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1.
本研究旨在利用同源重组技术构建敖汉细毛羊BMP6基因表达载体及转染成纤维细胞后基因的表达量变化。实验以敖汉细毛羊为研究对象,采集40日龄的胎羊。首先,提取RNA并反转录成c DNA,参照Gen Bank中BMP6基因序列信息及pc DNA3.1载体序列设计1对含有同源臂的引物,通过PCR扩增获得BMP6基因片段、利用So So试剂盒将目的片段连接到pc DNA3.1真核表达载体上。鉴定pc DNA3.1-BMP6表达载体构建成功后,转化大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞;其次对敖汉细毛羊的成纤维细胞进行分离培养,并将构建的pc DNA3.1-BMP6表达载体转染成纤维细胞,利用实时荧光定量PCR技术和Western Blot技术检测BMP6基因在成纤维细胞中表达量的变化。结果表明:经酶切、测序鉴定pc DNA3.1-BMP6表达载体构建成功,并且转染成纤维细胞后BMP6基因的m RNA、蛋白表达量均明显升高,且转染组的表达量极显著高于对照组(P0.01)。在本实验条件下,利用同源重组技术成功构建了敖汉细毛羊BMP6基因表达载体,并且成功转染成纤维细胞,基因在细胞中过表达,为进一步研究其功能奠定基础。 相似文献
2.
利用 PCR技术对猪繁殖与呼吸综合征病毒 (PRRSV) BJ- 4株的 E基因进行修饰和改造 ,在 E基因上游加入 Kozak序列 ,扩增并克隆 E基因。将 E基因 c DNA亚克隆至真核表达载体 pc DNA3.1( )中 ,构建了真核重组表达质粒 pc DNA- E。用pc DNA- E免疫小鼠 ,经免疫荧光抗体试验检测结果表明 ,重组质粒 pc DNA- E经 3次免疫后 ,所有小鼠血清抗体均为阳性 ,说明pc DNA- E在小鼠体内可诱导特异性的体液免疫应答反应。 相似文献
3.
《黑龙江畜牧兽医》2015,(7)
为了最终建立诱导小鼠iP S细胞为成肌细胞的方法,试验在克隆小鼠Myo D基因的基础上,将其与pc DNA3.1载体连接,以构建真核表达载体;采用脂质体法将重组质粒转染到小鼠胚胎成纤维细胞中,利用Real-time PCR技术、免疫荧光检测和流式分析等技术对转染前后细胞的Myo D基因表达情况进行检测。结果表明:成功克隆获得Myo D基因,并构建真核表达载体Myo D-pc DNA3.1;转染Myo D-pc DNA3.1的小鼠胚胎成纤维细胞经免疫荧光检测后在荧光显微镜下呈现表达Myo D基因的红色;Real-time PCR检测其Myo D基因相对表达量提高至8.926±0.010;经BD Accuri-C6个人型流式细胞仪检测,约有93%的转染细胞表达Myo D蛋白,在荧光倒置显微镜下可观察到表达Myo D蛋白而呈现的绿色荧光。说明已成功构建特异表达Myo D基因的真核表达载体Myo D-pc DNA3.1。 相似文献
4.
试验旨在构建鸡黑素皮质素受体3(c MC3R)基因的真核表达载体,并在人源胚胎肾细胞(HEK293T)观察目的基因的表达情况。从新鲜鸡血液提取全基因组DNA,并以其为模板,聚合酶链式反应(PCR)扩增目的基因编码区。凝胶纯化回收目的基因,用限制性内切酶Eco RⅠ和XbaⅠ目的基因和真核表达载体pc DNA3.1(+),并将双酶切后的目的基因定向插入表达载体中。经酶切和测序正确后加入c-myc标签。单点突变构建pc DNA3.1(+)-myc/MC3R突变型,用脂质体法将重组质粒pc DNA3.1(+)-myc/MC3R分别瞬时转染入HEK293T细胞中,流式细胞仪检测野生型和突变型的细胞表面表达和胞内总表达。结果表明,成功构建了鸡MC3R基因野生型和四个突变型(M54L、G104S、L151R和S183S)的真核表达载体,突变型与野生型在HEK293T细胞中的表面表达和胞内总表达没有显著性差异,研究结果为进一步研究c MC3R功能奠定基础。 相似文献
5.
