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1.
根据已经发表的F18ab菌毛F亚单位(FedF/ab)的基因(fedF/ab),设计一对引物,利用PCR技术从本实验室保存的10株大肠杆菌(F107/86、YCED1、YCED2、C、D、E、12F、2134P、8199、8813)中分别扩增到一段序列,并克隆至pGEM_T载体,获得重组质粒TF107F、TYCED1F、TYCED2F、TCF、TDF、TEF、T12FF、T8813F、T8199F、T2134PF。琼脂糖凝胶电泳、序列测定及分析表明,该10个序列大小均为903bp。通过与已发表的fedF/ab进行比较,可将这10个菌株分为2个主要遗传分支;其中F107/86、YCED1、YCED2、C、D、12F与fedF/ab具有高度同源性,属于fedF/ab;另外E、8813、8199、2134P虽与fedF/ab具有99.4%的同源性,推导的氨基酸序列具有98.3%的同源性,但通过基因树分析证明其已成为一个单独的分支,属于fedF/ac。 相似文献
2.
根据已经发表的大肠杆菌F18ab菌毛A亚单位(FedA／ab)的基因序列(fedA／ab)设计1对引物，利用PCR技术从本实验室保存的10株大肠杆菌(F107／86、YCED1、YCED2、C、D、E、12F、2134P、8199、8813)中分别扩增到一段序列．并克隆至pGEM-T载体，获得重组质粒TF107A、TYCED1A、TYCED2A、TCA、TDA、TEA、T12FA、T8813A、T8199A、T2134PA。通过序列测定，并与已发表的fedA／ab进行比较、基因树分析，可将这10个菌株分为2个基因群，其中F107／86、YCED1、YCED2、C、D、12F与fedA／ab具有高度同源性，属于fedA／ab．大小为513bp；E、8813、8199、2134P构成另一单独的分支，属于fedA／ac．大小为516bp。 相似文献
3.
大肠埃希氏菌F18菌毛FedF蛋白的表达与鉴定 总被引：3，自引：1，他引：3
根据已发表的F18菌毛F亚单位的基因序列(fedF)设计了1对引物．利用PCR技术分别扩增到F18ab和F18ac菌毛的fedF编码序列，并按预定的阅读框架分别插入表达载体pGEX-6p-1中谷胱甘肽转移酶(GST)基因的下游，获得重组质粒pPFedF／ab与pPFedF／ac，然后转化大肠埃希氏菌BL21获得重组菌PPFedF／ab与PPFedF／ac。测序结果表明，fedF编码序列大小均为837bp，与GenBank中登录的EedF结构编码序列(Z26520)大小一致。通过对菌体裂解物进行SDSPAGE电泳分析以及Western-blotting鉴定，证明重组大肠埃希氏菌PPFedF／ab与PPFedF／ac均可以表达融合蛋白形式的FedF(分别命名为GST-FedF／ab与GST-FedF／ac)。 相似文献
4.
根据已经发表的F18ab菌毛F亚单位(FedF／ab)的基因(fedF／ab),设计一对引物,利用PCR技术从表达F18ac菌毛的大肠杆菌2134P株、8199株、8813株中分别扩增到一段序列,并克隆至pGEM—T载体,获得重组质粒T8813F、T8199F、T2134PF。琼脂糖凝胶电泳、序列测定及分析表明,该3个序列大小均为903bp,与fedF／ab大小一致且具有较高的同源性(99．4％),推导的FedF／ac氨基酸序列与FedF／ab同源性为98．3％。数据表明该实验所克隆的序列均为F18ac菌毛F亚单位(FedF／ac)的基因(fedF／ac)。 相似文献
5.
