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1.
【目的】通过分析成熟卵泡液外泌体（mature follicular fiuid Exosomes, mffEXs）和闭锁卵泡液外泌体（atretic follicular fiuid Exosomes, affEXs）miRNA的表达差异,探索卵泡液外泌体（EXs）miRNA在卵泡发育和闭锁过程中的调控作用。【方法】本研究通过抽提4—6 mm猪成熟发育和闭锁卵泡的卵泡液分离外泌体,进行粒径分析及Western Blot检测对EXs进行鉴定,接下来对特征性EXs携带的miRNA测序和功能富集分析,筛选关键信号通路和差异基因。最后,将mffEXs和affEXs作为添加剂进行颗粒细胞培养,利用Q-PCR检测技术分析关键基因的表达,验证两类卵泡液内EXs miRNA在卵泡发育中的调控功能。【结果】成功分离了mffEXs和affEXs,对比mffEXs测序结果,affEXs中有90个miRNA上调表达,220个miRNA下调表达,表明了卵泡液中的miRNA表达水平与调控卵泡发育有关;KEGG富集分析结果显示两类卵泡的差异信号通路主要集中在Ras、cAMP、P53和MAPK等信号通路,涉及调控卵母细胞发育、减数分裂以及颗粒细胞细胞周期等生物学功能。在闭锁卵泡中,上调表达的ssc-let-7a和ssc-miR-133a-3p分别潜在靶向调控细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK1）和胰岛素生长因子（IGF1）,抑制了G1和G2/M期的运转和类固醇激素代谢,促使颗粒细胞周期运转受阻和颗粒细胞凋亡,引起卵泡闭锁的发生;下调的ssc-miR-21-5p潜在靶向肿瘤抑癌基因（P53）,抑制细胞周期运转,促使颗粒细胞凋亡。在体外培养的颗粒细胞中分别添加mffEXs和affEXs,Q-PCR结果显示CDK1在mffEXs中显著上调表达,而P53显著下调表达,表明了测序分析结果的可靠性。这些结果均显示了affEXs中miRNA表达水平的变化促使颗粒细胞凋亡和细胞周期阻滞,引起卵泡闭锁。【结论】猪affEXs携带miRNA增加了对CDK1、IGF1和P53的表达调控,抑制颗粒细胞细胞周期运转和类固醇激素代谢等信号通路,引起颗粒细胞凋亡,导致卵泡闭锁。 相似文献
2.
【目的】分析去乙酰化酶SIRT1基因在猪不同发育阶段卵泡颗粒细胞中的表达规律,为进一步了解SIRT1基因在猪卵泡发育中的调控机制奠定基础。【方法】采集猪卵巢,分离卵泡颗粒细胞,根据直径将其分为≤1.5mm,1.5~≤3.0mm,3.0~≤5.0mm,5.0mm 4个组,利用免疫组织化学方法分析SIRT1蛋白在不同发育阶段卵泡颗粒细胞中的表达定位,利用qRT-PCR和Western blotting方法分析SIRT1基因在不同直径卵泡颗粒细胞中mRNA和蛋白的表达量。【结果】SIRT1蛋白在不同发育卵泡颗粒细胞中均有表达,随着卵泡的发育,SIRT1蛋白表达量逐渐升高,其在原始卵泡中表达量最低,在其余卵泡中表达量较高。SIRT1mRNA及其蛋白在不同直径的卵泡中表达趋势一致,在直径1.5~≤3.0mm卵泡中的表达量极显著高于其他直径卵泡(P0.01)。【结论】SIRT1基因在不同卵泡中的表达具有规律性,与猪卵巢卵泡发育具有潜在的相关性。 相似文献
3.
