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1.
【目的】构建猪瘟病毒(Classical Swine Fever Virus,CSFV)E2基因主要抗原区原核表达质粒载体,高效表达E2蛋白,为进一步研究E2亚单位疫苗提供物质基础。【方法】用RT-nested PCR技术扩增CSFV流行毒株SX-YL株E2基因主要抗原区,克隆于表达载体pET32a中,成功构建表达质粒pET32a-E2,将pET32a-E2转入BL21(DE3)受体菌并用IPTG诱导表达E2蛋白,对E2蛋白进行SDS-PAGE电泳、Western-blot分析和可溶性鉴定。【结果】CSFVE2基因得到了高效表达,表达蛋白量占菌体蛋白量的33.2%,表达蛋白E2主要以包涵体形式存在;免疫印迹分析结果表明,表达蛋白E2能识别天然猪瘟多克隆抗体。【结论】E2蛋白表达量高并具有生物学活性。 相似文献
2.
猪瘟病毒E2糖蛋白主要抗原域的原核表达及纯化 总被引：1，自引：0，他引：1
本实验利用PCR方法从pUC18-E2上扩增出E2基因的主要抗原域片段,长为601 bp,将该PCR产物克隆到原核表达载体pET32a上,得到pET32a-e2重组质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导重组蛋白表达,SDS-PAGE和Western blot检测蛋白表达,目的蛋白以包涵体形式表达,其分子量42KD左右;Ni亲和层析柱纯化融合蛋白,并通过Western blot检测.pET32a-e2重组子的构建及蛋白表达与纯化为进一步制备多克隆抗体或单克隆抗体打下了基础. 相似文献
3.
H5N1亚型禽流感病毒血凝素(HA)基因的表达及纯化 总被引：6，自引：2，他引：4
利用PCR方法从含禽流感病毒HA基因的质粒T-HA上扩增HA基因,再将其克隆到原核表达载体pET28a中,用E.coliBL21(DE3)原核表达,SDS-PAGE和Western-blot对表达蛋白进行鉴定。Western-blot结果表明,表达产物具有免疫学活性,蛋白的分子量约为60kD,位于包涵体中。包涵体经变性、复性处理,表达蛋白能与H5亚型AIV阳性血清特异性反应,具有良好的抗原性。ELISA检测结果表明,用此纯化蛋白作为包被抗原检测H5N1亚型AIV血凝素抗体具有良好的灵敏性。 相似文献
4.
【目的】构建兔出血症病毒衣壳蛋白VP60基因的原核表达载体,进行原核表达并制备其蛋白抗体。【方法】以保存的VP60基因的质粒(pTeasy-VP60)为模版,用PCR方法获得VP60基因,并将其克隆到pET28a(+)载体上,构建重组表达载体pET28a(+)-VP60,酶切鉴定和测序验证后转入大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,优化诱导表达时间和IPTG浓度;利用镍离子螯合层析纯化重组蛋白,并制备了高效价的抗VP60多克隆抗体。【结果】成功构建了兔出血症病毒衣壳蛋白VP60的原核表达质粒pET28a(+)-VP60,其在大肠杆菌中以包涵体形式高效表达,重组蛋白分子质量为60 ku,制备的多克隆抗体具有较强的免疫结合活性。【结论】成功实现了VP60基因的原核表达,制备了重组蛋白VP60的多克隆抗体,为进一步的VP60转基因研究奠定了基础。 相似文献
5.
6.
斑马鱼p53基因原核表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达 总被引：1，自引：0，他引：1
利用原核表达系统克隆表达斑马鱼p53基因。RT-PCR法从斑马鱼胚胎中扩增获得p53基因编码区,并将其克隆至原核表达载体pET28a上,构建重组质粒pET28a/z-p53,将重组质粒转化E.coli BL21(DE3)受体菌,IPTG诱导表达,表达产物经镍柱纯化、尿素透析复性,SDS-PAGE电泳分析,结果表明,p53基因在大肠杆菌中成功表达,表达的p53融合蛋白分子量大约为53kD,透析复性后获得了高纯度可溶性的p53蛋白。 相似文献
7.
