达,获得有效沉默牛β-连环蛋白的稳定细胞系。结果表明,成功构建了牛β-连环蛋白干扰载体pYr-Lvsh-β-CAT1、pYr-Lvsh-β-CAT2、pYr-Lvsh-β-CAT3,均较好地沉默了β-连环蛋白的表达,经嘌呤霉素筛选和Western blot检测获得有效沉默β-连环蛋白的MDBK细胞系。该研究通过β-连环蛋白特异性shRNA慢病毒载体构建了稳定干扰牛β-连环蛋白的MDBK细胞系,为进一步探讨牛β-连环蛋白与病毒的相互作用及其分子机制奠定基础。 相似文献
13.
本研究旨在构建Zbtb38（zinc finger and BTB domain containing 38）基因慢病毒过表达质粒载体。以小鼠脊髓组织为材料,采用重叠延伸PCR方法扩增小鼠Zbtb38基因的CDS序列,分别设计Zbtb38 CDS序列前段扩增引物1和后段扩增引物2,再以上述两对引物的扩增产物作为模板,设计引物3并进行融合PCR扩增,由此得到Zbtb38 CDS全序列。将获得的Zbtb38基因CDS全序列连接到质粒pGM-T,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,采用直接PCR鉴定阳性克隆并进行测序验证。利用XhoⅠ和BamHⅠ双酶切方法将Zbtb38 CDS序列连接至慢病毒载体Plvx-puro,获得穿梭质粒Plvx-puro-Zbtb38,再与慢病毒包装质粒共转染293T细胞生产慢病毒颗粒。结果显示,引物1扩增产物包含Zbtb38 CDS全序列的第1-1 794 bp,扩增产物实际测序长度为1 772 bp,引物2扩增产物包含Zbtb38 CDS全序列的第1 762-3 594 bp,扩增产物实际测序长度为1 818 bp,说明分段扩增目的片段已成功。引物3扩增的预期融合产物及菌落PCR扩增产物均包含Zbtb38 CDS全序列（3 594 bp）,与NCBI数据库Zbtb38基因的CDS序列比对后的重合率达99.99%,表明Zbtb38 CDS序列扩增成功。实时荧光定量PCR检测结果显示,病毒滴度达3.25×108 Tu/mL,达到普通动物注射标准要求,提示慢病毒载体构建成功。综上所述,本试验成功构建了小鼠Zbtb38基因慢病毒过表达质粒载体。 相似文献
14.
《动物医学进展》2021,42(1)
为了构建靶向突触分化诱导基因1(SynDIG1)的shRNA慢病毒表达载体,设计出SynDIG1的siRNA的靶点序列,并合成含干扰序列的双链DNA发卡结构shRNA,合成的Oligo经过退火分别与双酶切处理后的pLKO.1-GFP载体连接。将构建的重组质粒pLKO.1-GFP-SynDIG1 shRNA转化到DH5α感受态细菌中,过夜培养后挑选阳性克隆子,扩增后提取DNA进行质粒测序,得到两个序列正确的重组质粒。用这些重组质粒转染HEK293T细胞以及大鼠海马神经元细胞,蛋白免疫印迹及细胞免疫荧光检测SynDIG1 shRNA对外源性和内源性SynDIG1表达的敲减作用。进一步用重组质粒转染HEK293T细胞产生慢病毒颗粒,用病毒颗粒感染DIV2和DIV14的神经细胞,免疫印迹检测SynDIG1的表达。结果表明这两个重组质粒均能够有效地抑制外源性和内源性SynDIG1的表达,对HEK293T中瞬时表达的SynDIG1敲减率达到75%,其慢病毒颗粒感染对早期神经细胞中内源性SynDIG1的表达抑制也很明显。用pLKO.1-GFP成功构建了能够有效抑制外源性和内源性SynDIG1表达的重组质粒,为探讨RNA干扰技术抑制神经细胞SynDIG1基因表达的相关研究奠定基础,为研究SynDIG1基因在神经传导和突触发育及其可塑性调节中的作用提供了有力工具。 相似文献
15.