大肠埃希氏菌F18菌毛结构蛋白与黏附特性的关系 总被引：2，自引：0，他引：2
利用已表达的F18ab和F18ac菌毛各结构亚单位的融合蛋白（GST-FedA／ab、GST-Fe-dA／ac、GST-FedE、（；STFed-F／ab、GST-FedF／ac）分组肌肉注射健康家兔，制备抗FedA／ab、Fe-dA／ac、FedE、FedF／ab、FedF／ac多价血清。结果表明，所制备的5种抗Fed多价血清均能凝集F18ab^＋。大肠埃希氏菌107／86株和F18ac^＋大肠埃希氏菌8813株。利用抗大肠埃希氏菌F18菌毛主要结构亚单位FedA特异抗体和次要结构亚单位FedE、FedF特异抗体，研究了F18菌毛与小肠上皮细胞的黏附特性。结果发现，FedA抗体和FedE抗体单独和合并均不能抑制F18^＋菌与小肠上皮细胞的黏附，而单用抗FedF抗体即能明显抑制F18^＋大肠埃希氏菌与小肠上皮细胞的黏附，表明FedA和FedE与F18菌毛的黏附不具相关性，而FedF才是F18菌毛的黏附性结构亚单位。 相似文献
6.
利用已经表达的大肠埃希菌F18ab和F18ac菌毛各结构亚单位(FedA、FedE、FedF)的融合蛋白GST-FedA/ab、GST-FedA/ac、GST-FedE/ab、GST-FedF/ab、GST-FedF/ac分组肌肉注射免疫成年健康家兔,分别制备抗GST-FedA/ab、GST-FedA/ac、GST-FedE、GST-FedF/ab、GST-FedF/ac的多价血清.玻板凝集试验结果表明,抗GST-FedA/ab、GST-FedA/ac、抗GST-FedE/ab、GST-FedF/ab、GST-FedF/ac多价血清均能同时凝集F18ab+大肠埃希菌F107/86株、F18ac+大肠埃希菌8813株.通过荧光抗体染色法对抗FedA/ab、FedA/ac、FedE/ab、FedF/ab、FedF/ac的单因子血清的研究,发现F18菌毛"a"抗原因子分布于FedA、FedE、FedF亚单位上,"b/c"抗原因子分布于FedA、FedF亚单位上. 相似文献
7.
将致仔猪水肿病大肠埃希氏菌107／86菌株在TSB、TSA培养基上传代，使之表达F107菌毛，大量收集菌毛化的细菌，利用热洗脱法提取菌毛抗原。粗提菌毛抗原经聚丙烯酰胺凝胶电泳可见一条约15ku的条带，以染色凝胶为对照，将未染色凝胶上的菌毛抗原条带切下，进行提纯。经免疫印迹反应，证实其条带为F107菌毛蛋白。 相似文献
8.
以产志贺毒素样大肠杆菌（SLTEC）F18ab血清型标准菌株107/86基因组DNA为模板,利用PCR技术成功扩增出编码F18ab完整菌毛操纵子fed基因,克隆入表达载体pBR322,经限制性内切酶酶切分析,DNA琼脂糖电泳鉴定并结合序列测定分析,构建和筛选出含fed完整基因正确插入的pBR322-fed重组质粒,将上述重组质粒转化至不含任何菌毛结构的大肠杆菌SE5000,该表达重组菌能分别与兔抗F18ab亚单位蛋白FedF高免血清、鼠抗F18ab菌毛a单因子单克隆抗体、兔抗F18ab菌毛高免血清和抗F18ab菌毛IgG抗体产生明显的凝集反应。用热抽提法分别抽提和纯化SLTEC F18ab标准株107/86和重组菌SE5000（pBR322-fed）体外表达的F18ab菌毛,纯化菌毛经SDS-PAGE电泳和考马斯亮蓝染色获单一相对分子质量约为15 000蛋白条带。Western-blotting结果表明：兔抗F18ab菌毛高免血清能特异性识别SLTEC F18ab标准株107/86和重组菌SE5000（pBR322-fed）所提纯的单一主要结构蛋白。用重组菌SE5000（pBR322-fed）进行易感仔猪小肠上皮细胞体外黏附试验和黏附抑制试验,结果表明：重组菌SE5000（pBR322-fed）和SLTEC F18ab标准株107/86一样具有较强的黏附易感仔猪小肠上皮细胞的能力,而兔抗F18ab菌毛高免血清能有效地抑制上述重组菌SE5000（pBR322-fed）和SLTEC F18ab标准株107/86对易感仔猪小肠上皮细胞的黏附结合。 相似文献
9.
