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1.
【目的】对柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)杨凌株RB1-a基因进行克隆与表达,检测表达产物的免疫保护性,为鸡球虫基因工程疫苗的研制奠定基础。【方法】以纯化的E.tenella杨凌株孢子化卵囊的总RNA为模板,用RT-PCR方法扩增出其RB1-a基因,测序后进行序列分析。然后将RB1-a基因N端不含信号肽序列克隆到表达载体pET-32a(+)中,构建pET-32a-RB1-a重组质粒,并在大肠埃希菌BL21(DE3)中诱导表达出重组蛋白,将重组蛋白纯化后免疫雏鸡,对其免疫效果进行评价。【结果】柔嫩艾美耳球虫杨凌株RB1-a基因的开放阅读框(ORF)包含618个碱基,编码205个氨基酸,与GenBank报道的柔嫩艾美耳球虫PAPa46株ORF序列相似性为99.84%,两者推导的氨基酸序列相同。SDS-PAGE分析表明,重组质粒表达分子质量为42ku的融合蛋白。免疫效果测定结果显示,RB1-a免疫组和RB1-a+佐剂免疫组的相对增重率分别为64.2%和69.4%,卵囊减少率分别达37.22%和30.56%,抗球虫指数分别为146.2和150.4。【结论】RB1-a基因具有很强的保守性,种间差异不大;RB1-a重组蛋白具有一定的免疫保护效果。 相似文献
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柔嫩艾美耳球虫YZ株SO7基因的克隆与序列分析 总被引：2，自引：0，他引：2
对柔嫩艾美耳球虫(E im eria tenella)YZ株折光体SO 7基因进行克隆,并对其核苷酸及氨基酸进行序列分析。以纯化的发育7 h的E.tenella YZ株卵囊孢子提取的总RNA为模板,设计特异性引物,应用两步法RT-PCR技术扩增出SO 7基因特异性片段。将扩增出的片段插入pUCm-T载体,随机选择经蓝白斑筛选、PCR及酶切鉴定为阳性的两个克隆分别进行测序分析,并对结果进行验证。结果表明:两个阳性克隆所含插入片段的DNA序列完全一致,含全长为651个核苷酸的开放阅读框,富含AGC和CTG重复序列,编码区核苷酸与LS18株和B J株的同源性都为99.5%,与HB株同源性为99.4%,与GD株同源性为99.7%。其推测的氨基酸序列与LS18株和GD株的同源性都为99.1%,与B J和HB株同源性为98.6%。通过对其蛋白抗原性、表面可能性、亲水性、柔性区、二级结构等参数预测表明,YZ株核苷酸的变异未引起其蛋白主要特性和B细胞表位的变化。该结果为研制E.tenella的基因工程疫苗奠定了基础。 相似文献
3.
【目的】探讨原核表达的柔嫩艾美耳球虫杨凌株3-1E蛋白的生物学活性。【方法】将含有3-1E基因的pGEX-3-1E重组质粒转化大肠杆菌BL21,进行表达并对表达条件进行优化,表达产物纯化后进行Western-blot-ting分析。【结果】表达的3-1E重组蛋白相对分子质量为44.7 ku,与推导结果一致。在28℃、IPTG诱导浓度为0.5mmol/L的条件下诱导6 h,可溶性3-1E重组蛋白表达量最高。Western-blotting结果表明,3-1E重组蛋白可与兔抗鸡E.tenellaYL阳性血清发生反应。【结论】3-1E重组蛋白表达成功,表达产物具有免疫原性。 相似文献
4.
根据GenBank发表的鸡柔嫩艾美耳球虫(Ei meriatenella)3-1E基因的ORF设计一对引物,用RT-PCR方法从E.tenella杨陵(YL)株总RNA中扩增3-1E基因,并将扩增产物与pMD18-T easy载体进行连接并测序,用DNAstar 5.0软件对测序结果进行分析。结果表明,2009年分离的E.tenellaYL株3-1E基因与其他虫株相比,核苷酸有9个位点发生变化,其中7个位点的变化引起了相应氨基酸位点的改变,其他2个位点的变化未引起氨基酸的改变。对2006年和2009年分离的YL株3-1E基因的核苷酸进行了比对,结果发现,有两个核苷酸位点发生了变化。系统发育树分析表明,E.tenellaYL株3-1E基因同种间与E.tenella甘肃株遗传关系最近,同属间与E.acervulina法国株遗传关系最近。 相似文献
5.
