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关岭牛MyoD基因家族对MyoD1启动子活性的影响 总被引：2，自引：0，他引：2
【目的】生肌决定因子(myogenic determination gene,MyoD)家族是肌肉生成过程中参与分子调控作用的一个重要家族。该家族包括MyoD1,Myf5,MyoG和Myf6,只表达在成熟的骨骼肌细胞和其前期细胞中;在其他的非肌细胞中, MyoD基因家族会被抑制。该家族中,MyoD1负责早期胚胎成肌祖细胞的激活并参与胚后骨骼肌的生长、发育和修复等方面的调节,以维持个体骨骼肌的相对稳定,是启动和维持骨骼肌细胞分化和生长的重要因素,具有尤为重要的作用,已成为研究热点。目前MyoD1在多态性和关联性分析等方面的研究较多,表达调控方面主要是研究小鼠、鸡和猪肌细胞生成机理;在牛上对它的研究主要在转录后和翻译水平的表达情况,但对MyoD1在转录调控方面的作用机制还不明确。文章研究关岭牛MyoD基因家族对MyoD1启动子活性的影响,为探讨牛MyoD1的表达调控机制奠定基础。【方法】通过设计特异性引物克隆关岭牛 MyoD基因家族CDS区和MyoD1启动子片段P1和P2;同时利用双酶切的方法分别将CDS区和克隆的启动子序列连入pcDNA3.1（+）和pGL3-Basic基本骨架,构建真核表达载体pcDNA3.1（+）-Myf5、pcDNA3.1（+）-Myf6、pcDNA3.1（+）-MyoD、pcDNA3.1（+）-MyoG和含萤火虫荧光素酶报告基因的报告载体pGL3-P1、pGL3-P2。重组质粒经酶切和测序鉴定后,利用共转染的方法将真核表达载体和报告载体转染小鼠C2C12细胞,30 h后裂解细胞并检测细胞裂解液的双荧光素酶活性。最后根据荧光素酶的相对活性来分析 MyoD基因家族对MyoD1启动子活性的影响。【结果】克隆得到的关岭牛 MyoD基因家族CDS区和MyoD1启动子序列测序正确,载体pcDNA3.1（+）-Myf5、pcDNA3.1（+）-Myf6、pcDNA3.1（+）-MyoD、pcDNA3.1（+）-MyoG、pGL3-P1和pGL3-P2经酶切和测序鉴定,证实载体构建成功;与相应剂量的对照组相比,转染pcDNA3.1（+）-Myf5、 pcDNA3.1（+）-Myf6、pcDNA3.1（+）-MyoD后,pGL3-P1的相对荧光素酶活性明显增强,其中,在转染量为200 ng时增强作用最强,差异显著(P＜0.05);转染pcDNA3.1（+）-MyoG后,虽然对pGL3-P1的相对荧光素酶活性有增强作用,但差异不显著(P＞0.05);而转染pcDNA3.1（+）-Myf5、 pcDNA3.1（+）-Myf6、pcDNA3.1（+）-MyoD、pcDNA3.1（+）-MyoG后,pGL3-P2的相对荧光素酶活性变化不明显 (P＞0.05)。【结论】在小鼠C2C12细胞中外源过表达转录因子MyoD、Myf5、Myf6均能显著提高关岭牛MyoD1启动子全长P1的转录活性(P＜0.05);而外源过表达转录因子 MyoD基因家族不能显著提高关岭牛MyoD1启动子核心区P2的转录活性。说明关岭牛MyoD、Myf5和Myf6转录因子与关岭牛MyoD1启动子的作用位点不在其核心启动子区P2上。 相似文献
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【目的】对鸭CD8α基因启动子活性区域进行分析,为鸭CD8α基因功能和表达调控机理研究提供依据。【方法】利用前期基因组步移技术获得的鸭CD8α基因的启动子区序列,制备一系列启动子缺失突变体（-625/-1 bp,-1 110/-1 bp,-1 413/-1 bp,-2 151/-1 bp）,定向亚克隆至荧光素酶表达载体pGL3-Basic 中,构建荧光素酶报告基因重组载体,采用 Lipofectamine 2000 将重组质粒瞬时转染DT40细胞,分析CD8α基因启动子系列缺失突变体在细胞内的转录活性。【结果】鸭CD8α基因 5′侧翼区长片段具有较强的启动子活性,-1110--625启动子活性最强,且-625--1和-625--1 110 bp区域均存在正调控元件。【结论】成功构建了荧光素酶报告基因真核表达载体,确定了鸭CD8α基因调控区,为进一步研究其转录调控机制奠定了基础。 相似文献
