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[目的]对牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)gE基因表位进行原核表达,并对表达产物进行免疫原性鉴定。[方法]利用PCR扩增出gE基因2段表位(gE-A、gE-B),并构建原核表达重组质粒pET-32a-gE。将其转化BL21(DE3)表达菌中,IPTG诱导表达。表达的gE重组蛋白经亲和层析纯化后,进行Westernblot分析。[结果]重组表达质粒pET-32a-gE经过PCR、双酶切及测序证明成功构建重组质粒。SDS-PAGE结果表明,gE蛋白在大肠埃希菌中高效表达,表达的重组蛋白相对分子量约52ku,与预期蛋白分子量一致。纯化后的gE重组蛋白浓度为0.254mg/mL。免疫印迹结果表明,纯化后的gE重组蛋白能与IBR标准阳性血清发生特异性反应,说明其免疫原性良好。[结论]成功表达了gE基因表位蛋白,该蛋白具有良好的免疫原性,可作为检测IBRV的gE抗体的候选抗原。 相似文献
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【目的】反向遗传学技术构建EgM123基因重组狂犬病SRV9病毒疫苗株,研究狂犬病病毒G基因、细粒棘球绦虫EgM123基因、eGFP基因重组质粒在真核细胞中的蛋白表达效果与蛋白免疫原性,为通过反向遗传学拯救eGFP标记EgM123基因重组狂犬病病毒,制备狂犬病-包虫病二联基因重组疫苗提供研究基础。【方法】将已构建的携带eGFP增强型绿色荧光蛋白的狂犬病病毒G基因重组细粒棘球绦虫EgM123基因重组质粒(3033 bp)利用脂质体转染方法转染BHK-21细胞,使其在BHK-21细胞中表达出融合蛋白,并通过荧光显微镜观察、SDS-PAGE聚丙烯酰氨凝胶电泳、Western blotting试验鉴定融合蛋白的荧光蛋白表达、融合蛋白分子量,鉴定其免疫原性。【结果】在转然后48 h可见绿色荧光蛋白的表达;通过SDS-PAGE聚丙烯酰氨凝胶电泳结果显示,重组质粒在BHK-21细胞中表达获得分子量约为120KDa的融合蛋白;Western blotting结果显示,将蛋白凝胶转移PVDF膜分别经狂犬病病毒G蛋白单克隆抗体、EgM123多克隆抗体、GFP单克隆抗体分别孵育,均在120KDa处可见抗原抗体结合条带。【结论】eGFP标记的狂犬病病毒G基因重组细粒棘球绦虫EgM123基因重组质粒在真核细胞中成功表达出融合性蛋白,且具有免疫原性, 相似文献
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根据GenBank上已发表的PCV2的衣壳蛋白(Cap蛋白)基因设计1对引物,利用PCR方法从已知PCV2病毒中扩增到l条DNA片段,将PCR产物克隆至pMD18-T载体上获得稳定质粒,酶切及测序鉴定后,获得大小为578 bp的Cap基因序列,将该基因插入表达载体pET-30a质粒中,获得重组质粒pET-30a-PCV2-Cap,并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中。重组质粒pET-30a-PCV2-Cap经IPTG诱导后表达的重组蛋白分子量为28.0kD,经破碎后SDS-PAGE电泳分析表明该蛋白具有可溶性。Western blot分析表明,该重组蛋白与PCV2阳性血清发生特异性反应,表明该重组蛋白具有良好的反应原性。 相似文献
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《江苏农业学报》2016,(5)
本研究旨在构建含家蚕微孢子虫孢壁蛋白基因SWP25的家蚕卵巢细胞(BmN)表达质粒,检测该基因在宿主细胞中的表达,为在细胞水平筛选与家蚕微孢子虫孢壁蛋白SWP25相互作用的宿主蛋白奠定基础。利用家蚕核型多角体病毒Bac-to-Bac表达系统,将家蚕微孢子虫孢壁蛋白基因SWP25和报告基因EGFP克隆到杆状病毒转移载体pFast Bac1中,转化BmDH10Bac感受态细胞并筛选阳性重组质粒用于转染BmN细胞。经PCR技术鉴定,成功获得重组杆状病毒质粒v BmEGFP-SWP25。在转染成功的细胞中可观测到绿色荧光信号。使用Western blot方法在感染重组病毒的家蚕BmN细胞中检测到大小约55 000的重组蛋白条带,与理论值一致,表明家蚕微孢子虫孢壁蛋白基因SWP25在BmN中成功表达。 相似文献