《江西农业学报》2017,(3)
为获得可溶性Butelase 1蛋白,将Butelase 1基因插入到带有NusA促溶标签的原核表达载体上,将重组质粒转化至大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)感受态细胞中进行诱导表达,用Ni-NTA亲和层析法纯化表达的可溶性蛋白,用SDS-PAGE和Western blot分析蛋白的表达情况。酶切和测序结果证实p ET21b-His6-NusA-Butelase 1原核表达载体构建成功。SDS-PAGE分析结果表明诱导后表达的融合蛋白大小为94.9 k D,主要为可溶性表达,部分为包涵体表达。Western blot检测结果显示,纯化得到的His6-NusA-Butelase 1融合蛋白用抗His6-Tag抗体鉴定时为特异性表达。 相似文献
8.
《江西农业学报》2022,(3)
为获得可溶性Butelase 1蛋白,将Butelase 1基因插入到带有NusA促溶标签的原核表达载体上,将重组质粒转化至大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)感受态细胞中进行诱导表达,用Ni-NTA亲和层析法纯化表达的可溶性蛋白,用SDS-PAGE和Western blot分析蛋白的表达情况。酶切和测序结果证实p ET21b-His6-NusA-Butelase 1原核表达载体构建成功。SDS-PAGE分析结果表明诱导后表达的融合蛋白大小为94.9 k D,主要为可溶性表达,部分为包涵体表达。Western blot检测结果显示,纯化得到的His6-NusA-Butelase 1融合蛋白用抗His6-Tag抗体鉴定时为特异性表达。 相似文献
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为获得含有口蹄疫病毒( foot and mouth disease virus,FMDV)3D蛋白C端多个Th表位的重组表达蛋白，根据口蹄疫3D C端160个氨基酸序列，设计优化并人工合成相应的核酸序列，将其克隆至pET28a，构建原核表达质粒pET28a C160，并将重组质粒转化BL21(DE3)，0.5 mmol/L IPTG诱导后，收集菌液进行SDS PAGE和Western blot鉴定。结果显示，在25 ku处有一条明显的蛋白表达条带，且重组蛋白能与豚鼠抗O型口蹄疫病毒阳性血清发生特异性反应。对表达产物进行可溶性分析，结果显示，表达蛋白全部以包涵体形式存在，经变复性后获得较高质量浓度的纯化蛋白。可见：用纯化的3D C160蛋白作为Th佐剂与口蹄疫主抗原混合制成疫苗，免疫后能刺激猪体产生较高水平的口蹄疫抗体。 相似文献
10.
[目的]为研究非洲猪瘟病毒(ASFV)泛素结合酶(UBCv1)的生物学功能及致病机制奠定基础.[方法]以p3XFLAG-CMV-7.1-I215L质粒为模板,利用PCR方法扩增非洲猪瘟病毒I215L基因,将其克隆至原核表达载体pET-28a,构建pET-28a-I215L重组质粒,并将其转化大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达重组蛋白.重组蛋白经His柱层析纯化后免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,采用ELISA方法检测抗体效价,Western blot检测抗体特异性.[结果]成功构建了重组质粒pET-28a-I215L,重组菌经IPTG诱导后能够可溶性表达重组蛋白,产物约28 kDa,与预测大小一致.用纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,ELISA测定抗体效价为1∶7290000;Western blot结果显示抗体具有较好的特异性.[结论]成功表达纯化了ASFV的泛素结合酶并制备其多克隆抗体,为后期解析ASFV泛素结合酶的结构、功能及病毒相关致病机制提供了重要的生物材料. 相似文献
11.
[目的]表达出猪圆环病毒3型(PCV3)衣壳蛋白(Cap),为PCV3免疫学检测方法建立基础.[方法]用PCR技术扩增PCV3-Cap基因片段,与pET-32a原核表达载体定向连接,构建重组原核表达质粒.经大肠杆菌表达后,通过SDS-PAGE来检测目的蛋白的大小与存在方式,并用小鼠抗PCV3-Cap抗体进行Western blot检测.[结果]用pET-32a原核表达系统成功表达出重组PCV3-Cap融合蛋白,其多以包涵体形式存在,纯化后的融合蛋白能与小鼠抗PCV3-Cap血清发生特异性结合,显示出良好的免疫反应性.[结论]原核表达出具有良好免疫反应性的PCV3 Cap. 相似文献
12.