从猪的股二头肌中提取总RNA,利用RT-PCR技术从猪骨骼肌中获得CFL2基因的编码区序列,T-A克隆至PMD-18T载体,经HindⅢ和XhoⅠ酶切后定向克隆至真核表达载体pCDNA3.1(+)中。获得的重组质粒pCDNA3.1(+)/CFL2用限制性内切酶酶切分析和DNA测序分析鉴定,并经脂质体瞬时转染C2C12细胞,最后利用PCR检测转基因细胞中CFL2基因的存在及其表达情况。结果显示:猪CFL2基因已克隆到真核表达载体pCDNA3.1(+)中,转染的C2C12细胞中检测到细胞内较高量CFL2的表达。pCDNA3.1(+)/CFL2真核表达载体的成功构建,为深入研究CFL2基因在猪肌肉细胞中的功能奠定基础,为猪肉质品质的改良提供了新的思路。 相似文献
6.
《黑龙江畜牧兽医》2017,(1)
为了构建新疆多浪羊真核表达载体pc DNA3.1-IL-1β,试验采用重组质粒p MD-18TIL-1βPCR和质粒pc DNA3.1双酶切的方法,获得目的基因白细胞介素-1β(IL-1β)和载体片段pc DNA3.1(+),通过连接、转化宿主菌大肠杆菌DH5α感受态细胞,挑取阳性克隆,再通过菌液PCR和双酶切来验证阳性克隆,并测序。结果表明:试验已成功构建真核表达载体pc DNA3.1-IL-1β,完成了pc DNA3.1-IL-1β的菌液PCR和酶切鉴定。通过对IL-1β功能的了解,以及熟悉质粒提取和质粒连接的方法,完成重组质粒pc DNA3.1-IL-1β的构建。 相似文献
7.
《中国畜牧杂志》2021,(6)
本实验通过构建猪视黄酸结合蛋白1(Cellular Retinoic Acid-Binding Protein1,CRABP1)过表达载体并揭示其对猪卵泡颗粒细胞凋亡的效应。从猪卵巢组织中提取RNA,反转录获得cDNA样本,利用PCR克隆CRABP1基因,并使用T4连接酶将其连入pcDNA3.1载体,进一步转化到感受态细胞中,通过PCR、双酶切及测序鉴定后提取去内毒素质粒。随后将构建好的CRABP1过表达质粒转染猪卵泡颗粒细胞,利用荧光定量PCR(qRT-PCR)检测其转染效率及其对凋亡相关基因的影响,再将CRABP1过表达质粒转染至猪颗粒细胞24 h后添加1 nmol/L全反式视黄酸(All-trans Retinoic Acid,ATRA),检测其凋亡相关基因的表达变化。结果显示:CRABP1扩增片段序列与参考序列一致,将CRABP1过表达质粒转染猪颗粒细胞24 h后,其CRABP1基因表达量极显著升高,说明CRABP1过表达载体构建成功;CRABP1过表达载体单独转染颗粒细胞后,其可促进猪颗粒细胞促凋亡基因Bax、Caspase-3和Fas的mRNA表达,并且CRABP1过表达可逆转ATRA对猪颗粒细胞的抑凋亡作用。结果表明猪CRABP1过表达载体构建成功,其可介导ATRA调控猪卵泡颗粒细胞凋亡。 相似文献
8.
《中国畜牧兽医》2017,(10)
试验旨在探讨利用环状RNA表达载体在体外表达环状RNA mmu-circ-Pax3.1的可行性。利用反向PCR及测序证实mmu-circ-Pax3.1的存在,将其对应的线性序列克隆到环状RNA表达载体pc DNA3.1(+)CircRNA Mini Vector中,构建重组载体pc DNA3.1(+)CircRNA-mmu-Pax3.1,经PCR、酶切、测序等对重组质粒进行鉴定。利用脂质体2000转染试剂将重组质粒转染到293细胞中,在倒置荧光显微镜下观察细胞转染情况。最后利用RT-PCR检测正常细胞组、空载体组及试验组中环状RNA mmu-circ-Pax3.1的表达情况。结果表明,试验成功构建了环状RNA mmu-circ-Pax3.1表达载体,可在293细胞中高效转录mmu-circ-Pax3.1。试验利用基因工程技术构建的环状RNA mmu-circ-Pax3.1表达载体,通过脂质体法转染293细胞,使其高效转录,为深入研究mmu-circ-Pax3.1的功能奠定了基础。 相似文献
9.