[目的]构建含鸡柔嫩艾美耳球虫3-1E和CDPK抗原基因及鸡IFN-γ基因的三价DNA疫苗。[方法]应用SOE-PCR将3-1E、CD-PK和鸡IFN-γ共3个基因通过2个（GGGGS）3连接子相连,扩增出IFN-γ/3-1E/CDPK三价融合基因,将其克隆入真核表达载体proVAX中构建三价融合真核表达质粒proIEC,后用双酶切和PCR进行鉴定。阳性重组质粒提取纯化后体外转染PK-15细胞,通过间接免疫荧光技术检测目的基因在转染细胞中的表达情况。[结果]经双酶切和PCR鉴定证实鸡柔嫩艾美耳球虫三价DNA疫苗构建成功,且在PK-15细胞中获得了成功表达。[结论]鸡柔嫩艾美耳球虫IFN-γ/3-1E/CDPK三价DNA疫苗构建成功,为进一步探讨其免疫保护性奠定了基础。 相似文献
6.
以5株堆型艾美耳球虫为研究对象,对其顶质体rpoB基因的部分序列进行了PCR扩增、测序及序列分析,并与GenBank上发表的柔嫩艾美耳球虫及其他顶复门寄生虫相关序列进行比较,研究顶质体的遗传变异情况。结果表明,从堆型艾美耳球虫不同来源虫株均获得了469bp的目的片段,应用DNAStar软件进行序列对比发现,5株堆型艾美耳球虫的顶质体rpoB序列完全一致,与柔嫩艾美耳球虫相应序列的相似性为92.75%,而与刚地弓形虫和疟原虫的相似性分别为67.23%和64.62%。首次报道了堆型艾美耳球虫rpoB序列,显示rpoB基因序列保守,不同来源堆型艾美耳球虫虫株的序列没有差异,为进一步研究艾美耳球虫的群体遗传学奠定了基础。 相似文献
7.
探索CMV启动子与艾美耳球虫基因侧翼序列对串联型黄色荧光蛋白(YFP)表达的调控作用,将含有串联型YFP、CMV启动子、柔嫩艾美耳球虫组蛋白4(Histone4)上游启动序列和肌动蛋白(Actin)下游调控序列的重组载体pCMV-YFP-YFP、pH4-YFP-YFP-ACT电转染Vero细胞和柔嫩艾美耳球虫子孢子,观察荧光情况.结果证明,CMV启动子不能驱动YFP在柔嫩艾美耳球虫中正常表达,而其自身基因的侧翼序列能够启动和调控串联型YFP在柔嫩艾美耳球虫中的正常表达. 相似文献
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为了解安徽省部分地区鸡球虫种类及感染情况,采用群体采样法分别从肥西县、长丰县和凤台县采集鸡新鲜粪样,用饱和盐水漂浮法检查。阳性粪样采用饱和盐水漂浮和离心沉淀法进行卵囊分离。显微镜下观察卵囊进行虫种鉴定,并统计各调查点的鸡球虫感染率和感染强度等。结果表明,鸡球虫感染率为93.3%(84/90);共检获7种球虫,即:柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)、巨型艾美耳球虫(E.maxima)、堆型艾美耳球虫(E.acervulina)、毒害艾美耳球虫(E.necatrix)、布氏艾美耳球虫(E.brunetti)、和缓艾美耳球虫(E.mitis)、早熟艾美耳球虫(E.prae-cox)。 相似文献
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柔嫩艾美球虫SO7重组蛋白对巨型艾美球虫的免疫保护作用 总被引：1，自引：1，他引：0
将大肠杆菌中融合表达的柔嫩艾美球虫(Eimeria tenella)SO7重组蛋白,单独或以鸡重组γ-干扰素为佐剂,于5、12、19日龄对雏鸡进行3次免疫,同时设立E.tenella、巨型艾美球虫(E.maxima)口服卵囊免疫组、未免疫、未攻毒组和未免疫攻毒组作对照,于26日龄用E maxima进行攻毒,9 d后统计各组的相对增重率和卵囊减少率,探讨其对E.maxima的交叉保护作用.结果表明:重组蛋白免疫对增重的改善效果与E.maxima口服卵囊免疫组相差不大,γ-干扰素佐剂效应不明显.从卵囊减少率指标角度判断,口服卵囊免疫组效果最佳,为96.35%,重组蛋白免疫组为12.51%,γ-干扰素佐剂组为35.75%.重组SO7蛋白对E.maxima具有一定的交义免疫保护作用,γ-干扰素对SO7抗原的免疫保护效果具有一定的增强作用. 相似文献
10.