《西南农业学报》2019,(12)
【目的】本文对山羊卵泡差异表达的环状RNA circ_ZCCHC24进行了成环鉴定和表达定位分析。【方法】分别采用生物信息学技术、Sanger测序技术、实时荧光定量PCR和荧光原位杂交技术,研究了circ_ZCCHC24的序列和结构组成、接头序列中的环化位点和表达定位情况。【结果】circ_ZCCHC24是由山羊ZCCHC24基因的部分第1内含子和第2外显子环化而成,sanger测序结果也证明了这一结果;circ_ZCCHC24在麻城黑山羊卵泡中的表达量显著高于波尔山羊卵泡(P0.01)。circ_ZCCHC24表达具有组织特异性,在波尔山羊肾脏高表达,卵泡中低表达;circ_ZCCHC24定位于山羊卵泡颗粒细胞的胞质中,发挥"miRNA吸附海绵"的功能。【结论】本研究为进一步研究circ_ZCCHC24调控母羊卵泡发育的分子机理,挖掘出高产母羊的特有调控通路奠定了基础,也为高繁殖力山羊品种的培育提供新靶点。 相似文献
4.
【目的】卵巢颗粒细胞的增殖和分化是原始卵泡生长启动的关键因素,卵巢颗粒细胞过度凋亡是卵泡闭锁的主要原因,因此卵巢颗粒细胞的功能对卵泡生长发育、排卵、激素分泌等至关重要。研究通过探究连环蛋白β1（catenin beta 1, CTNNB1）对猪卵泡发育过程中颗粒细胞的增殖、凋亡及类固醇激素分泌等功能的影响,为猪卵泡发育的分子调控机制研究提供参考。 【方法】利用RNA抽提、实时定量PCR（Quantitative real time PCR, qRT-PCR）等方法,构建CTNNB1在母猪卵巢、肌肉、大脑等9个组织的表达谱;检测母猪性成熟过程中卵巢组织和小（≤3 mm）、中（3—6 mm）、大（≥6 mm）卵泡颗粒细胞中CTNNB1的表达情况。构建CTNNB1的真核表达载体及合成siRNA,转染至猪卵巢颗粒细胞,采用EdU、Annexin V- FITC/PI双染、ELISA等方法,检测CTNNB1对颗粒细胞增殖、凋亡、类固醇激素分泌的影响,以及对类固醇激素合成通路重要基因转录表达的影响。【结果】与肌肉、大脑等组织相比,CTNNB1在卵巢中mRNA表达水平最高。性成熟母猪卵巢中CTNNB1转录水平显著高于性成熟前和性成熟后的母猪;卵巢卵泡中CTNNB1转录和蛋白水平随卵泡发育明显上调;且卵巢颗粒细胞中CTNNB1转录和蛋白水平也随卵泡的发育逐渐上调。更重要的是,CTNNB1显著促进颗粒细胞增殖,抑制颗粒细胞凋亡;CTNNB1能够上调CYP1A1和HSD17B7的转录水平,下调CYP11A1、ESR1、ESR2、FSHR、LHR和NR5A1等类固醇激素合成相关基因的转录水平,进而促进颗粒细胞雌激素的分泌,抑制颗粒细胞雄激素和孕激素的分泌。【结论】本研究证实CTNNB1可能通过促进颗粒细胞增殖及雌激素的合成和分泌,抑制颗粒细胞凋亡及雄激素、孕激素的合成和分泌,进而促进卵泡的生长发育。 相似文献
5.
【目的】通过克隆鉴定梅山猪和杜洛克猪卵泡期第4天M2卵泡中差异表达的lncRNA-ALDBSSCT0000005583,分析其在猪颗粒细胞与miRNAs表达量的相关性,为探究lncRNA调控miRNA在母猪卵泡发育过程中的作用提供理论依据。【方法】对课题组前期在梅山和杜洛克M2卵泡中筛选出的差异表达lncRNA-ALDBSSCT0000005583,进行RT-qPCR验证,并利用RACE克隆其全长序列;根据编码潜力评估工具CPAT、CPC对该lncRNA的编码能力进行预测,原核表达试验进一步鉴定其编码能力;核质分离试验对lncRNA-ALDBSSCT0000005583进行亚细胞定位,RT-qPCR检测其在各组织中的表达水平;利用miRBase网站查找猪的miRNA数据库,结合RNAhybrid、miRanda在线软件预测与lncRNA-ALDBSSCT0000005583有相互作用的物种间保守miRNA,使用TargetScan和miRanda预测与lncRNA-ALDBSSCT0000005583具有相互作用miRNA的靶基因,并对其靶基因进行GO富集和KEGG信号通路分析;通过过... 相似文献
6.