《中国家禽》2015,(5)
试验旨在构建鸡趋化因子受体2(CCR2)和趋化因子受体5(CCR5)真核表达系统,并瞬时转染中国仓鼠卵巢细胞(CHO-K1)观察其表达情况。以鸡基因组DNA为模板,PCR克隆出鸡的CCR2和CCR5基因的编码序列(CDS),将克隆出的片段插入真核表达载体pc DNA3.1(+)中,构建重组真核表达质粒pc DNA3.1(+)-CCR2、pc DNA3.1(+)-CCR5,酶切鉴定后测序。加Kozak序列和myc分子标签后,瞬时转染CHO-K1细胞,用反转录PCR(RT-PCR)、Western blot分别从转录、翻译水平鉴定重组质粒是否能在真核细胞中表达。结果显示,成功克隆出鸡CCR2、CCR5的CDS序列,酶切和测序结果表明pc DNA3.1(+)-CCR2-myc、pc DNA3.1(+)-CCR5-myc构建成功,RT-PCR、Western blot证实转染的重组质粒能在CHO-K1细胞中转录和翻译。本试验成功构建出鸡CCR2和CCR5真核表达载体,并能在真核细胞中表达,为进一步研究CCR2、CCR5的功能奠定了基础。 相似文献
10.
本研究旨在克隆奶牛脑肌类芳香烃受体核转位蛋白1基因（Brain and Muscle Arnt-Like Protein 1,BMAL1）的蛋白编码序列（Coding Sequence,CDS）并构建其真核表达载体,运用生物信息学方法解析其CDS序列和编码蛋白特性。以牛肝脏组织为材料,利用PCR技术扩增奶牛BMAL1基因中带有同源臂的CDS片段。采用同源重组法,将目的片段连接至酶切线性化的pc DNA3.1-Puro-N-3HA真核表达载体上,酶切及测序结果均符合预期的质粒命名为pc DNA3.1-3HA-c BMAL1。将空载与重组质粒分别转染至HEK293T细胞,通过实时荧光定量PCR技术（q PCR）和Western Blotting技术检验奶牛BMAL1基因的过表达效果,并利用生物信息学软件分析BMAL1基因CDS区及其编码蛋白的特性和功能。结果显示,pc DNA3.1-3HA-c BMAL1真核表达载体构建成功,将该质粒转染至HEK293T细胞后,成功实现了BMAL1在m RNA和蛋白水平的过表达;牛BAML1基因与绵羊、山羊同源性最高,BMAL1蛋白为不稳定蛋白,其上不存在... 相似文献
11.
《中国动物传染病学报》2016,(3)
为了构建柔嫩艾美耳球虫丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(Eimeria tenella serine/threonine protein kinase,Et STK)基因的真核表达重组质粒,并实现在DF-1细胞中的表达,以柔嫩艾美耳球虫子孢子c DNA为模板,PCR扩增Et STK基因,将扩展产物与真核表达质粒pc DNA3.1-flag连接,构建重组真核表达质粒pc DNA3.1-flag-Et STK,测序鉴定正确后,转染DF-1细胞进行表达,利用Western blot和间接免疫荧光(indirect immunofl uorescene assay,IFA)对其表达情况进行鉴定。结果表明重组质粒pc DNA3.1-flag-Et STK构建成功。Western blot显示在54 k Da处出现条带;IFA检测到特异性的绿色荧光,表明构建的重组质粒pc DNA3.1-fl ag-Et STK成功地在DF-1中实现了表达。本研究结果为深入了解柔嫩艾美耳球虫丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的功能及球虫核酸疫苗提供了基础。 相似文献
12.
