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1.
PCR检测鸡减蛋综合征病毒 总被引：3，自引：0，他引：3
根据已报道的鸡减蛋综合征（ＥＤＳ－７６）病毒ＤＮＡ序列，设计合成了１对引物，建立了ＥＤＳ－７６病毒的双温式聚合酶链反应（ＰＣＲ）诊断方法。该方法对ＥＤＳ－７６病毒长春株、河南株和广东株扩增结果均为阳性；而对致死鸡胚孤儿病毒（ＣＥＬＯＶ）、鸡病毒性关节炎病毒（ＶＡＶ）、鸡传染性支气管炎病毒（ＩＢＶ）、鸡传染性法氏囊病病毒（ＩＢＤＶ）和鸡新城疫病毒（ＮＤＶ）的扩增结果均为阴性。可检测ＥＤＳ－７６病毒ＤＮＡ为０．３×１０－４ｐｇ。结果表明该方法特异且敏感。此外，将常规的三温式ＰＣＲ的操作规程改为双温式，反应体积由常规５０～１００μＬ改为２０μＬ，使其更加快速、简便、经济 相似文献
2.
为了建立一种监测鸡群马立克氏病病毒（ＭＤＶ）早期感染的微量ＰＣＲ方法,根据血清Ⅰ型马立克氏病病毒（ＭＤＶ１）基因组ＢａｍＨＩ－Ｌ片段的核酸序列设计了１对寡核苷酸引物,用含０．３ＵＴａｑ酶的１０μＬ反应体系分别扩增了ＭＤＶ１型（京－１株、ＭＤ１１／７５ｃ株）、ＭＤＶ２型（ＳＢ－１株）和ＨＶＴ（ＦＣ－１２６株）的核酸,并用京－１株感染细胞ＤＮＡ作了敏感性试验。结果显示,该引物对ＭＤＶ１型病毒特异,京－１株和ＭＤ１１／７５ｃ株都扩增到４２５ｂｐ的核酸条带,而ＳＢ－１株、ＦＣ－１２６株和正常ＣＥＦ细胞的ＤＮＡ都没有得到任何条带;敏感性试验结果表明,微量ＰＣＲ能够检测到０．１ｐｇ的京－１株感染细胞ＤＮＡ;对京－１株感染鸡,在接种后第５天就能在血液细胞中检测到ＭＤＶＤＮＡ。微量ＰＣＲ可望成为监测鸡群ＭＤＶ早期感染的一种快速、有效的方法。 相似文献
3.
采用腹腔的接种１次脾内注射禽呼肠孤病毒（ＡＲＶ）蛋白免疫小鼠，经３次融合后，共筛选８株分泌抗禽呼肠孤病毒（单克隆抗体杂交瘤细胞株，这８株ＭｃＡｂ均可与ＡＲＶＳ１１３３株，ＦＤＯ株发生反应，而与ＩＢＤＶ，ＭＤＶ，ＥＤＳ－７６病毒不发生反应，经亚类鉴定，ＡＥ７，ＡＦ８，ＢＤ１，ＤＨ１０，ＥＥ５为ＩｇＧ１；ＡＤ６，ＣＧ４为ＩｇＣ２ａ，ＡＧ７为ＩｇＧ２ｂ。腹水效价在１０＾３～１０＾５之间。 相似文献
4.
马立克氏病病毒（MDV）糖蛋白D基因的分离克隆,定序及其在大肠杆… 总被引：1，自引：0，他引：1
用聚合酶链式反应（ＰＣＲ）技术，从马立克氏病病毒（ＭＤＶ）ＧＡ株感染的鸡胚成纤维细胞（ＣＥＦ）基因组ＤＮＡ中扩增出ＭＤＶ糖蛋白（ｇＤ）抗原基因１２０９ｂｐ编码序列。将该ＰＣＲ扩增产物于ＥｃｏＲＩ和ＫｐｎⅠ位点克隆进行ｐＵＣ１８质粒载体中。将ｇＤ重组ｐＵＣ１８质粒ＤＮＡ用Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ（Ｄｉｇ）标记后，在Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ中，该探针能识别ＭＤＶ基因组ＤＮＡ的Ｂａｍ ＨＩ－Ａ克隆中的Ａ 相似文献
5.