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[目的]为研究对虾白斑综合征病毒（WSSV）囊膜蛋白与虾细胞之间的作用机制奠定基础。[方法]采用PCR扩增方法构建含白斑综合征病毒囊膜蛋白VP28的真核表达重组载体pcDNA3.1（＋）-vp28,用磷酸钙共沉淀法将重组质粒转染到293T细胞中,采用SDS-PAGE和Western blot检测表达产物。[结果]VP28的PCR扩增产物在琼脂糖凝胶电泳中呈现出1条634bp左右的条带,与GenBank中vp28的序列完全一致。对pcDNA3.1（＋）-vp28转染后的阳性单克隆菌落进行PCR鉴定、扩大培养和质粒提取,并对所得质粒进行HindⅢ和BamⅢ双酶切,获得了5409和610bp左右的2条带,与预期结果一致;所获扩增产物与vp28序列完全一致,说明重组质粒pcDNA3.1（＋）-vp28被成功转染到293T细胞中;SDS-PAGE和Westernblot检测结果显示,pcDNA3.1（＋）-vp28在293T细胞中的表达产物与预期结果相符。[结论]pcDNA3.1（＋）-vp28在293T细胞中可成功表达VP28。 相似文献
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【目的】构建绒山羊血管内皮生长因子164（vascular endothelial growth factor 164,VEGF164）基因的毛囊特异表达载体并稳定转染胎儿成纤维细胞,筛选获得稳定表达红色荧光蛋白和毛囊特异表达VEGF164并可用于核移植的转基因细胞克隆。【方法】以pCDsRed2载体为基本骨架将VEGF164基因亚克隆到KAP6-1启动子下游,接续连接红色荧光蛋白表达元件,构建VEGF164基因毛囊特异表达载体pCDsRed2-KV（6.3 kb）。外源表达载体以lipofectamineTM2000介导转染胎儿成纤维细胞,G418筛选获得稳定转染的细胞克隆。PCR鉴定外源基因在细胞基因组中的整合。【结果】在构建的表达载体pCDsRed2-KV中,VEGF164基因被正确连接在毛囊特异性启动子KAP6-1下游,基因下游按顺序连接CMV启动子和红色荧光蛋白基因;外源KAP6-1启动子和VEGF164基因整合到细胞基因组中。【结论】成功构建稳定表达红色荧光蛋白和毛囊特异表达VEGF164的真核表达载体,稳定转染绒山羊胎儿成纤维细胞,为下一步通过克隆技术获得转VEGF164基因绒山羊提供了条件。 相似文献
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【目的】建立一种对人抗凝血酶(AT)Cys248位点进行定点突变和真核表达的可靠方法,为突变体的结构和功能研究提供原始材料。【方法】以人AT cDNA序列为模板,设计1对反向扩增引物,进行反向PCR反应;PCR产物经连接、测序后,克隆至表达质粒pcDNA3.1(+)-GFP上,构建重组真核表达载体pcDNA3.1(+)-mATGFP;用重组载体介导突变基因在山羊乳腺上皮(GME)细胞内表达,收集细胞培养上清液进行表达产物的定性、定量检测。【结果】突变基因经测序证实与预期结果一致,且在GME细胞内得到高效表达,细胞培养液上清中的突变体质量浓度为(526±17.3)mg/L。【结论】反向PCR法是对AT基因进行定点突变的可靠方法,AT突变基因在GME细胞内可高效表达。 相似文献