采用PCR方法分别对类志贺氏菌毒素A亚单位基因第298～805序列、818～1201序列进行了扩增，使其第806～817序列的碱基(编码167～l70位氨基酸)缺失，并将两片段连接后克隆至质粒载体pGEX-6P-1中，获得了含有重组质粒pGEX-Ade。的重组大肠埃希氏菌；经SDS-PAGE以及使用特异性抗SLT-Ⅱ eA单克隆抗体的Western-blotting，证明该重组大肠埃希氏菌在IPTG诱导条件下可表达SLT-Ⅱ eA。 相似文献
10.
本研究旨在建立一种快速鉴定致猪水肿病大肠埃希菌的多重PCR检测方法.分别针对大肠埃希菌16S rDNA、志贺毒素Stx2e A亚基和菌毛F18ab A亚基保守序列设计合成3对特异性引物,优化多重PCR反应条件,并进行特异性和敏感性检测.结果显示,阳性对照菌株扩增产物大小分别为1 062、733和313 bp.特异性和灵敏性检测结果表明,与肠炎沙门菌、多杀性巴氏杆菌、胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌、支气管败血波氏杆菌和猪链球菌等猪常见致病菌均无交叉反应;菌体直接扩增法最低检出量为1 875 CFU.利用建立的多重PCR检测方法对分离收集的128株大肠埃希菌进行鉴定,得到36株致猪水肿病大肠埃希菌,其中30株既有菌毛F18ab又产志贺毒素Stx2e,另外6株仅产志贺毒素Stx2e.结果表明,本试验所建立的多重PCR检测方法对致猪水肿病大肠埃希菌的快速诊断和流行病学调查具有一定的应用价值. 相似文献
11.
检测987p^＋肠毒素性大肠埃希氏菌PCR方法的建立 总被引：2，自引：0，他引：2
以987p菌毛结构基因保守序列为靶序列，设计合成了1对可扩增459bp目的片段的引物，建立了检测肠毒素性大肠埃希氏菌987p菌毛基因的PCR方法。该方法对K88^ ( 为菌毛阳性）、K99^ 、F41^ 参考菌株和链球菌、葡萄球菌、巴氏杆菌的检测结果均为阴性；该方法的敏感度可达10^2CFU，对20株腹泻仔猪粪例分离物进行检测，有1株为阳性，与血清学检测的结果一致。结果表明，此方法特异性和敏感性都很高，可用于临床987p肠毒素性大肠埃希氏菌病的快速诊断和流行病学调查。 相似文献
12.
应用PCR方法从包含伪狂犬病病毒（PRV）Fa株糖蛋白gD基因的重组质粒pB13中扩增出糖蛋白gD基因去信号肽片段，将其克隆到大肠埃希氏菌表达载体pThiohisA中。测序结果表明，糖蛋白gD基因去信号肽片段长1155bp，与PRVFa株糖蛋白gD基因完全一致。经1mmol／L IPTG诱导后，重组质粒pThiohisA-gD在大肠埃希氏 菌XL1-blue、Top10、DE3和DH5a中均得到表达，其中在宿主菌XL 1-blue中表达量最高。Western-blotting结果显示，大肠埃希氏菌XL1-blue表达的糖蛋白gD具有免疫原性。 相似文献
13.