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利用重组PCR技术将猪瘟病毒兔化弱毒株(Hog cholera virus lapinized Chinese strain,HCLV)Erns编码区30位His残基密码子CAT突变为Pro残基密码子CCC,将突变后的基因克隆至原核表达载体pET-28a( )中,构建成重组质粒pETmErns,并将此重组子转入宿主菌BL21(DE3)plysS中,在IPTG的诱导下表达重组转化菌.结果:突变的mErns基因能在pET表达系统成功表达.用Western blotting检测表明,所表达的蛋白是猪瘟病毒特异性的,但克隆于pET-28a( )中未突变的Erns基因却不能表达,说明Erns基因的RNA酶活性是影响该基因在Escherichia coli中表达的因素之一. 相似文献
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【目的】克隆南方番茄病毒(STV)的外壳蛋白(CP)基因,构建其原核表达载体并进行诱导表达,为制备检测该病毒的高效价血清提供参考。【方法】利用一步法RT-PCR从新疆加工番茄上克隆STVCP基因,将其连接到原核表达载体pET-28a(+)上,获得重组质粒pET-28a-STV CP。将重组质粒转化大肠杆菌BL21后用IPTG进行诱导表达。【结果】成功克隆了STVCP基因,其长度为1 134bp。构建了原核重组表达质粒pET-28a-STV CP,其在1mmol/L IPTG诱导下,成功表达出分子质量约47ku的蛋白。【结论】成功克隆了STV CP基因,并诱导了pET-28a-STV CP重组蛋白的原核表达。 相似文献
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以鸡传染性支气管炎病毒M41毒株基因序列为模板,利用PCR方法扩增膜定位信号缺失的S1基因(dS1),将其亚克隆入杆状病毒表面展示质粒pBACsurf-1中,再次将S1及gp64的基因片段克隆到杆状病毒转移质粒pFastBacTMDual,得到重组质粒pFastBac-gp64-dS1.将该重组质粒转化到DH10Bac感受态细胞中,获得重组穿梭载体Bacmid-gp64-dS1,提取重组Bacmid质粒,以PCR验证其正确性.将阳性重组Bacmid质粒利用脂质体转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒BV-dS1.间接免疫荧光试验表明,该重组杆状病毒可以Sf9昆虫细胞膜表达鸡传染性支气管炎病毒S1蛋白. 相似文献
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将PCR扩增的K99和K88-LTB基因片段串联插入到干酪乳杆菌细胞表面表达载体pLA中,构建了重组表达载体pLA-K99-K88-LTB,将其电转化干酪乳杆菌CICC 6 105,获得了表达融合蛋白pLA-K99-K88-LTB的重组干酪乳杆菌表达系统.重组干酪乳杆菌在MRS培养基中表达后,经SDS-PAGE检测,约... 相似文献
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利用PCR技术,从E.coli C83902中扩增出不含信号肽序列的K88ac菌毛蛋白亚基基因片段,将其克隆到表达载体pQE-30中,构建了原核表达载体pQE30-K88ac,并转入E.coli XL1-Blue中。经IPTG诱导后,由T5启动子调控表达了氨基端带6个连续组氨酸残基的以包涵体形式存在的K88ac蛋白,在变性条件下对目的蛋白进行纯化,并获得了高纯度的融合蛋白。 相似文献
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为了高效表达狂犬病病毒HEP-Flury的核蛋白,选取抗原决定簇富集区,利用生物信息学技术分析了狂犬病病毒HEP-Flury N蛋白的核苷酸序列.根据大肠埃希菌Escherichia coli对密码子的偏嗜性,首先对所选取的核苷酸序列进行修饰、引入酶切位点,然后定向克隆至原核表达载体pET-32a(+),构建重组质粒pET-32-NP.将其转化表达宿主菌Escherichia coli BL21(DE3)pLysS,以IPTG诱导表达.表达产物经SDS-PAGE电泳,发现在相对分子质量34 000处有1条特异的蛋白带,与预期大小一致.Western-blotting检测结果显示,该蛋白可被鼠抗His单克隆抗体及犬抗RV多克隆抗体特异识别,表明所表达的N蛋白具有良好的免疫原性. 相似文献