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[目的]构建毛囊特异性表达绵羊毛角蛋白Ⅱ型中间丝9（KIF Ⅱ-9）cDNA的毛囊特异性表达载体,并证明其表达的有效性。[方法]根据绵羊毛角蛋白关联蛋白6-1（KAP6-1）基因已知DNA序列设计合成2个特异性引物,以绵羊基因组DNA为模板,通过PCR扩增得到KAP6-15’调控序列,然后与毛角蛋白Ⅱ型中间丝基因（KIFII-9）cDNA、去除CMV启动子的表达载体pcDNA3.1连接构成皮肤特异性表达载体pcDNA3.1-KK,新生小鼠皮下注射该重组载体证明其表达有效性。[结果]PCR扩增出1042 bp的特异性片段,DNA测序结果证明,该克隆片段与KAP6-1 5’端调控区序列相比具有极高的一致性;构建的毛囊特异性表达载体PCDNA3.1-KK,皮下注射新生小鼠,皮肤内KIF Ⅱ-9得到转录。[结论]该试验构建的载体PCDNA3.1-KK具有表达特异性。 相似文献
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为筛选出较强的启动子用于提高外源基因在罗氏沼虾活体细胞中的转化表达效率,本研究构建包含eGFP基因和IE1、hr5-IE1及Sv40启动子的3个表达载体,分别按照10 μg·g-1标准注射于体重5~7 g的活体罗氏沼虾肌肉内,采集注射活体肌肉的RNA样品检测各个启动子转录eGFP基因的效率。结果表明,在罗氏沼虾体内hr5-IE1启动子对eGFP基因的表达活性最强,其对eGFP外源基因的转录水平是IE1的3倍以上,IE1对于eGFP的转录水平也显著高于SV40的转录启动效率,其中SV40在罗氏沼虾体内的转录启动水平未检测到eGFP基因的转录表达,表明包含节肢动物门跨物种转录调控元件(增强子hr5)的IE1启动子能够在罗氏沼虾体内正常启动下游基因的转录表达及翻译,是罗氏沼虾开展分子功能研究较优的外源基因表达启动调控元件。 相似文献
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《西北农林科技大学学报(自然科学版)》2020,(2)
【目的】构建ggamiRNA155前体基因（preggamiRNA155）真核过表达载体，验证ggamiRNA155在MDCMSB1细胞中的表达效果，探究其对MDCCMSB1细胞增殖的影响。【方法】采用PCR方法从鸡肝脏基因组DNA中扩增ggamiRNA155前体基因片段preggamiRNA155，并将其克隆入pMD 18T载体，构建克隆载体pMD18TpreggamiRNA155。用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切pcDNA6.2GW/EmGFPmiRNA真核表达载体和pMD18TpreggamiRNA155，preggamiRNA155酶切回收片段与pcDNA6.2GW/EmGFPmiRNA的酶切回收片段进行连接，构建重组真核表达载体pcDNA6.2preggamiRNA155，对其进行PCR、EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切及DNA测序鉴定。将重组载体转染到MDCCMSB1细胞中，应用实时荧光定量PCR ( Realtime PCR )检测ggamiRNA155的表达水平，利用MTT法检测细胞增殖能力的变化。【结果】PCR扩增获得了长度约154 bp的鸡preggamiRNA155基因。成功构建了preggamiRNA155的真核表达载体pcDNA6.2preggamiRNA155，瞬时转染MDCCMSB1细胞后ggamiRNA155表达水平显著增加，且MDCCMSB1细胞的体外增殖能力增强。【结论】成功构建了preggamiRNA155的真核表达载体，其可在MDCCMSB1细胞中过表达ggamiRNA155，且可促进MDCCMSB1细胞的体外增殖。 相似文献