旨在解析牛MSTN启动子与MEF2C之间的相互调控作用,进一步探讨MSTN基因在肉牛肌肉生长发育方面的调控机制。首先,通过PCR扩增关岭牛MSTN启动子序列2 267 bp和MEF2C基因CDS区1 425 bp。其次,构建pGL3-Basic-MSTN和pcDNA3.1(+)-MEF2C双荧光素酶报告载体,采用脂质体法共转染至小鼠C2C12成肌细胞,24 h后检测其双荧光素酶活性。最后,通过PCR扩增MSTN启动子核心片段MSTN-P1,重新构建以MSTN-P1片段替代(CMV)区的重组表达载体pEGFP-N3-MSTN-P1-MEF2C,将其分别转染至小鼠C2C12成肌细胞和大鼠下颌腺上皮细胞,24 h后观察绿色荧光蛋白发光情况,48 h后提取细胞总RNA,利用qRT-PCR检测MEF2C基因在不同细胞中的表达情况。结果显示,在小鼠C2C12成肌细胞中,共转染pcDNA3.1(+)-MEF2C试验组较pGL3-Basic-MSTN试验组能显著增强MSTN启动子的活性(P0.05),较pGL3-Basic对照组能极显著增强MSTN启动子的活性(P0.01);MSTN启动子核心片段MSTN-P1能驱动MEF2C基因在小鼠C2C12成肌细胞中的表达量极显著上调(P0.01),且能驱动MEF2C基因在大鼠下颌腺上皮细胞中的表达量显著上调(P0.05)。结果表明,在转录水平,MSTN启动子与MEF2C可能同时参与了牛肌肉生长和分化的调控。 相似文献
13.
本试验以Hypodermin C(HC)基因原核表达载体pETHC为模板,PCR扩增HC基因,克隆测序后,亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建了DNA疫苗pcDNA-HC。pcDNA-HC体外转染小鼠胎儿成纤维细胞后,间接免疫荧光技术检测目的基因在转染细胞中的表达。以DNA疫苗pcDNA-HC免疫小鼠,对小鼠进行体液免疫水平检测。结果表明,所构建的DNA疫苗能转染到小鼠胎儿成纤维细胞中并正确表达,免疫小鼠血清IgG滴度随免疫次数的增加而升高。 相似文献
14.
《畜牧兽医学报》2015,(5)
本研究旨在探究关岭牛4个不同长度的MyoD I启动子的启动活性,初步确定该基因核心启动子位置。采用实时荧光定量PCR技术对关岭牛不同组织中MyoD I基因的相对表达量进行检测。以关岭牛血液DNA为模板,设计5'端加磷的引物,PCR扩增获得4个不同长度的关岭牛MyoD I启动子,定向精确替换pEGFP-N3载体的CMV启动子区,构建重组真核表达载体pEGFP-N3-MyoD I。利用脂质体法将重组质粒瞬时转染小鼠C2C12细胞,依据小鼠C2C12细胞发光的强弱判断MyoD I启动子的启动活性。结果显示,MyoD I基因在关岭牛肌肉组织中表达量较高;目的片段成功替换pEGFP-N3载体的CMV区;重组质粒能在小鼠C2C12细胞中成功表达,细胞在激发光下发绿色荧光。本研究成功构建了重组真核表达载体pEGFP-N3-MyoD I,4个启动子均具有启动活性,其中P3启动子在小鼠C2C12细胞中表达量最高,初步推断P3启动子为该基因的核心启动子。 相似文献
15.
《畜牧与兽医》2018,(12)
为探讨绵羊肺炎支原体(Mo) Hsp70蛋白作为核酸疫苗的可能性,在对Mo贵州分离株Hsp70蛋白基因进行生物信息学分析的基础上,选择Mo Hsp70蛋白C末端基因,将其与载体pcDNA 3.1 (+)进行连接构建重组质粒,通过脂质体转染至CHO细胞,采用RT-PCR和间接免疫荧光方法评价转染效果和真核细胞表达效果。结果显示:Mo贵州分离株Hsp70蛋白的C末端是具有优势抗原表位的区域,通过PCR方法成功扩增出567 bpHsp70蛋白的C末端基因,并成功构建pc DNA 3.1-Hsp70重组质粒,在转染细胞中PCR扩增出预期大小的目的基因,可以观察到特异性的绿色荧光,提示本研究成功构建的重组质粒能在真核细胞中良好表达,为后续Mo Hsp70蛋白抗原性和免疫佐剂特性的研究奠定基础。 相似文献
16.