为构建禽白血病病毒(ALV)衣壳蛋白P27慢病毒表达载体,并检测其在鸡肝癌细胞LMH中的表达,试验以实验室前期构建的pcDNA3.1-p27为模板,扩增p27基因,克隆入pLVX-IRES-ZsGreen1载体,构建的重组质粒命名为pLVX-p27,与辅助质粒psPAX2和pMD2.G共转染至HEK293T细胞,包装获得表达p27基因的重组慢病毒。将慢病毒上清感染293T和LMH细胞,检测细胞中p27基因的转录水平和蛋白表达水平。结果显示:重组质粒pLVX-p27构建正确,收集的慢病毒上清滴度为9×104TU/mL;实时荧光定量PCR、Western blot和共聚焦荧光试验结果显示P27蛋白主要定位于胞浆,p27基因的RNA和蛋白表达量在感染后96 h内随着感染时间延长逐渐升高。研究表明:表达p27基因的慢病毒包装成功,并且能感染293T及禽源LMH细胞,为进一步研究P27的生物学功能提供了工具。 相似文献
16.
旨在构建牦牛lncRNA ENSBGRT00000000387.1过表达慢病毒载体，并将其感染牦牛卵泡颗粒细胞(granulosa cells, GCs),了解它对细胞凋亡的影响。本研究提取牦牛卵泡RNA,以RT-PCR技术扩增lncRNA ENSBGRT00000000387.1全长序列，而后构建其重组质粒，并以慢病毒包装系统(pVSVG:pMDL:pRev)包装后利用qPCR法测定在293T细胞上的感染滴度，再感染分离培养的牦牛GCs,以qPCR检测GCs中lncRNA ENSBGRT00000000387.1的表达水平，并以流式细胞仪检测GCs的凋亡率，以Western blot和qPCR分别检测促凋亡基因CASPASE3、BAX和抑凋亡基因BCL-2的mRNA和蛋白表达水平。结果显示，由牦牛卵泡中成功扩增出lncRNA ENSBGRT00000000387.1的全长2 566 bp序列，将其与LV-EF1a-EGFP-2A载体同源区的片段同源重组，经酶切鉴定及测序验证表明成功构建了重组质粒，将之经慢病毒包装系统包装和浓缩后，在293T细胞的感染效率达(75.77±0.850)%... 相似文献
17.
《畜牧与兽医》2016,(2):70-73
为了构建猪骨骼肌肌球蛋白轻链激酶(sk MLCK)基因有效短发夹RNA(shRNA)的慢病毒载体,筛选出最佳干扰效率的序列,采用RNAi技术,设计并合成3条siRNA干扰序列,插入到慢病毒穿梭质粒(h U6-CMV-puror-Ploy A)上,与慢病毒包装系统共转染293T细胞,收集病毒上清并进行病毒滴度的测定,将其转染小鼠C2C12细胞,分别用实时定量PCR和Western blot方法检测细胞中sk MLCK基因mRNA和蛋白的表达。结果显示:PCR扩增和测序分析结果显示靶向sk MLCK RNAi慢病毒载体构建成功;转染小鼠C2C12细胞后,sk MLCK基因mRNA和蛋白均受到不同程度抑制,实时定量PCR显示,抑制率分别为(29.2±4.43)%、(76.4±7.33)%、(20.0±1.8)%;Western blot显示,抑制率分别为(29.6±5)%、(42.4±1.6)%、(34.3±1.2)%。结论:成功构建猪sk MLCK基因有效shRNA的慢病毒载体,确定干扰载体-2(sk MLCKRNAi-2)具有最佳干扰效果,证实sk MLCK基因RNAi慢病毒载体能有效抑制目的基因mRNA和蛋白的表达,为进一步研究该基因与肌肉肉质性状的关系奠定了基础。 相似文献
18.