【目的】 前期研究证实linc-NORFA作为母猪繁殖性状候选基因参与调控卵泡闭锁与卵泡颗粒细胞凋亡过程,进一步鉴定二花脸猪linc-NORFA核心启动子并分析其转录调控机制,为解析linc-NORFA介导猪卵泡闭锁的分子机制奠定理论基础并提供新的研究思路。【方法】 采集二花脸猪耳组织样品并提取基因组DNA,利用PCR扩增和测序技术获得二花脸猪linc-NORFA 5′调控区序列;通过构建缺失表达荧光报告载体并利用荧光素酶活性试验鉴定二花脸猪linc-NORFA核心启动子;利用生物信息学分析二花脸猪linc-NORFA核心启动子区序列特征与潜在的转录因子结合位点;构建猪FOXO1真核生物表达载体并进一步采用Western blot、qRT-PCR以及荧光素酶活性试验分析转录因子FOXO1过表达对二花脸猪linc-NORFA转录的影响;利用染色质免疫沉淀（ChIP）技术鉴定转录因子FOXO1与二花脸猪linc-NORFA核心启动子区的结合能力。【结果】 通过克隆测序与序列拼接共获得二花脸猪linc-NORFA 5′调控区序列1 734 bp,其中包含两个潜在的CpG岛;利用荧光素酶活性试验证实linc-NORFA核心启动子位于-988 — -684 bp（转录起始位点作为+1）,生物信息学分析表明二花脸猪linc-NORFA核心启动子上包含多个转录因子的结合元件,例如ESR2、FOXO1、E2F1、BRCA1以及NFIC等;另外,ChIP试验还证实在猪卵巢颗粒细胞中FOXO1作为转录因子直接靶向结合在linc-NORFA的核心启动子区;进一步通过试验证实FOXO1过表达可显著下调linc-NORFA核心启动子区活性（P<0.01）,同时显著抑制体外培养的猪卵巢颗粒细胞中linc-NORFA的表达（P<0.01）。【结论】 鉴定了二花脸猪linc-NORFA核心启动子区,同时证实FOXO1作为转录因子能够与linc-NORFA核心启动子区特异性结合,进而抑制后者的转录活性与表达。研究结果对探究linc-NORFA在猪卵泡闭锁过程中显著下调的分子机制具有重要意义。 相似文献
7.
《中国农业科学》2020,(17)
【背景】山羊第一卵泡波中的优势卵泡(dominant follicles, DF)和从属卵泡(subordinate follicles,SF)是整个卵泡发育过程中最为关键的两个阶段。随着卵泡的进一步发育,最终DF可能发育成为成熟卵泡,直到排卵;SF将走向闭锁,其中颗粒细胞的凋亡是导致卵泡发生闭锁的关键因素。然而目前对促进卵泡的优势化或导致其闭锁的分子机理尚不清楚。【目的】通过对山羊第一卵泡波中DF和SF颗粒细胞进行高通量测序,旨在筛选影响卵泡发育的关键基因,为深入探究卵泡发育的调控机制提供理论依据。【方法】选取10只1岁龄健康的贵州白山羊分别注射前列腺素F2α,使其同期发情,此后每天用B超检测并记录卵泡的生长情况,发情3 d后,统一屠宰并采集第一卵泡波中DF (直径4.5—6 mm)与SF (直径3—4.5 mm),分别分离其中的颗粒细胞,提取总RNA、构建文库后通过Illumina Hiseq 2500平台进行测序。利用FastQC对测序产出raw reads进行质量评估并经过过滤后,获得品质较高的clean reads;使用Trinity对得到的clean reads进行重新组装,从而获得unigenes;使用CLC Genomics Workbench将unigenes与山羊RefSeq数据库进行比对获得mRNA;使用DESeq2软件对获得的mRNA进行差异表达分析;分别采用goseq和kobas软件对得到的差异表达基因进行GO分析及KEGG信号通路分析;最终通过qRT-PCR对筛选出的可能影响卵泡发育的关键基因进行验证。【结果】分别对测序得到的raw reads进行过滤后,在DF颗粒细胞中获得43 217 934条clean reads,占raw reads的比例为95.19%;SF颗粒细胞中获得40 766 348条clean reads,占raw reads的比例为95.35%。