从疑似IBD病鸡的法氏囊组织中分离到1株ARV 总被引：5，自引：2，他引：3
从暴发类似传染性法氏囊病（ＩＢＤ）的江苏省某鸡场采集病鸡法氏囊组织制成组织悬液，接种鸡胚卵黄囊，部分鸡胚３～５ｄ死亡，部分鸡胚不死亡但有病变。用感染胚卵黄囊和绒尿膜混合物，接种鸡胚成纤维细胞（ＣＥＦ），盲传３代后，发现以合胞体为特征的细胞病变（ＣＰＥ）。感染细胞做超薄切片电镜观察，可见细胞浆内病毒粒子呈整齐的晶格状排列。用免疫沉淀法提取病毒抽提核酸，经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳，可见规律排列的１０条带，呈３－３－１－３排列。与禽呼肠孤病毒（ＡＲＶ）参考毒株Ｓ１１３３株的核酸谱带的数目和位置相同。血清学试验与ＡＲＶ呈阳性反应，与传染性法氏囊病病毒（ＩＢＤＶ）呈阴性反应。证明分离病毒为ＡＲＶ 相似文献
6.
鸡贫血病毒DNA的PCR扩增及其分子克隆 总被引：4，自引：0，他引：4
用ＰＣＲ方法扩增了国内分离的鸡贫血病毒（ＣＡＶ）ＳＪ１株的含ＶＰ２、ＶＰ３以及部分ＶＰ１的１５００ｂｐＤＮＡ片段。经限制性内切酶酶切分析，该片段与Ｃｕｘ－１株的酶谱相似。同时，以ｐＵＣ１１９质粒载体克隆了这一ＤＮＡ片段。 相似文献
7.
PCR结合分子杂交法检测鸡传染性支气管炎病毒 总被引：6，自引：2，他引：4
利用逆转录－ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）特异性扩增鸡传染性支气管炎病毒（ＩＢＶ）基因组中Ｍ基因和Ｎ基因之间一段核酸片段。以ｐＵＣ１９质粒载体将此片段克隆，用ＥｃｏＲＩ和ＨｉｎｄⅢ酶切此重组质粒，回收克隆片段后，制成生物素标记的核酸探针。用ＲＴ－ＰＣＲ及生物素核酸探针法分别对ＩＢＶ，ＩＢＤＶ，ＩＬＴＶ，ＭＤＶ及ＮＤＶ进行检测，结果证明该方法为ＩＢＶ特异性检测方法。对人工感染ＩＢＶ的ＳＰＦ鸡口腔棉拭样品进行跟踪检测，证明本方法能在ＳＰＦ鸡接毒后１～１０ｄ内检出ＩＢＶ。 相似文献
8.
禽呼肠孤病毒S1基因的扩增克隆与鉴定 总被引：14，自引：4，他引：10
利用反转录－聚合酶链（ＲＴ－ＰＣＲ）技术,扩增出禽呼肠孤病毒（ＡＲＶ）Ｓ１１３３、１７３３长为５４０ｂｐ的Ｓ１基因片段。将扩增到的２个毒株的Ｓ１基因通过粘端连接分别克隆到ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔⅡＫＳ＋质粒中,用ＰＣＲ和限制性内切酶分析鉴定,表明获得２种重组质粒ＡＲＶ Ｓ１１３３ Ｓ１－ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ＡＰＶ １７３３ Ｓ１－ｐＢｌｕｅｓｃｒｐｔ。 相似文献
9.
应用鸡病毒性关节炎病毒Ｕ．ＣｏｎｎＳ１１３３株，建立了检测鸡病毒性关节炎病毒抗原的双抗体夹心ＥＬＩＳＡ法。用该法检测三组接毒鸡的关节液，接毒后３天即可检出阳性，阳性率为５８．３％；发病严重的４～１１天阳性检出率达９５７％，１４天阳性率为５０％；１７天阳性率为３１．３％；２０天以后则全部为阴性。用该法对大肠杆菌（Ｅ．ＣｏＬｉ）、葡萄球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、败血支原体（ＭＧ）、滑膜支原体（ＭＳ）、新城疫病毒（ＮＤＶ）、传染性支气管炎病毒（ＩＢＶ）、传染性脑脊髓炎病毒（ＡＥＶ）进行检测，结果均为阴性。试验表明，我们建立的双抗体夹心ＥＬＩＳＡ法，能早期、特异、敏感地检出鸡病毒性关节炎病毒抗原，从而解决了对该病早期诊断及类症鉴别带来的困难。 相似文献
10.