为研究柔嫩艾美耳球虫不同地理株的线粒体细胞色素c氧化酶第1亚基(cox1)基因与球虫种群之间的遗传关系,以安徽3个地区的3株柔嫩艾美耳球虫为研究对象,通过卵囊的分离与纯化获得纯种虫株,然后应用PCR技术对柔嫩艾美球虫3个地理株的cox1序列进行扩增,并与GenBank上登录的鸡柔嫩艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫、布氏艾美耳球虫和堆形艾美耳球虫虫株的相应序列进行比对分析。结果显示,每个虫株都成功扩增出800 bp左右的cox1部分有效序列(pcox1),与柔嫩艾美耳球虫pcox1序列种内无差异,pcox1相应序列种间的差异程度为9.9%～14.9%。表明柔嫩艾美耳球虫的cox1序列可作为艾美耳球虫种间遗传变异研究的标记,为进一步研究艾美耳球虫的群体遗传学特性和耐药性奠定了基础。 相似文献
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【目的】探究高温和外源脱落酸对桂花Osmanthus fragrans类胡萝卜素生物合成的3个相关基因,包括八氢番茄红素合成酶基因(PSY)、八氢番茄红素脱氢酶基因(PDS)、β-胡萝卜素羟化酶基因(HYB)的调控作用,为阐释桂花类胡萝卜素代谢调控的机制提供研究基础。【方法】根据桂花基因组数据库的序列,从桂花品种‘堰虹桂’‘Yanhong Gui’中克隆OfPSY、OfPDS、OfHYB基因的启动子序列,并进行生物信息学分析,再构建PCAMBIA3301-LUC载体在烟草Nicotiana benthamiana中瞬时表达,结合高温(37℃)和200 mg·L-1脱落酸处理,分析启动子活性。【结果】获得OfPSY、OfPDS、OfHYB基因的部分启动子,其长度分别为1 908、1 521及1 830 bp。作用元件分析表明：3个启动子中均存在TATA-box和CAAT-box等启动子基本元件、光响应元件、脱落酸响应元件以及MYB和MYC结合位点。此外,在OfPSY启动子中,存在赤霉素响应元件;在OfPDS启动子中,存在茉莉酸甲酯响应元件、赤霉素响应元件、厌氧诱导型... 相似文献
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为探讨TPH1和TPH2基因在绵羊不同繁殖状态下的表达差异及TPH2基因多态性与小尾寒羊产羔数的关系,利用实时荧光定量PCR技术检测该2个基因在不同繁殖状态下成年苏尼特羊(短光照3只,长光照3只)和小尾寒羊(卵泡期3只,黄体期3只)的大脑、小脑、下丘脑、松果体、垂体、卵巢、输卵管、子宫、肾脏和肾上腺等10种组织中的相对表达量;同时采用Sequenom MassARRAY?SNP技术检测TPH2基因单核苷酸多态位点SNP在常年发情绵羊品种(小尾寒羊、湖羊和策勒黑羊)和季节性发情绵羊品种(滩羊、苏尼特羊和草原型藏羊)的多态性,并将基因多态性与小尾寒羊产羔数进行关联分析。结果表明:该2个基因在2个绵羊品种各组织广泛表达,TPH1基因在苏尼特羊下丘脑和松果体中短光照表达量极显著高于长光照(P0.01),在苏尼特羊垂体中短光照表达量显著高于长光照(P0.05),在小尾寒羊垂体和卵巢中卵泡期显著低于黄体期(P0.05);TPH2基因在苏尼特羊卵巢组织长光照下的表达量显著高于短光照(P0.05),TPH2基因在小尾寒羊下丘脑组织中卵泡期的表达量极显著高于黄体期(P0.01)。小尾寒羊中TPH2基因g.107854166CT和g.1078541669CT 2个SNP位点关联分析表明,该2个位点与季节性发情性状和小尾寒羊第1、2以及第3胎产羔数均无显著关联(P0.05)。综上,TPH1和TPH2基因在苏尼特羊绵羊下丘脑和松果体中呈季节性光照节律差异表达,暗示其可能参与季节性发情上游基因的调控,而TPH2基因可能参与调控小尾寒羊下丘脑中激素分泌和卵巢发育,但g.107854166CT和g.1078541669CT不是调控季节性发情和小尾寒羊产羔数的关键位点。 相似文献