为了获得非洲猪瘟(african swine fever virus, ASFV)p62蛋白进行血清学诊断技术研究。根据GenBank ASFV参考序列合成CP530R基因(编码p62蛋白),插入pET-32a(+)载体,转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,SDS-PAGE及Western blot鉴定。采用Ni柱纯化p62蛋白,然后免疫Balb/c雌鼠,制备鼠抗ASFV p62蛋白的多克隆抗体,ELISA检测多抗效价。结果表明,成功构建了pET32a-p62质粒,表达蛋白为56.1 kDa,以包涵体表达为主。Western blot显示该蛋白能与ASFV阳性血清结合。Ni柱纯化获得p62蛋白浓度为2.9 mg/mL。用该蛋白免疫小鼠,三免后抗体效价达1∶256 000。表明表达蛋白具有良好抗原性,制备的p62多克隆抗体具有较高的反应性和特异性,为进一步研究p62蛋白的特性和诊断奠定基础。 相似文献
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【目的】构建拟南芥转录因子Dof1基因的原核表达载体,进行原核表达并制备其蛋白抗体。【方法】利用RT-PCR方法从拟南芥中克隆转录因子Dof1基因,将其连接到原核表达载体pET-32a(+)上,构建重组原核表达载体pET32a(+)-Dof1,经酶切鉴定和测序验证后将其转化至大肠杆菌BL21中,经IPTG诱导后,纯化重组蛋白,以分离到的重组蛋白为抗原免疫小鼠制备抗血清,检测植物中Dof1蛋白表达水平。【结果】成功构建了拟南芥转录因子Dof1基因的原核表达载体pET32a(+)-Dof1,在28℃、1mmol/L IPTG诱导6h的大肠杆菌中可高效表达分子质量约为42ku的重组蛋白,其分泌到细胞质中,不形成包涵体;Western-blotting检测结果证明,制备的抗血清有较好的抗原-抗体识别反应。【结论】成功实现了Dof1基因的原核表达,制备出的重组蛋白Dof1多克隆抗体可用于植物Dof蛋白表达水平的检测,可为Dof1基因的进一步研究奠定基础。 相似文献
15.
探索优化并构建S100A16原核表达载体、制备S100A16蛋白多克隆抗体的条件。试验方法为,将RT－PCR扩增得到的小鼠肝脏组织的S100A16基因克隆片段连接到带有His标签的原核表达载体pET－28a多克隆位点,并转化大肠杆菌BL21（DE3）,用不同温度、不同浓度IPTG（异丙基－β－D－硫代半乳糖苷）诱导融合蛋白表达,通过亲和层析柱纯化获得纯化的蛋白质。经免疫动物得到His－S100A16抗血清,通过免疫亲和层析获得了具有高度特异性抗体,通过Western Blot和Elisa检测抗体的特异性和效价,结果表明,在温度25℃、IPTG浓度为0．2 mmol／L的条件下,可溶性蛋白的表达效果较好。 相似文献
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β2微球蛋白(β2m)是主要组织相容性复合体(MHC)-Ⅰ类分子的轻链部分,该蛋白的原核表达与纯化是制备MHC-Ⅰ类分子的首要条件。利用已经构建好的β2m原核表达载体pET 23a+β2m,在大肠杆菌(E.coli)中获得稳定表达。原核表达的β2m大部分在包涵体中,包涵体蛋白经充分洗涤、变性(尿素溶解)和复性,并以强阴离子交换柱层析(Q-Sepharose)纯化,获得SDS-PAGE纯的人重组β2m,W estern印迹法分析表明,该蛋白具有与抗人天然β2m抗体反应的特性。 相似文献
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应用RT-PCR方法扩增鹅源星状病毒(goose astrovirus,GoAstV)HLJ01株的ORF2基因,将扩增产物克隆至pET32a原核表达载体,并在大肠埃希菌BL21进行表达。通过SDS-PAGE分析表明,重组菌诱导后得到大小约为106 ku的ORF2蛋白,与理论值相符。将诱导表达的蛋白经镍亲和层析柱纯化后免疫小鼠制备多克隆抗体,并测定其抗体效价。Western-blotting结果显示,ORF2蛋白可被鼠抗GoAstV阳性血清识别。序列分析表明,该毒株与其他鹅源星状病毒参考毒株的核苷酸相似性介于37.8%~99.3%之间,HLJ-1801分离株与已发表的8株鹅源星状病毒毒株位于同一分支,表明其属于一种新型星状病毒成员。利用原核表达系统成功高效地表达了GoAstV ORF2蛋白,融合蛋白以包涵体形式存在。本试验成功获得了纯化的ORF2重组蛋白和小鼠抗GoAstV多克隆抗体,为进一步研究ORF2蛋白对星状病毒感染的诊断试剂的研发奠定了基础。 相似文献
18.