新城疫病毒融合蛋白裂解位点基因的分离克隆及在原核细胞中的… 总被引：8，自引：4，他引：4
用ＳＰＦ鸡胚繁殖新城疫病毒（ＮＤＶ）Ｆ４６Ｅ９株（强毒）、ＬａＳｏｔａＥ４株（弱毒）、对病毒进行纯一提ＲＮＡ。用１对均为２７个碱基的引物进行ＲＴ－ＰＣＲ，扩增出了２个毒株的融合蛋白裂解位点（Ｆｃ）基因。将Ｆｃ基因定向克隆人ｐＵＣＬａＦｃ，用ＥｃｏＲＩ／Ｓａｌ Ｉ双酶切法、ＰｓｔＩ单酶切法、ＰＣＲ法和核酸探针法对其进行了鉴定。将鉴定好的ＬａＳｏｔａＥ４Ｆｃ基因定向导入表达载体质粒ｐＢＶ２２１，ａｑｔ 相似文献
11.
马传染性贫血病毒弱毒株LTR的克隆及序列分析 总被引：9，自引：0，他引：9
从马传染性贫血病毒（ＥＩＡＶ）弱毒株感染的驴胎皮肤（ＦＤＤ）细胞中提取前病毒ＤＮＡ，以其为模板，通过ＰＣＲ扩增出ＥＩＡＶ弱毒株的ＬＴＲ，并将其克隆到载体质粒ｐＵＣ１９中。经酶切分析，ＰＣＲ及Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交筛选、鉴定，获得含有ＥＩＡＶ弱毒株ＬＴＲ片段的重组质粒ｐＬＴＲ。对该质粒的序列分析发现，在中国ＥＩＡＶ弱毒株ＬＴＲ的Ｕ３区含有４个与细胞转录因子结合的位点，其中有３个ＰＵ．１位点和１个ＡＰ－１位点，Ｕ３区还存在１个ＴＡＴＡＴＡＡ启动子序列；Ｒ区长为８１ｂｐ，含有１个帽位点ＧＧ和１个Ｐｏｌｙ（Ａ）信号序列ＡＡＴＡＡＡ；在帽位点下游是１个病毒Ｔａｔ蛋白结合位点，即ＴＡＲ位点；Ｕ５区长为３９ｂｐ。中国ＥＩＡＶ弱毒株ＬＴＲ序列与国外发表的其他毒株序列相比，在ＬＴＲ的一些调控部位有变异发生，中国ＥＩＡＶ弱毒株与美国ＥＩＡＶ原型株（Ｗｙｏｍｉｎｇ株）ＬＴＲ区核苷酸序列有１８．７２％的差异。 相似文献
12.
鸽新城疫病毒的分离及其生物学特性测定 总被引：18，自引：0，他引：18
用ＳＰＦ鸡胚从疑似鸽新城疫（鸽ＮＤ）病鸽群中分离到一株病毒ＱＬ株,该病毒株能凝集鸡红细胞（ＲＢＣ）,这种凝集作用能被抗新城疫病毒（ＮＤＶ）阳性血清抑制;用抗ＮＤＶ单抗ＰＥＧ夹心ＥＬＩＳＡ测定分离株为阳性。分离株经肌肉注射能使鸽发病和死亡,出现与自然发病鸽一致的症状和病变,但肌注ＳＰＦ鸡只感染,不见临床症状。对该分离株作进一步生物学特性鉴定,按照国际上规定的ＮＤＶ毒力判定标准,测定了该毒株最低致死量致死鸡胚的平均死亡时间（ＭＤＴ）、１日龄雏鸡脑内接种致病指数（ＩＣＰＩ）和６周龄雏鸡静脉接种致病指数（ＩＶＰＩ）,结果ＭＤＴ为１０５小时、ＩＣＰＩ为１．３３、ＩＶＰＩ为１．０。试验结果表明本分离株为鸽新城疫病毒。 相似文献
13.