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OsMAPK4基因的原核表达及蛋白纯化 总被引：2，自引：0，他引：2
构建OsMAPK4基因的原核表达载体,对表达产物进行鉴定和纯化,为转OsMAPK4基因植株后期的Western Blot检测提供抗原。用PCR方法从本实验室已构建的植物表达载体pUM4上扩增OsMAPK4基因,将其克隆至pET32b原核表达载体,构建重组载体pET32b-MAPK4。转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE分析。用Ni-NTA亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,用Western Blot进行蛋白鉴定。结果表明,原核表达载体构建正确;SDS-PAGE分析及Western Blot鉴定中,均出现了与DNAMAN预测的43.6 ku大小一致的蛋白条带;得到纯化蛋白。成功构建了OsMAPK4基因的原核表达载体,得到纯化蛋白,为转OsMAPK4基因水稻植株体内蛋白表达活性的检测提供了抗原。 相似文献
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[目的]原核表达牛病毒性腹泻黏膜病毒(BVDV)E2基因编码蛋白。[方法]采用PCR方法从BVDV中扩增E2基因片段,与原核表达载体pET-32a连接,构建重组表达质粒pET-32a-E2,转化E.coli(Rosetta)感受态细胞,重组菌用1 mmol/L IPTG诱导表达E2蛋白,进行SDS-PAGE电泳,并用Ni-NTA亲和层析柱纯化目的蛋白,经Western blot分析鉴定免疫原性。[结果]重组质粒pET-32aE2经PCR及酶切鉴定证明构建正确,重组质粒能够在大肠杆菌中大量表达,表达产物的分子质量大小约为58 kDa,纯化后E2重组蛋白浓度0.521 mg/mL,Western blot分析表明,其能被BVDV阳性血清识别,具有很好的免疫原性。[结论]E2蛋白成功表达,为后续建立BVDV检测方法奠定了基础。 相似文献
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为获得表皮葡萄球菌aap基因domain B片段的原核表达产物,采用PCR方法扩增引起新疆南疆地区奶牛乳房炎的表皮葡萄球菌株aap基因domain B片段,并克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,构建重组质粒pET-32a(+)-aap,将重组质粒转化至宿主菌E.coli BL21中诱导表达。结果表明,克隆得到aap基因domain B片段为2 316bp,Aap蛋白分子质量184.5ku。在宿主菌E.coli BL21中表达的最佳诱导时间为4h,IPTG最佳诱导浓度为0.75mmol/L;纯化时洗杂缓冲液中咪唑浓度为40mmol/L,洗脱缓冲液中咪唑浓度为200mmol/L时可以获得单一Aap蛋白。 相似文献
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为了克隆表达鼠疫耶尔森氏菌的YscF抗原基因,并对其免疫原性进行初步研究,将PCR扩增的YscF基因连接到pMD-18T载体,测序正确后再将YscF基因连接到表达载体PET32a,构建PET32a-YscF重组质粒,并在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达;诱导表达蛋白采用Ni2+亲和层析法纯化,Western blot检测其免疫原性。结果显示,28 ku的PET32a-YscF融合蛋白能被兔抗鼠的多抗识别,说明表达产物具有良好的抗鼠疫抗原特异性。 相似文献
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根据GenBank中的牛型布鲁氏杆菌OMP10序列,设计一对引物,以布鲁氏菌疫苗株S2全基因组DNA为模板扩增OMP10基因,将目的基因克隆入pEASY-T3,经测序正确后,与载体pET-32a(+)连接,构建重组表达质粒pET-32a/OMP10,转化E.coli BL21(DE3),用IPTG诱导表达融合蛋白pET-32a/OMP10,经SDS-PAGE及Western-blot分析鉴定后,采用Ni-NTA Spin Kit纯化目的蛋白,并免疫小鼠。结果表明,成功构建了含OMP10的表达载体,经多次对表达条件的优化,获得了纯度较高的目的蛋白,为进一步动物免疫试验及研究其免疫原性和抗感染保护作用奠定了基础。 相似文献