提取2株A型口蹄疫病毒FMDV-L1和FMDV-L2的RNA，用1对通用引物经RT-PCR扩增出2株病毒VP1基因的DNA片段，将扩增的VP1编码序列克隆到质粒载体pGEM-T Easy中，转入大肠埃希氏菌JM109，得到大量携带目的基因的质粒；经过重组质粒的鉴定、测序获得其核苷酸序列；利用序列分析软件及系统发生树绘制软件对FMDV—L1和FMDV-L2以及作为参考毒株的A22／India／17／77进行序列分析。结果表明，核酸序列中的变异多发区要多于氨基酸序列，氨基酸序列最明显的变异发生在构成FMDV抗原位点1的βG-βH环内，其中毒株FMDV-L1和FMDV-L2 RGD序列中的精氨酸(R)发生了变异，分别变成了亮氨酸(L)和谷氨酰胺(Q)。 相似文献
14.
本试验旨在对临床分离的猪源大肠埃希氏菌耐药基因进行初步定位。采用常规细菌分离培养、16S rRNA PCR扩增和序列测定方法从江西省3个规模化猪场送检的子宫脓液中分离鉴定病原菌,并通过质粒提取、转化大肠埃希氏菌DH5α感受态细胞及药敏试验对临床分离株的耐药基因进行初步定位。结果显示,分离鉴定到3株大肠埃希氏菌,其中JX-22分离株仅对氧氟沙星、大观霉素敏感,JX-26分离株仅对链霉素、氧氟沙星等4种药物敏感,JX-28分离株仅对氧氟沙星等3种药物敏感,均为多重耐药菌;3株大肠埃希氏菌均可纯化到分子质量大小不一的质粒。分离株、质粒转化菌及大肠埃希氏菌DH5α感受态细胞药敏试验对比结果显示,3株大肠埃希氏菌的耐链霉素、林可霉素、甲硝唑、氨苄西林、阿莫西林、大观霉素、丁胺卡那基因,JX-22和JX-26分离株的耐多西环素、氟苯尼考和复方新诺明基因,JX-22分离株的耐头孢曲松基因,JX-28分离株的耐头孢曲松、头孢噻肟、诺氟沙星基因均定位于细菌质粒上;JX-28分离株的耐多西环素、氟苯尼考和复方新诺明基因,JX-22分离株的耐诺氟沙星基因和JX-26分离株的耐头孢曲松、头孢噻肟基因均定位于其染色体上;3株分离株均无氧氟沙星耐药基因。本试验初步确定3株多重耐药猪源大肠埃希氏菌的大部分耐药基因定位于质粒上,为进一步研究猪源大肠埃希氏菌的耐药机理和有效控制措施奠定基础。 相似文献
15.
本试验旨在对临床分离的猪源大肠埃希氏菌耐药基因进行初步定位。采用常规细菌分离培养、16S rRNA PCR扩增和序列测定方法从江西省3个规模化猪场送检的子宫脓液中分离鉴定病原菌,并通过质粒提取、转化大肠埃希氏菌DH5α感受态细胞及药敏试验对临床分离株的耐药基因进行初步定位。结果显示,分离鉴定到3株大肠埃希氏菌,其中JX-22分离株仅对氧氟沙星、大观霉素敏感,JX-26分离株仅对链霉素、氧氟沙星等4种药物敏感,JX-28分离株仅对氧氟沙星等3种药物敏感,均为多重耐药菌;3株大肠埃希氏菌均可纯化到分子质量大小不一的质粒。分离株、质粒转化菌及大肠埃希氏菌DH5α感受态细胞药敏试验对比结果显示,3株大肠埃希氏菌的耐链霉素、林可霉素、甲硝唑、氨苄西林、阿莫西林、大观霉素、丁胺卡那基因,JX-22和JX-26分离株的耐多西环素、氟苯尼考和复方新诺明基因,JX-22分离株的耐头孢曲松基因,JX-28分离株的耐头孢曲松、头孢噻肟、诺氟沙星基因均定位于细菌质粒上;JX-28分离株的耐多西环素、氟苯尼考和复方新诺明基因,JX-22分离株的耐诺氟沙星基因和JX-26分离株的耐头孢曲松、头孢噻肟基因均定位于其染色体上;3株分离株均无氧氟沙星耐药基因。本试验初步确定3株多重耐药猪源大肠埃希氏菌的大部分耐药基因定位于质粒上,为进一步研究猪源大肠埃希氏菌的耐药机理和有效控制措施奠定基础。 相似文献
16.