新城疫病毒融合蛋白裂解位点基因的分离克隆及在原核细胞中的表达 总被引：5，自引：1，他引：4
用ＳＰＦ鸡胚繁殖新城疫病毒（ＮＤＶ）Ｆ４６Ｅ９株（强毒）、ＬａＳｏｔａＥ４株（弱毒），对病毒进行纯化，抽提ＲＮＡ。用１对均为２７个碱基的引物进行ＲＴ－ＰＣＲ，扩增出了２个毒株的融合蛋白裂解位点（Ｆｃ）基因。将Ｆｃ基因定向克隆入ｐＵＣ１８的ＥｃｏＲＩ和ＳａｌⅠ位点之间，获得２个毒株Ｆｃ基因克隆ｐＵＣＦ４６Ｆｃ和ｐＵＣＬａＦｃ，用ＥｃｏＲＩ／ＳａｌⅠ双酶切法、ＰｓｔⅠ单酶切法、ＰＣＲ法和核酸探针法对其进行了鉴定。将鉴定好的ＬａＳｏｔａＥ４Ｆｃ基因定向导入表达载体质粒ｐＢＶ２２１，获得重组子ｐＢＶＬａＦｃ。ＰＣＲ和内切酶酶切法鉴定表明，Ｆｃ插入的位置和方向都正确无误。用Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α通过热诱导法进行了表达。用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ法检测了表达产物。结果表明，有１条能够与ＮＤＶ多抗反应的特异条带，分子量约１５７００，与预期大小一致，说明是Ｆｃ基因的表达产物 相似文献
14.
建立了抗禽脊髓炎病毒（ＡＥＶ）的单克隆抗体（ＭＡｂ）ＶＲ９－１。接种ＡＥ鸡胚适应毒Ｖａｎ Ｒｏｃｋｃｌ株、２种疫苗株和２种野毒株的雏鸡脑冰冻切片、鸡胚成纤维细胞和鸡胚脑细胞，用间接免疫荧光和免疫过氧化物酶染色检查，结果，均可与ＭＡｂ ＶＲ９－１起反应。该ＭＡｂ也可用于石蜡包埋切片的抗生物素蛋白－生物素－过氧化物酶染色。试验结果表明，该ＭＡｂ可认别ＡＥＶ毒株的一个共同抗原决定簇，可用于ＡＥＶ检测和定 相似文献
15.
PCR和斑点杂交检测鸡传染性贫血病毒 总被引：38，自引：3，他引：35
通过聚合酶链反应（ｐｃＲ）扩增鸡传染性贫血病毒（ｃＡＶ）ＤＮＡ特定片段，将此ｐｃＲ产物用Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ标记后作为探针进行斑点杂交，以此检测ＣＡＶ并作流行病学调查。对从江苏省不同地市随机采集的２月龄左右不同疾病的病鸡ＤＮＡ样品进行检测，在被检的５２个不同鸡群来源的病料中，有３６个鸡群来源的病料ＤＮＡ显示ＣＡＶ阳性（群阳性率为６９．２％）；备组织中ＣＡＶＤＮＡ含量有所差异，依次为胸腺＞脾、骨髓、肝＞肾、法氏囊、脑。用ＰＣＲ检测得到的阳性鸡的组织病料感染ＳＰＦ鸡，在感染后第２４天检查，出现贫血症状。初步调查表明，在江苏一些地区ＣＡＶ感染已相当普遍，但它与发病的关系还有待于进一步研究。 相似文献
16.
鸡传染性支气管炎病毒S1基因在昆虫细胞中的高效表达 总被引：8，自引：1，他引：7