为深入研究牛病毒性腹泻病毒E_2蛋白的生物学功能,了解其在哺乳动物细胞中的亚细胞定位情况,采用RT-PCR扩增牛病毒性腹泻病毒Changchun184株E_2基因,将其克隆至真核表达载体pc DNA3.1/V5His A中,并进行酶切鉴定和测序分析,将构建的重组质粒pc DNA3.1/V5His A-E_2经脂质体介导转染至MDBK细胞。继续培养48h后,在激光共聚焦显微镜下观察E_2蛋白在细胞中的亚细胞定位情况。结果表明,E_2蛋白在细胞核与细胞质中均有表达,且绿色荧光呈点状均匀分布。该研究为进一步研究牛病毒性腹泻病毒E_2蛋白的相关功能奠定了基础。 相似文献
17.
《中国动物传染病学报》2016,(5)
为表达鸡肺表面活性蛋白A(chicken palmonary surfactant protein A,c SP-A)基因,本研究扩增去除终止子的c SP-A,通过Nhe I和Apa I双酶切,连接进入真核表达载体pc DNA3.1/myc-His(-)A中,构建获得重组载体pc SP-A;同时,将c SP-A和gfp基因按Nhe I-Bam H I和Bam H I-Apa I分别连接至pc DNA3.1/myc-His(-)A载体中,构建获得融合表达载体pc SP-A-GFP。通过脂质体法将这两类真核载体瞬时转染293T细胞,48 h后用4%多聚甲醛固定细胞,利用c SP-A特异性鼠多抗进行间接免疫荧光,于倒置荧光显微镜下观察c SP-A表达和亚细胞定位情况,然后收获细胞进行Western blot检测。结果发现,c SP-A在细胞质中表达,pc SP-A和pc SP-A-GFP融合蛋白的相对分子量分别约为30 k Da和55 k Da。上述研究结果为进一步研究c SP-A的功能奠定了基础。 相似文献
18.
本研究旨在克隆通城猪含有第1个内含子的MSTN前肽基因,构建真核定点诱变载体,并通过转染C2C12细胞验证载体表达的有效性.以通城猪血液样品中提取的DNA作为模板,PCR扩增得到含第1个内含子的MSTN前肽基因,扩增产物进行克隆、测序.再将目的片段定向克隆到去除了EGFP基因的pEGFP-N1表达载体上.通过定点诱变方法将前肽编码序列第76位天冬氨酸突变为丙氨酸,获得定点诱变载体pEGFP(-)-N1-ProMstnD76A,并瞬时转染C2C12细胞.转染48 h后,通过RT-PCR和Real-time PCR方法检测目的基因的表达情况.结果表明:本研究成功克隆了通城猪含第1个内含子的MSTN前肽基因,并对该基因进行定点诱变修饰,构建了真核表达载体,转染后其前体mRNA能在C2C12细胞中进行正确剪接,目的基因mRNA表达水平较高.这为猪MSTN前肽基因在体内表达的研究奠定基础,并为制备转基因猪提供有用的分子材料. 相似文献
19.
20.
《中国兽医学报》2015,(12):1933-1938
以研制安全有效的奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌基因工程疫苗为目的,采集380份隐性和临床型乳房炎奶样,经高盐肉汤、过氧化氢酶、甘露醇发酵、三糖铁发酵试验以及Baird-Parker平板对金黄色葡萄球菌进行分离和生化鉴定,PCR扩增分离株凝集因子基因(Clf A)并连接TA克隆载体。经测序确定无误后,连接pc DNA3.1His B以构建真核表达载体pc DNA 3.1His B-Clf A,转化Trans T1TM感受态细胞,HindⅢ和XhoⅠ双酶切分析,同时进行测序和序列分析。结果显示,通过高盐肉汤、过氧化氢酶、甘露醇、三糖铁试验和Baird-Parker平板从380份隐性及临床型奶牛乳房炎奶样中共分离到35株金黄色葡萄球菌,成功构建了真核表达载体(pc DNA3.1His B-Clf A),为研制金黄色葡萄球菌基因工程疫苗奠定基础。 相似文献