pMAL-p2X系统表达番鸭呼肠孤病毒MW9710株σC蛋白 总被引：1，自引：1，他引：0
根据Genbank中MDRV 89026毒株S4基因序列设计引物,通过RT—PCR获得番鸭呼肠孤病毒MW9710株σC蛋白基因,将此σC蛋白基因插入原核表达载体pMAL-p2X中,得到重组表达质粒（pMAL—p2X—σC）并转化大肠杆菌BL21（DE3）中,经IPTG诱导后能高效表达,SDS-PAGE和Western-blot检测结果发现表达的σC蛋白分子质量约为72kDa,并以可溶性蛋白和包涵体2种形式同时存在,且具有良好的反应原性。原核表达的可溶性σC蛋白为进一步开展抗原表位和诊断试剂盒研究奠定了基础。 相似文献
19.
《西南农业学报》2021,(9)
【目的】原核表达非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)次要衣壳五邻体顶点蛋白(H240R),并研究其免疫原性。【方法】运用生物信息学软件初步预测分析H240R蛋白的理化性质、二级和三级结构。目的基因序列密码子优化后全基因合成,利用基因重组技术构建重组载体pET28a/H,通过原核系统表达目的蛋白,筛选最优的诱导温度和诱导时间。目的蛋白(包涵体)通过含2M尿素洗涤缓冲液洗涤和亲和层析进行纯化。利用梯度透析对纯化的目的蛋白进行复性,Western和Dot-ELISA鉴定复性的目的蛋白。复性蛋白和佐剂ISA201乳化后免疫小鼠,评价H240R蛋白免疫原性及其在小鼠体内诱导的抗体消长规律。【结果】生物信息学分析显示H240R蛋白分子量约为27 kDa,等电点为9.40,无跨膜结构域,抗原指数较高。成功构建大肠杆菌工程菌株BL21(DE3)/pET28a/H,在不同温度诱导条件下H240R蛋白均以包涵体形式表达。包涵体蛋白经过洗涤和亲和层析纯化后,纯度达85%以上。大约65%纯化蛋白可通过梯度透析进行复性。Western显示His抗体可以和融合蛋白结合显色,表明目的蛋白表达正确,Dot-ELISA显示阳性血清和复性的目的蛋白反应,表明复性的H240R蛋白具有正确的构象。复性蛋白免疫小鼠后,可刺激小鼠产生抗体,二免后10 d达到平台期,可以稳定持续30 d左右。【结论】ASFV衣壳五邻体顶点蛋白H240R在原核系统中以包涵体形式表达,纯化复性的目的蛋白具有良好的免疫原性,并且可以和阳性血清反应。这些可为进一步研究H240R蛋白的结构和功能,以及ASFV亚单位疫苗研制提供参考和思路。 相似文献
20.
根据GenBank公布的日本脑炎病毒 (Japaneseencephalitisvirus ,JEV)SA14 14 2减毒株的核苷酸序列 ,设计并合成一对特异性引物 ,应用RT PCR方法扩增出编码JEV囊膜蛋白抗原域Ⅲ的基因 (EⅢ) ,将其连接入pMD18 T载体 ,经测序后克隆入原核表达载体pET 32a (+) ,构建原核表达载体pET EⅢ 。阳性质粒转化感受态大肠杆菌BL2 1(DE3) ,经IPTG诱导 ,JEV EⅢ 基因获得表达 ,经细胞定位分析 ,目的蛋白以包涵体的形式存在于大肠杆菌中。通过改变IPTG的浓度和诱导时间 ,确定了表达EⅢ 蛋白的最佳诱导条件 :IPTG终浓度为 0 1mmol·L-1,诱导时间为 3h。在大肠杆菌中的最高表达量占菌体总蛋白的 5 4 9%。Western blot分析表明表达产物具有良好的免疫学活性。利用纯化的表达产物作抗原包被酶标板 ,可以明显地区分JEV阴、阳性血清 ,并且不与猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒、猪呼吸与繁殖障碍综合征病毒、猪细小病毒、猪瘟病毒的阳性血清发生反应。结论 :重组JEVEⅢ 蛋白可以用于检测猪血清中JEV抗体水平。 相似文献