将得到的unigenes与山羊的RefSeq数据库进行比对后,共得到33 896条带有注释的转录本,再通过设定FPKM1, q value0.05,共在两种卵泡颗粒细胞中获得13 644个基因。设定参数:FPKM≥1,SF-FPKM/DF-FPKM1,P0.05,获得695个差异表达mRNA,其中233个在SF颗粒细胞中表达显著上调,462个表达显著下调;对所获得695个差异表达mRNA进行GO功能富集分析,共分为三大类42组:其中生物学过程占47.6%,细胞组分占47.6%,分子功能占4.8%;KEGG信号通路分析,发现20条通路,其中与核糖体通路相关的基因富集最为显著。通过在Genecard中进行功能分析后,筛选6个可能与山羊卵泡发育密切相关的基因,其中PRLR、PTX3、RGN在SF颗粒细胞中表现为上调;DKK3、ALDH1A2、RARRES1则表现为下调。qRT-PCR显示PRLR、RGN、DKK3、ALDH1A2、RARRES1的表达趋势与高通量测序结果一致,且RGN在从属卵泡颗粒细胞中的表达量极显著地高于优势卵泡(P0.01);DKK3、ALDH1A2、RARRES1在优势卵泡颗粒细胞中的表达量极显著地高于从属卵泡(P0.01)。【结论】DKK3、ALDH1A2、RARRES1和RGN在优势卵泡和从属卵泡中表达量存在极显著差异,推测在山羊卵泡发育过程中可能促进卵泡的优势化或导致闭锁,对深入探究卵泡发育的调控机制具有重要意义。 相似文献
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研究猪卵泡期内有腔卵泡发育和闭锁中颗粒细胞自噬与凋亡、卵泡内调控因子、类固醇激素及相关酶类的变化,为提高排卵前卵泡发育数量提供理论依据。从猪卵泡期卵巢中分离3~5 mm有腔卵泡,根据发育变化分为健康卵泡、早期闭锁和晚期闭锁3类,应用HE染色观察内部形态结构变化,应用酶免法检测卵泡液中雌二醇(E2)和孕酮(P4)的浓度变化,采用Real-time PCR方法检测自噬相关基因(Becline、LC3B、ATG3、ATG5、ATG7)、凋亡相关基因(Caspase-3、Bim、Bcl-2和Bax)、类固醇合成酶基因(CYP11A1、3βHSD、CYP17A1、CYP19A3)、激素受体和卵泡内关键调控基因(FSHR、ERα、CART、SMAD4)在不同类型卵泡中的表达变化。结果表明,健康卵泡中颗粒细胞层完整,有少量凋亡细胞,早期和晚期闭锁卵泡中颗粒细胞层分散,且凋亡细胞明显增多。早期和晚期闭锁卵泡中P4/E2显著高于健康卵泡,自噬和凋亡相关基因的表达水平在早期和晚期闭锁的卵泡中显著高于健康卵泡,类固醇合成酶基因CYP11A1和3βHSD的表达量在早期和晚期闭锁卵泡中显著高于健康卵泡,CYP17A1、CYP19A3、FSHR、ERα和SMAD4的表达量在早期和晚期闭锁卵泡中显著低于健康卵泡,而CART的表达量则呈现相反的趋势。由此可见,颗粒细胞自噬和凋亡是卵泡闭锁的主要诱因,而类固醇合成酶基因CYP11A1和3βHSD通过提高卵泡液中孕酮的水平加速了卵泡闭锁的进程。 相似文献
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【背景】山羊第一卵泡波中的优势卵泡（dominant follicles, DF）和从属卵泡（subordinate follicles, SF）是整个卵泡发育过程中最为关键的两个阶段。随着卵泡的进一步发育,最终DF可能发育成为成熟卵泡,直到排卵;SF将走向闭锁,其中颗粒细胞的凋亡是导致卵泡发生闭锁的关键因素。然而目前对促进卵泡的优势化或导致其闭锁的分子机理尚不清楚。【目的】通过对山羊第一卵泡波中DF和SF颗粒细胞进行高通量测序,旨在筛选影响卵泡发育的关键基因,为深入探究卵泡发育的调控机制提供理论依据。