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为了探讨金黄色葡萄球菌的氟喹诺酮耐药性与grlA、grlB基因突变的关系,从52株野生型金黄色葡萄球菌中筛选出1株对氟喹诺酮敏感的金黄色葡萄球菌,对其进行耐药诱导,获得一系列不同氟喹诺酮耐药水平的金黄色葡萄球菌,并对其grlA、grlB基因进行PCR扩增、测序及序列分析。结果表明,金黄色葡萄球菌的氟喹诺酮耐药性与grlB基因突变无关,而与grlA的丝氨酸(Ser)80→苯丙氨酸(Phe)和谷氨酸(Glu)84→赖氨酸(Lys)突变密切相关。金黄色葡萄球菌grlA的80位氨基酸和84位氨基酸双突变是其氟喹诺酮耐药性提高的标志之一。 相似文献
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【目的】克隆苹果GDP-甘露糖焦磷酸化酶(GDP-mannose pyrophosphorylase,GMP)、GDP-甘露糖-3′,5′-表异构酶(GDP-mannose-3′,5′-epimerase,GME)和GDP-1-半乳糖磷酸酶(GDP-L-galactose-1-phosphate phosphorylase,GGP)的基因序列并分析其表达特性,探讨GMP、GME和GGP基因在抗坏血酸(Ascorbic acid,AsA)合成过程中的作用。【方法】以‘嘎啦’苹果幼果为材料,分别运用RT-PCR和PCR法克隆GMP、GME和GGP基因的cDNA和gDNA全长序列,对其序列及编码产物进行生物信息学分析,并采用实时荧光定量PCR,分析以上基因在苹果不同组织(幼叶、成熟叶、衰老叶、花、幼果、成熟果和根)中的表达情况。【结果】RT-PCR法克隆及序列分析显示,GMP基因的cDNA全长为1 280bp,编码361个氨基酸,gDNA序列中含有3个内含子;GME基因的cDNA全长为1 323bp,编码376个氨基酸,gDNA序列中含有5个内含子;GGP基因的cDNA全长为1 677bp,编码446个氨基酸,gDNA序列中含有6个内含子。基因表达的实时荧光定量PCR分析表明,GMP、GME和GGP在苹果不同组织中均有表达,在叶片中的表达量高于其他组织,且表达量随着叶片的生长逐渐升高;在花、幼果和成熟果中,GMP、GME和GGP的表达量差异不明显。【结论】克隆获得了苹果的GMP、GME和GGP基因,其在苹果不同组织的生长过程中有不同的表达特性,但GME的表达水平远远低于GMP和GGP,这在一定程度上表明,在苹果AsA的生物合成过程中,GMP、GGP较GME有更重要的作用。 相似文献
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花生Arachis hypogaea油酸脱氢酶AhFAD2是调控花生种子中油酸与亚油酸比值（oleic acid/linoleic acid,O/L）的关键酶,已确定存在2个编码AhFAD2的基因:AhFAD2A和AhFAD2B,但两者在花生中的时空表达特征尚不清楚。选取2个有代表性O/L的花生品种‘山花15’‘Shanhua 15’（O/L为1）和高油酸花生突变体（O/L大于20）为材料,根据AhFAD2A和AhFAD2B基因3'-UTR核苷酸序列的差异,设计了新型、简便的区分两者的特异性引物,并利用实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）技术,对2个花生品种的7个不同组织（根,茎,叶,花,开花后20,40,60 d种子）中AhFAD2A和AhFAD2B的表达特征进行了分析。