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【目的】克隆大鼠胰岛素Ⅱ基因启动子（RIP2）序列并对其功能进行验证,为培育胰岛特异性表达外源基因的转基因动物奠定基础。【方法】根据GenBank中已发表的RIP2序列（J00748．1）设计引物,以大鼠基因组DNA为模板,PCR扩增RIP2序列,连接pMD18-T载体后用HindⅢ和BamH I进行双酶切,回收RIP2片段并连接至不含启动子的pEGFP-1载体上构建真核表达载体pEGFP-1-RIP2。重组质粒转染PK15细胞,24h后观察细胞荧光蛋白表达情况。【结果】克隆获得的RIP2序列与参考序列（J00748．1）的同源性为99．9％,存在3处碱基差异,即从起始密码子ATG（＋1）上游-57处有一个G碱基缺失,-387处C突变为A,-707处插入一个G碱基。RIP2序列存在一个TATA-box（-206～201位点）和一个CAAT-box（-343-339位点）。以重组质粒pEGFP-1-PIP2转染PK15细胞,24h后能观察到绿色荧光。【结论】克隆获得的大鼠RIP2序列具有启动子功能,但活性较CMV启动子弱。 相似文献
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构建硬酯酰辅酶A去饱和酶1(Stearoyl-CoA Desaturase l,SCD1)真核表达质粒pcDNA3.1(+)/SCD1,转染鹅原代肝细胞验证其对细胞中脂肪代谢的影响。根据鹅SCD1基因设计带有酶切位点引物,RT-PCR扩增SCD1基因,克隆至pMD-19T载体,亚克隆至pcDNA3.1载体,构建重组真核表达载体pCDNA3.1(+)/SCD1。酶切及序列测定测序正确后转染鹅原代培养肝细胞,荧光定量PCR检测SCD1基因的表达,并用油红O染色检测细胞中脂滴情况。结果:成功构建SCD1基因真核表达载体,转染鹅原代培养肝细胞后SCD1基因获得了表达,与脂肪代谢相关基因SREBP表达上调,同时检测到细胞中脂滴明显增多。结论:构建了重组质粒pCDNA3.1(+)/SCD1,并在鹅原代培养细胞中获得表达,为进一步研究SCD1基因在鹅肝脏脂肪代谢中的作用奠定基础。 相似文献
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牛干扰素-γ基因的克隆与真核表达载体的构建 总被引：1，自引：0，他引：1
根据Genebank中已发表的INF-γ蛋白cDNA序列保守区设计一对特异性引物,应用RT-PCR技术从Con A活化的牛外周血单核细胞中扩增到编码牛INF-γ蛋白基因,其大小为510 bp左右。将该基因克隆到pMD18-T载体中,测序结果与Genebank上发表的INF-γ基因序列进行比较,其同源性为99.8%。将该基因从重组pMD18T-IFN质粒中克隆到表达载体pcDNA3.1(+)质粒中,构建真核表达重组质粒,经酶切和PCR鉴定后表明构建的重组质粒为阳性。 相似文献
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【目的】固醇调节元件结合蛋白1(SREBP1)作为核转录因子,对于细胞脂肪合成酶基因的表达发挥着重要的调控作用。论文旨在奶牛乳腺上皮细胞中研究SREBP1对于SCD1基因启动子的转录调控作用,为进一步明确SREBP1对于靶基因的转录调控机制提供理论基础。【方法】以荷斯坦奶牛乳腺组织的c DNA为模板,采用分段克隆的方法获得SREBP1基因的编码序列,通过重组酶与pc DNA3.1载体进行重组环化构建pc DNA3.1-SREBP1表达载体,将构建的载体测序验证后提取质粒,转染奶牛乳腺上皮细胞。以EIF3K基因为内参基因,采用荧光定量PCR检测SREBP1基因m RNA的表达差异;采用免疫荧光的方法对SREBP1进行标记,以DAPI复染细胞核,激光共聚焦观察SREBP1蛋白的亚细胞定位;转染含有不同调控元件的SCD基因启动子,同时转染1.0μg pc DNA3.1-SREBP1作为处理,荧光素酶报告基因系统分析启动子活性;分别转染0.25、0.5和1μg的pc DNA3.1-SREBP1载体,分析p GL3-SCD 2和p GL3-SCD3启动子活性与SREBP1之间的量效关系。