【方法】选取10只1岁龄健康的贵州白山羊分别注射前列腺素F2α,使其同期发情,此后每天用B超检测并记录卵泡的生长情况,发情3 d后,统一屠宰并采集第一卵泡波中DF (直径4.5—6 mm)与SF (直径3 —4.5 mm),分别分离其中的颗粒细胞,提取总RNA、构建文库后通过Illumina Hiseq 2500平台进行测序。利用FastQC对测序产出raw reads进行质量评估并经过过滤后,获得品质较高的clean reads;使用Trinity对得到的clean reads进行重新组装,从而获得unigenes;使用CLC Genomics Workbench将unigenes与山羊RefSeq数据库进行比对获得mRNA;使用DESeq2 软件对获得的mRNA进行差异表达分析;分别采用goseq和kobas软件对得到的差异表达基因进行GO分析及KEGG信号通路分析;最终通过qRT-PCR对筛选出的可能影响卵泡发育的关键基因进行验证。【结果】分别对测序得到的raw reads进行过滤后,在DF颗粒细胞中获得43 217 934条clean reads,占raw reads的比例为95.19%;SF颗粒细胞中获得40 766 348条clean reads,占raw reads的比例为95.35%。将得到的unigenes与山羊的RefSeq 数据库进行比对后,共得到33 896条带有注释的转录本,再通过设定FPKM>1, q value<0.05,共在两种卵泡颗粒细胞中获得13 644个基因。设定参数：FPKM≥1,SF-FPKM/DF-FPKM>1,P<0.05,获得695个差异表达mRNA,其中233个在SF颗粒细胞中表达显著上调,462个表达显著下调;对所获得695个差异表达mRNA进行GO功能富集分析,共分为三大类42组：其中生物学过程占47.6%,细胞组分占47.6%,分子功能占4.8%;KEGG信号通路分析,发现20条通路,其中与核糖体通路相关的基因富集最为显著。通过在Genecard中进行功能分析后,筛选6个可能与山羊卵泡发育密切相关的基因,其中PRLR、PTX3、RGN在SF颗粒细胞中表现为上调;DKK3、ALDH1A2、RARRES1则表现为下调。qRT-PCR显示PRLR、RGN、DKK3、ALDH1A2、RARRES1的表达趋势与高通量测序结果一致,且RGN在从属卵泡颗粒细胞中的表达量极显著地高于优势卵泡（P<0.01）;DKK3、ALDH1A2、RARRES1在优势卵泡颗粒细胞中的表达量极显著地高于从属卵泡（P<0.01）。【结论】DKK3、ALDH1A2、RARRES1和RGN在优势卵泡和从属卵泡中表达量存在极显著差异,推测在山羊卵泡发育过程中可能促进卵泡的优势化或导致闭锁,对深入探究卵泡发育的调控机制具有重要意义。 相似文献
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《西南农业学报》2018,(11)
【目的】通过small RNA高通量测序技术,筛选绵羔羊和成年母羊差异表达miRNA,进一步挖掘和鉴定与卵泡发育相关的相关基因,揭示其性状差异的信号通路及分子调控网络。【方法】以绵羔羊和成年母羊颗粒细胞为研究对象,应用高通量测序技术进行small RNA文库构建,获得miRNA表达谱,鉴定差异表达miRNA,进而对这些差异表达miRNA及其靶基因进行功能注释、聚类分析及通路富集等。【结果】从2个样本miRNA库鉴定出238个已知miRNAs和79个新miRNAs。共获得9个差异miRNA,与成年羊相比,羔羊有4个miRNA上调,5个下调。其中,oar-miR-106a上调倍数最大(1. 85),oar-miR-10a下调最为显著(-2. 20)。对差异miRNAs进行GO富集和KEGG通路富集分析表明,新陈代谢途径富集的基因最多。利用qRT-PCR对5个随机挑选的miRNA进行验证,结果与测序数据一致,说明测序结果可靠。【结论】miRNAs可能在激素处理后对绵羊生殖生理中起着重要的作用,包括卵泡和卵母细胞的发育,颗粒细胞的增殖等。 相似文献
11.