结果表明:AhFAD2A和AhFAD2B在‘山花15’和高油酸花生突变体7个组织中都有表达;其中,在2个花生品种3个不同发育时期的种子中,AhFAD2A和AhFAD2B在开花后40 d的种子中表达量最高,推测在开花至花后40 d这一阶段种子中FAD2的表达量可能对花生最终O/L起主要的调控作用。另外,‘山花15’种子中AhFAD2B的表达量显著高于AhFAD2A,而在高油酸花生突变体种子中则相反,推测花生中AhFAD2B在催化油酸去饱和生成亚油酸的过程中比AhFAD2A可能起更重要的调控作用。 相似文献
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【目的】研究兰州百合及有斑百合的染色体核型。【方法】利用染色体常规压片的方法,对兰州百合和有斑百合的染色体数目及核型进行了研究和分析。【结果】兰州百合的核型公式为2n=2x=24=2m+2sm+6st+14t,相对长度为6.35%～12.07%,核型不对称系数为83.25%,染色体相对差异较大。有斑百合的核型公式为2n=2x=24=4m+12st+8t,相对长度为6.11%～12.90%,核型不对称系数为80.11%。【结论】兰州百合的核型类型属于3A型,有斑百合的核型类型为3B型,以有斑百合核型的进化较高,可见不同居群的百合间核型存在差异。 相似文献
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【目的】研究猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)HN-2012株ORF3a和ORF3b基因的遗传变异情况。【方法】根据GenBank公布的猪传染性胃肠炎病毒ORF3a和ORF3b基因序列,分别设计合成1对特异性引物,通过RTPCR从猪传染性胃肠炎病毒HN-2012株的cDNA中扩增ORF3a和ORF3b基因,经克隆测序后,将其基因序列与NCBI中不同来源的TGEV毒株的相应序列进行同源性分析,构建系统进化树并进行遗传变异分析,然后将ORF3a和ORF3b基因亚克隆至真核表达载体,构建pCAGGS-ORF3a-flag和pCAGGS-ORF3b-flag载体,转染293T细胞进行表达,利用flag标签抗体对2个基因的蛋白表达情况进行Western blot分析。【结果】TGEV HN-2012株的ORF3a基因与其他毒株间核苷酸的同源性为92.6%~100%,ORF3b基因与其他毒株间核苷酸的同源性为98.6%~99.7%。Western blot结果表明,ORF3a蛋白和ORF3b蛋白的分子质量约为8ku和28ku。【结论】TGEV HN-2012株的ORF3a基因与CH/JLY2/08、CH/HLJH/08株等亲缘关系较近,ORF3b基因与TS株、Miller M6株等亲缘关系较近,与我国其他毒株关系较远;成功实现了ORF3a和ORF3b蛋白在293T细胞中的表达。 相似文献
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c-myc和c-fos在隆肛蛙与北方山溪鲵卵巢中的表达 总被引：1，自引：0，他引：1
用免疫细胞化学方法,对隆肛蛙与北方山溪鲵不同发育时期卵泡c- myc和c- fos的表达产物进行了定位检测。结果表明,Myc在2种动物 - 期卵母细胞和滤泡细胞中表达较强,以后逐渐减弱;Fos在2种动物卵泡发育初期表达很弱,在 - 期卵泡中表达增强。上述结果说明,c- myc在2种动物卵母细胞发育初期起重要作用,而c- fos在发育中后期起重要的调控作用,2种原癌基因可能通过调节类固醇激素的合成与分泌来调控卵母细胞的发育。 相似文献