试验旨在构建山羊生长分化因子9（growth differentiation factor 9,GDF9）慢病毒载体,并使其在山羊原代成纤维细胞中稳定表达。利用全基因合成法克隆了绵羊GDF9基因的CDS全长片段,长约1 362 bp,编码453个氨基酸。利用双酶切和连接,将GDF9基因片段亚克隆至慢病毒载体中,构建了过表达GDF9的慢病毒载体。将慢病毒载体与慢病毒包装质粒共转染293T细胞后,获得了滴度为1×106 TU/mL的慢病毒。利用制备的GDF9慢病毒感染山羊原代成纤维细胞后,观察荧光表明,60%以上的细胞能够观察到红色荧光,说明制备的慢病毒对山羊原代成纤维细胞具有较高的感染效率。经过嘌呤霉素筛选后,所有的细胞均能观察到红色荧光。实时荧光定量PCR分析表明,制备的细胞系中GDF9表达水平比对照组高12.17倍,说明成功获得了稳定表达GDF9的山羊成纤维细胞系。本试验结果为进一步研究GDF9基因的生物学功能,以及山羊未来的种质资源创新奠定基础。 相似文献
19.
《中国畜牧杂志》2015,(9)
本文旨在克隆奶山羊催乳素受体(PrlR)基因CDS序列,在此基础上构建针对奶山羊PrlR的腺病毒干扰载体,为研究PrlR在奶山羊乳腺乳脂合成代谢中的功能与调控作用提供有效的RNA干扰工具。首先从西农萨能羊乳腺组织RNA中扩增得到完整CDS区序列,其CDS长为1 746 bp,包含581个氨基酸序列,GenBank登录号为JF966783;测序后进行序列分析和功能预测,奶山羊PrlR基因CDS区与其他反刍动物相应序列具有较高的同源性,其跨膜区为第236~258位氨基酸;然后根据测序得到的CDS序列,在线设计合成奶山羊PrlR的shRNA序列并成功构建重组干扰腺病毒载体;将这些载体在293细胞系中进行包装和扩繁,最终获取高滴度的腺毒,使用TCID50法检测病毒滴度为5.19×108 PFU/m L。 相似文献
20.
水牛脂多糖结合蛋白基因表达载体构建及其shRNA片段的筛选 总被引：1，自引：0，他引：1
试验旨在构建水牛脂多糖结合蛋白(LBP)基因融合蛋白表达载体,探讨其在293细胞中的表达情况;筛选获得可抑制水牛LBP基因表达的shRNA干扰片段。采用RT-PCR方法,以水牛肝脏cDNA为模板,扩增水牛LBP开放阅读框(ORF),将其连接到pMD18-T载体中。序列测定并分析正确后,采用SalⅠ和BamHⅠ进行双酶切,将水牛LBP基因编码区定向克隆至pDsRed-N1载体中,构建其融合蛋白表达载体pDsRed-N1-LBP。设计2个针对LBP靶基因序列的shRNA(774-792、1212-1231),同时设计无关序列1864作为阴性对照。合成好的shRNA序列先退火连接到pUC 57载体上,再亚克隆到慢病毒表达载体pSicoR-GFP中,将重组质粒命名为pSicoR-GFP-shLBP774/1212/1864(N.C),采用PCR和测序方法鉴定阳性克隆。将LBP融合蛋白表达载体和其shRNA慢病毒表达载体经脂质体共转染293细胞,48 h后观测荧光蛋白表达情况。收集共转染细胞样品,采用实时定量PCR(QRT-PCR)检测LBP基因的表达,筛选有效抑制LBP基因表达的shRNA干扰序列。结果表明,成功构建水牛LBP融合蛋白表达载体pDsRed-N1-LBP,并在293细胞中瞬时表达。PCR和测序结果均证实所构建的shRNA慢病毒表达载体pSicoR-GFP-shLBP774/1212/1864(N.C)为阳性克隆。共转染48 h后观测,红色和绿色荧光蛋白均有表达。QRT-PCR检测结果显示,shRNA-774和shRNA-1212对293细胞中LBP基因mRNA的表达均有抑制效果,抑制效率分别为49.53%、29.27%。因此,设计合成的2条shRNA序列能有效抑制水牛LBP基因的表达,这为进一步探讨LBP基因在LPS诱导的革兰氏阴性菌跨膜机制和信号转导中的作用机理研究奠定了基础。 相似文献