【背景】卵泡是卵巢的基本结构和功能单位,其主要功能是排卵和分泌激素。颗粒细胞能促进卵泡发育,其过度凋亡能抑制卵泡发育,诱导卵泡闭锁,进而降低雌性动物发情频率,影响雌性动物繁殖力。现已有研究发现,KISS1在卵巢组织中发挥着重要作用。【目的】研究通过干扰KISS1,以阐释KISS1对猪卵巢颗粒细胞凋亡、周期及分泌雌激素能力的影响,为完善KISS1在猪颗粒细胞中的分子调控机制提供一定的依据。【方法】设计KISS1的干扰片段KISS1-siRNA,转染体外培养的母猪卵巢颗粒细胞,通过实时定量PCR（quantitative real time PCR, qRT-PCR）检测干扰KISS1对母猪卵巢颗粒细胞中磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide 3-kinase, PI3K）信号通路部分基因转录水平的影响;采用流式检测法、Annexin V- FITC及ELISA技术,分别探究干扰KISS1对颗粒细胞周期、凋亡及雌二醇（estradiol, E2）分泌量的影响,最后使用qRT-PCR技术检测KISS1对雌激素受体及雌激素信号通路关键基因转录水平的影响。【结果】在猪颗粒细胞内,干扰KISS1后,PI3K通路激活相关基因PIK3CG、PI3CI、PDK1及AKT1转录水平下降,其中关键基因AKT1的转录水平显著降低（P<0.05）,PI3K通路激活抑制相关基因FOXO3、TSC2及BAD转录水平也有所降低;干扰KISS1后,颗粒细胞周期在细胞分裂间期（G0/ G1）阻断,细胞的凋亡率显著上升,细胞中E2的浓度显著降低（P<0.01）,雌激素受体ESR1和ESR2及雌激素通路的基因Star、CYP17、3B-HSD、17B-HSD和CYP19A转录水平也相应显著下降（P<0.05）。【结论】KISS1能够参与猪颗粒细胞PI3K和雌激素通路,干扰KISS1能够使卵巢颗粒细胞阻滞在细胞分裂间期,促进颗粒细胞凋亡,降低颗粒细胞分泌雌激素的能力,表明KISS1对于卵巢颗粒细胞的分裂与生长、雌激素分泌具有重要作用。 相似文献
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【目的】探讨胰岛素样生长因子-I（IGF-I）对产蛋鸡等级前卵泡发育的影响。【方法】用免疫组化和RT-PCR法检测IGF-I受体在鸡等级前卵泡中的表达,研究IGF-I对鸡早期卵泡发育的影响。【结果】IGF-I受体在等级前卵泡颗粒层和膜层均有表达,且随着卵泡的发育其表达水平逐渐增高,在小黄卵泡(SYF)阶段达到最大;同时,卵泡体外培养结果表明IGF-I（100 ng•mL-1）、FSH（10 n•mL-1）及IGF-I+FSH处理可显著增加SYF中膜层和颗粒层的厚度及细胞密度,且IGF受体在颗粒层和膜层中的表达水平也显著增加,其中以IGF-I+FSH联合处理组的效果最为显著。【结论】IGF-I能显著提高产蛋鸡SYF颗粒层和膜层的细胞数目以及厚度,同时增加IGF-I受体的表达,并可与FSH联合作用以提高IGF受体的表达,促进鸡卵泡细胞的增殖,进而调节鸡等级前卵泡的发育,此结果有助于揭示家禽卵泡发育的局域性内分泌调节作用。 相似文献