【结果】分段克隆得到的PCR产物分别为1 170、1 116、363和900 bp的片段,经过与pc DNA3.1载体重组后获得pc DNA3.1-SREBP1表达载体,经酶切和测序验证,发现除1个无义突变外,与标准序列完全相同,整个序列长度达到3 510bp;将pc DNA3.1-SREBP1载体转染乳腺上皮细胞后,Real-time PCR检测发现与转染空载体的对照组相比,SREBP1基因的m RNA表达倍数增强130.4倍(P0.001);激光共聚焦观察发现,DAPI染色的细胞核呈蓝色,免疫荧光标记的SREBP1呈绿色,二者融合后呈现青色,共定位在乳腺上皮细胞核中;启动子活性检测发现,与p GL3-SCD1、p GL3SCD 2相比,SREBP1处理能够极显著增加p GL3-SCD3、p GL3-CD4启动子的活性(P0.001),分别比对照组提高了1.0倍和0.7倍,进一步分析发现,在用0.25—1μg的pc DNA3.1-SREBP1处理后,与p GL3-SCD2的启动子活性持续下降相比,p GL3-SCD3的启动子活性从59.81上升到108.43(P0.001),二者存在剂量效应关系,结合SCD2和SCD 3启动子上主要的结构差异SRE元件(5′-AGCAGATTGCG-3′),推测此序列可能是SREBP1调控SCD基因启动子转录的结合序列。【结论】克隆构建奶牛SREBP1基因表达载体,亚细胞定位SREBP1蛋白主要在乳腺上皮细胞核中,SREBP1可以与SRE调控元件结合促进SCD1基因启动子的转录。 相似文献
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【目的】掌握罗氏沼虾健康育苗的关键技术,为罗氏沼虾育苗生产提供科学参考。【方法】2010年6月,在127.3 m3水体中投放2700.00万尾罗氏沼虾幼体进行健康育苗试验,综合育苗幼体PCR病毒检测、控制适中育苗密度、加强水质调控、禁止使用抗生素等主要技术措施,培育23～27 d。【结果】90%幼体变态,获得淡化虾苗1721.30万尾,单位水体产量13.50万尾/m3,平均育苗成活率为63.69%,平均运输成活率为86.0%。经检测,虾苗种质量达到罗氏沼虾苗种标准（DB45/T 515-2008）的要求。【结论】采用健康育苗技术可有效提高罗氏沼虾苗质量及养殖成活率,其健康育苗技术主要包括：保持育苗水质良好、控制中等的育苗密度（15.00万尾/m2）、禁止使用抗生素、不滥用药物及防治育苗病害等措施。 相似文献
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【目的】研究鲻鱼混养密度与网箱围隔对鱼虾混养效果和水质的影响,为今后发展推广鱼虾混养模式提供科学依据。【方法】分别在3.2 m×3.2 m的室内水泥池放养800尾虾苗（处理I）、800尾虾苗＋1.0 kg鲻鱼（处理II）、800尾虾苗＋2.0 kg鲻鱼（处理III）、800尾虾苗＋3.0 kg鲻鱼（处理IV）、800尾虾苗＋2.0 kg鲻鱼（处理V）,处理V用网箱将鲻鱼隔离在网内而对虾可通过,探讨凡纳滨对虾与鲻鱼混养对鱼虾生长、饲料效率、能量效率和蛋白质效率及水质的影响。【结果】收获时,凡纳滨对虾的体长、体重、产量、增重率、特定生长率及鲻鱼的体重、增重率、体重特定生长率均随鲻鱼混养密度增加而呈下降趋势;采用网箱围隔相对其他混养处理能够明显改善对虾的生长状况,但仍显著低于单养对虾处理（P〉0.05,下同）。【结论】凡纳滨对虾混养鲻鱼能有效提高饵料利用率,但由于鲻鱼抢食虾料而影响对虾生长;采用网箱围隔混养在一定程度上能改善对虾生长,却未能提高饵料利用率。因此,凡纳滨对虾混养鲻鱼时,二者间的合理放养密度有待下一步探究。 相似文献
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[目的]构建犬细小病毒(CPV) VP2基因真核表达质粒,为研究核酸疫苗奠定基础.[方法]参考GenBank中发表的CDV N蛋白基因序列设计引物,采用RT - PCR方法从疑似犬瘟热病犬全血样品中扩增CDV N蛋白基因,将其克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+).经测序验证后,小白鼠尾静脉注射瞬时表达CDV N蛋白基因,8h取其肝脏提取总RNA,进行RT - PCR方法扩增.[结果]在病犬的全血样品中扩增得到1 572 bp的CDV N蛋白基因片段,并构建了真核表达质粒pcDNA3.1(+)- CDV N,从瞬时表达的小白鼠肝脏总RNA中可扩增到目的条带.[结论]构建了犬瘟热病毒N蛋白基因真核表达质粒,并在小白鼠体内进行了瞬时表达. 相似文献