将鸡传染性支气管炎病毒（ Ｉ Ｂ Ｖ） Ｓ１ 基因 ｃ Ｄ Ｎ Ａ 克隆至含有起始密码 Ａ Ｔ Ｇ 的转移载体 ｐ Ｓ Ｘ Ｉ Ｖ Ｖ Ｉ＋ Ｘ３／４,构建成重组转移质粒 ｐ Ｓ Ｘ Ｉ Ｖ Ｖ Ｉ＋ Ｘ３／４ Ｓ１． Ｈｏｌｔｅ,再与粉纹夜蛾核型多角体病毒 Ｔｎ Ｎ Ｐ Ｖ Ｓ Ｖ Ｉ－ Ｇ Ｄ Ｎ Ａ（ Ｏ Ｃ Ｃ－ , ｇａｌ＋ ）共转染 草地夜蛾（ Ｓｆ９） 细胞, 经空斑纯化得 到已插入 Ｓ１ 基 因并能形成多角体 的重组病毒 Ｔｎ Ｎ Ｐ Ｖ（ Ｘ３／４） Ｓ１． Ｈｏｌｔｅ Ｏ Ｃ Ｃ＋ 。以重组毒株感染 Ｔｎ５ Ｂ１ 细胞,在不同时间收取感染了病毒的细胞进行 Ｓ Ｄ Ｓ Ｐ Ａ Ｇ Ｅ 与 Ｗ ｅｓｔｅｒｎ 印迹检测。 Ｔｎ Ｎ Ｐ Ｖ（ Ｘ３／４） Ｓ１． Ｈｏｌｔｅ Ｏ Ｃ Ｃ＋ 在感染的细胞中高效表达了 Ｓ１ 基因,表达产物为约 １００ ０００ 的融合蛋白,与预计的表达修饰后的产物大小相符,推测此蛋白已糖基化。 Ｓ Ｄ Ｓ Ｐ Ａ Ｇ Ｅ凝胶薄层色谱分析结果显示,感染病毒后 ４８、７２、９６ ｈ, Ｓ１ 蛋白分别占细胞内总蛋白量的 ２８７％ 、３５８％ 、３７１％ 。 相似文献
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传染性支气近炎病毒类M41地方分离株S1基因克隆及高变区序列分析 总被引：4，自引：0，他引：4
传染性支的管炎病毒（ＩＢＶ）分离株ＱＤ经ＲＴ－ＰＣＲ扩增出约１．７ｋｂＳ１糖蛋白基因ｃＤＮＡ，修饰后插入ｐＵＣ１８ＳｍａｌⅠ／ＥｃｏＲＩ位点构成质粒ｐＵＣＱＤＳ１。对克隆的Ｓ１基因５′端高变区序列测定显示，起始密码上游６０碱基和下游３８０碱基中与参考株Ｍ４１Ｓ１基因序列仅有１个碱基的差异，表明ＱＤ为一类Ｍ４１分离株。 相似文献
19.
５株已适应鸡胚细胞的ＡＶＡＶ在Ｖｅｒｏ细胞上传２～５代后各毒株均能产生明显的ＣＰＥ和较高的病毒滴度，而２株非鸡胚细胞适应株（分别为鸡胚毒和野外组织毒）在Ｖｅｒｏ细胞上盲传７代，仍无明显的ＣＰＥ出现。这一结果初步表明Ｖｅｒｏ细胞能用于已适应鸡胚细胞的毒株的增殖。而不能用于病毒的分离。吸附时间与冻融次数明显影响病毒的适应进程，以吸附１小时、冻融２次以上为佳。ＡＶＡＶＪＮ－１株能在Ｖｅｒｏ细胞上产生蚀斑，大小为２．７～４．４ｍｍ，出斑时间为接种后４～５天，Ｖｅｒｏ细胞用于中和试验，测得Ｓ（１１３３）株免疫鸡血清的小和效价为１：８０。 相似文献
20.
禽流感病毒血凝素基因的克隆及其DNA疫苗的免疫原性 总被引：22，自引：3，他引：19
禽流感病毒（ＡＩＶ）的表面结构蛋白血凝素（ＨＡ）是其主要保护性抗原。本研究参考已发表的Ｈ７亚型ＡＩＶ的ＨＡ基因序列，设计合成了１对Ｈ７ＨＡ特异引物，以ＡＩＶＡ／Ａｆｒｉ．Ｓｔａｒ．／Ｅｎｇ－Ｑ／９８３／７９／（Ｈ７Ｎ１）（Ａ／Ａｆｒｉ．Ｓｔａｒ．／Ｅｎｇ）核酸为模板，通过ＲＴ－ＰＣＲ扩增出１条１．７ｋｂｃＤＮＡ片段。将这一片段定向克隆到ｐＵＣ１８中，对其５′端及３′端部分序列测定后，确证其为ＨＡｃＤＮＡ。将ＨＡ基因置于ＳＶ４０启动子和增强子下游，构建了这一基因的真核表达质粒ｐＳＶＨ７。以此质粒１００μｇ肌肉注射免疫３周龄ＳＰＦ鸡６只，４周后以１００倍鸡胚感染剂量（ＥＩＤ）的ＨＡ基因同源病毒对所有鸡进行攻毒，１周后以棉拭子进行泄殖腔病毒分离；免疫后１～６周每周对所有鸡翅静脉采血，分离血清，检测ＨＩ抗体。结果，１００μｇ免疫组鸡病毒分离数为０／６，对照组为６／６；攻毒后１周免疫组鸡ＨＩ效价为１∶３２～１∶６４，对照组为１∶４～１∶１６。表明所构建的ＨＡ基因表达质粒可作为基因疫苗诱导鸡产生免疫保护反应。 相似文献