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【目的】探讨在水牛中增殖细胞核抗原（PCNA）参与卵泡发生的时期及其在卵巢组织不同时期卵泡中的表达定位;【方法】采用石蜡切片结合免疫组化的方法对PCNA在卵巢组织中进行定位,利用实时荧光定量PCR（QRT-PCR）技术检测PCNA在腔前卵泡中的表达情况。【结果】免疫组化结果显示：原始卵泡中的卵母细胞能检测到PCNA的表达,但颗粒细胞并未观察到PCNA的免疫染色;初级卵泡到次级卵泡,卵母细胞和颗粒细胞中均可检测到PCNA的表达,且在颗粒细胞中的表达有增强的趋势;有腔卵泡中,颗粒细胞、卵泡膜细胞及包围卵母细胞的卵丘细胞中都能观察到很强的免疫染色。定量表达检测结果显示：PCNA在原始卵泡、初级卵泡及次级卵泡中的表达呈上升趋势,并且有显著差异（43.50333±0.138338 vs 1.633804±0.093796 vs 1±0.012219 , P<0.01）;【结论】从初级卵泡开始在颗粒细胞中能检测到PCNA的表达,并且其表达随着卵泡的发育有明显的增强趋势,腔前卵泡中PCNA表达的QRT-PCR测定结果与免疫组化结果相一致,研究结果为阐明PCNA参与卵泡发生的分子调控机制奠定了基础。 相似文献
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【目的】BCL2L11在哺乳动物中能够促进多种细胞凋亡,同时参与繁殖性状相关组织器官的发育及疾病治疗,文章利用分子生物学方法探究miR-221-3p靶向调控BCL2L11对小尾寒羊卵泡颗粒细胞凋亡的影响,为进一步研究BCL2L11在卵泡颗粒细胞凋亡和卵泡闭锁过程中的调控作用提供依据。【方法】在前期课题组卵巢组织全转录组测序分析的基础上,获得了候选基因BCL2L11及其调控元件miR-221-3p,利用半定量和组织荧光定量（RT-qPCR）分析BCL2L11在小尾寒羊不同组织中的表达情况;通过RT-qPCR定量试验在小尾寒羊卵泡期和黄体期卵巢组织中鉴定了BCL2L11及miRNA-221-3p的表达情况;构建BCL2L11 3’UTR野生型和突变型载体,在HEK293T细胞中共转染miR-221-3p mimic和BCL2L11野生型和突变型及阴性对照,采用双荧光素酶报告基因检测系统确定miR-221-3p与BCL2L11靶向性关系;在绵羊卵巢原代颗粒细胞中转染miR-221-3p mimic及阴性对照实现miR-221-3p过表达,使用RT-qPCR技术在mRNA水平上检测miR-221-3p对BCL2L11以及卵巢颗粒细胞凋亡标志基因XIAP和Fas表达水平的影响;同时利用EdU试验分析miR-221-3p过表达和阴性对照组中颗粒细胞的增殖变化。【结果】半定量和组织RT-qPCR分析均表明BCL2L11在卵巢组织中表达量高于其他组织;RT-qPCR定量结果显示miR-221-3p和 BCL2L11在小尾寒羊卵泡期和黄体期卵巢组织中差异表达,miR-221-3p在卵泡期卵巢中的表达量高于黄体期,而BCL2L11在卵泡期卵巢中的表达量低于黄体期,表现出负调控的现象;双荧光素酶报告基因验证分析显示,过表达miR-221-3p mimic显著抑制了BCL2L11 3’UTR荧光素酶的活性（P<0.05）,阴性对照组则没有显著影响;过表达miR-221-3p,靶基因BCL2L11 mRNA表达水平显著降低,同时,卵泡颗粒细胞凋亡标志基因XIAP和Fas的表达量也显著降低（P<0.05）;EdU试验分析显示,过表达miR-221-3p的颗粒细胞增殖率为18.9%,极显著高于阴性对照组的10.43%（P<0.01）。【结论】BCL2L11和miR-221-3p是调控绵羊卵巢发育的重要基因及调控元件,BCL2L11是miR-221-3p的靶基因之一,miR-221-3p过表达可抑制颗粒细胞凋亡,该作用结果可能通过抑制靶基因BCL2L11的表达进而影响了绵羊卵巢颗粒细胞的凋亡。 相似文献