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[目的]构建犬细小病毒(CPV)VP2基因真核表达质粒,为研究核酸疫苗奠定基础.[方法]根据CPVVP2基因序列设计特殊引物,采用PCR方法从疑似"犬细小病毒"的患犬粪便基因组中扩增VP2基因,将其克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+),测序验证后,小白鼠尾静脉注射瞬时表达VP2基因,8 h后取小白鼠肝脏提取总RNA,进行RT-PCR扩增.[结果]在病犬粪便基因组中扩增得到1 755 bp的VP2基因片段,并构建了真核表达质粒pcDNA3.1(+)-VP2,从瞬时表达的小白鼠肝脏总RNA中可扩增到目的条带.[结论]成功构建了犬细小病毒VP2基因真核表达重组质粒,并在小白鼠体内进行了瞬时表达. 相似文献
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VP28蛋白鸡源抗WSSV卵黄抗体的制备及性能分析 总被引：1，自引：0，他引：1
为了研制鸡源抗对虾白斑综合征病毒（WSSV）卵黄抗体（IgY）,利用WSSV毒株及其衣壳蛋白VP28制备成2种不同的疫苗,并分别免疫接种健康蛋鸡群,使鸡群产生不同的IgY,经病毒中和试验证实,2种IgY均有明显的抗WSSV效果,其中WSSV粗提液1∶1000倍稀释时,WSSV灭活苗免疫蛋鸡产生的IgY对南美白对虾的保护率为61.7%,重组VP28疫苗免疫蛋鸡产生的IgY保护率为48.3%;而WSSV粗提液1∶10000倍稀释时,WSSV灭活苗免疫蛋鸡产生的IgY保护率为85.0%,重组VP28疫苗免疫蛋鸡产生的IgY保护率为75.0%. 相似文献
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【目的】构建猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）GP5基因C3d-P28分子佐剂重组质粒,探明C3d-P28分子佐剂的免疫增强效果。【方法】用大肠杆菌疫苗对健康猪进行免疫激活,提取猪肝脏总RNA,RT-PCR克隆C3d-P28并连接至pUC19载体,构建pUC19-P28.n（2、4、6）串联体,然后分别将P28.n（2、4、6）连接至真核表达载体pcDNA3.1构建成 pcDNA3.1-P28.n（2、4、6）。RT-PCR扩增PRRSV GP5基因,分别定向克隆至pcDNA3.1-P28.n（2、4、6）中,构建pcDNA3.1-GP5-P28.n（2、4、6）重组质粒;提取重组质粒进行双酶切、电泳,同时用重组质粒转染Marc 145细胞,经间接免疫荧光进行蛋白表达检测,并用重组质粒免疫小鼠,通过ELISA试剂盒检测小鼠体内抗体、IL-4和IFN-γ的水平,检验重组质粒的免疫效果。【结果】从猪肝脏中克隆了C3d cDNA,构建了pcDNA3.1-P28.n（2、4、6）串联体,并将PRRSV GP5基因定向克隆至真核表达载体pcDNA3.1-P28.n（2、4、6）中,构建了PRRSV GP5重组质粒（pcDNA3.1-GP5-P28.2、pcDNA3.1-GP5-P28.4、pcDNA3.1-GP5-P28.6）;通过检测小鼠血清中抗体、IL-4和IFN-γ的结果显示,抗体效价、IL-4和IFN-γ含量均比对照组高,且以pcDNA3.1-GP5-P28.6组的效果最好,与空白对照及PCDNA3.1-GP5组比较差异均显著（P<0.05）。【结论】构建了猪补体C3d-P28分子佐剂PRRSV GP5重组质粒,该质粒可刺激机体产生较高的体液免疫和细胞免疫水平,补体 C3d-P28分子佐剂能显著增强PRRSV GP5基因的免疫效果。 相似文献