根据已经发表的F18ab菌毛A亚单位(FedA/ab)的基因(fedA/ab)[1],设计一对引物,利用PCR技术从表达F18ac菌毛的大肠杆菌2134P株[2]、8199株[3]、8813株[3]中分别扩增到一段序列,并克隆至pGEM-T载体,获得重组质粒T2134PA、T8199A、T8813A.琼脂糖凝胶电泳、序列测定及分析表明,该3个序列大小均为516bp,与fedA/ab(513bp)具有较高的同源性,分别为96.3%、96.5%、95.9%,推导的Fed/ac氨基酸序列与FedA/ab同源性分别为93.0%、93.6%、92.4%.数据表明该实验所克隆的序列均为F18ac菌毛A亚单位(FedA/ac)的基因(fedA/ac). 相似文献
17.
用碱裂解法提取分离的１０株鸡源大肠埃希氏菌的质粒。结果：多数大肠埃希氏菌株含有大质粒，分子量为５０￣２３０ｋｂ。这些大质粒可能含有毒力相关基因，与细菌的耐药性，大肠埃氏菌素的产生及质粒的传递功能等有关。 相似文献
18.
中草药消除大肠埃希氏菌耐药性及耐药质粒的研究 总被引：11，自引：0，他引：11
在系统鉴定和药敏试验的基础上,对９株大肠埃希氏菌多重耐药菌株进行而药基因定位,结果表明有４株菌株的氨苄青霉素基因位于质粒上。通过对中草药煎煮、水蒸气蒸馏等方法提取其有效成分,对耐药大肠埃希氏菌进行耐药性消除试验,结果发展大蒜油等对大肠埃希氏菌氨苄青霉素耐药性有消除作用;鱼腥草、紫草等对大肠埃希氏菌庆大霉素而药性及耐药质粒有消除作用,消除率分别为２．９８％和４．２０％。 相似文献
19.
嗜水气单胞菌gyrA氟喹诺酮抗性决定区的克隆与分析 总被引：1，自引：0，他引：1
研究了从病鱼体内分离的嗜水气单胞菌对氟喹诺酮类药物耐药性的分子机理。以4株对诺氟沙星等氟喹诺酮类药物耐药菌株及2株敏感菌株为模板，参照杀鲑气单胞菌gyrA基因序列，设计了1对引物，进行gyrA基因氟喹诺酮抗性决定区PCR扩增，将扩增产物克隆入pMD18-T载体，转化入大肠埃希氏菌DH5α中，小提质粒，酶切鉴定，测序并分析比较耐药菌和敏感菌的氨基酸残基序列。发现耐药菌有5个氨基酸突变位点，分别是83位点的Ser→Ile,92位点的Leu→Met,174位点的Ile→Phe,202位点的Asn→Asp,203位点的Leu→Arg，耐药菌突变后的氨基酸残基均比敏感菌正常的相对应氨基酸残基分子量大。83位点的突变与大肠埃希氏菌的耐药性突变一致。122位点具有保守的Try。 相似文献
20.
从临床疑似大肠埃希菌感染病鸡的肝脏,分离到24株能在麦康凯平板生长但呈灰白色菌落的革兰阴性中等大小杆菌.通过IMViC试验、糖发酵试验、三糖铁斜面接种试验确定为大肠埃希菌,且其中16株为不发酵乳糖型,8株为迟发酵乳糖型.血清学试验表明,其中12株(50%)为O78抗原型,9株(37.5%)为O1抗原型,3株(12.5%)未能定型.利用PCR方法检测了该24株大肠埃希菌的F1菌毛与P菌毛基因,结果表明,其中10株(41.67%)为F1+大肠埃希菌,未发现P+分离株.药敏试验发现,所有菌株均对头孢拉定和阿米卡星敏感,部分菌株对链霉素、庆大霉素、环丙沙星、复方新诺明敏感,而对新霉素均为耐药. 相似文献