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1.
为制备犬瘟热病毒(CDV)F蛋白融合信号肽(FSP)的单克隆抗体(MAb)，本研究通过原核表达系统表达CDV HLJ1-13株重组FSP蛋白(rFSP)。将其免疫BALB/c小鼠，通过间接ELISA方法筛选到1株能够稳定分泌抗FSP蛋白MAb的杂交瘤细胞株G8D6E3E5，亚类鉴定结果显示该株MAb重链为Ig G2a型，轻链为κ型。构建一系列表达部分重叠的重组FSP片段，经western blot鉴定该株MAb识别的抗原区域为aa1～aa55，通过合成一系列重叠多肽，经ELISA进一步鉴定该株MAb识别的抗原表位为21QQHSTRSTET30。采用western blot检测该株MAb与r FSP的反应原性；采用间接免疫荧光试验(IFA)检测该株MAb与天然FSP的反应原性。Western blot结果显示，CDV Snyder Hill和HLJ1-13株r FSP蛋白样品在34 ku左右均出现特异性条带；IFA结果显示，感染CDV Snyder Hill株48 h后的vero细胞出现红色荧光。以上结果表明，该株MAb既能够与原核表达的CDV... 相似文献
2.
p54蛋白是非洲猪瘟病毒(ASFV)进入宿主细胞的重要结构蛋白，参与病毒的早期感染，具有较强的免疫原性，常作为研制非洲猪瘟(ASF)疫苗和检测方法的重要靶点。为制备ASFV p54蛋白的单克隆抗体(MAb)，本研究通过构建重组质粒p ET28a-p54并经原核表达重组p54蛋白(rp54)，采用镍柱亲和层析方法对rp54纯化后经SDS-PAGE鉴定。结果显示，rp54主要在沉淀中出现17 ku的目的条带，经纯化效果较好。采用纯化的rp54免疫BALB/c小鼠，三免后采用间接ELISA方法测定小鼠血清的抗体效价。选择抗体效价最高的小鼠冲击免疫，3 d后取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，通过间接ELISA筛选稳定分泌p54蛋白MAb的杂交瘤细胞。结果显示，三免后小鼠血清抗体效价最高达1∶256 000，表明该蛋白的免疫原性很好。间接ELISA筛选结果显示，获得了3株稳定分泌p54蛋白MAb的杂交瘤细胞株。分别采用western blot、间接免疫荧光试验(IFA)检测该3株MAb的反应原性，采用间接ELISA检测3株MAb的特异性。Western blot结果显示，3株MAb均在... 相似文献
3.
为制备针对蓝舌病病毒(BTV)的单克隆抗体(MAb),本研究利用血清型1型BTV(BTV1)免疫BALB/c鼠,将其脾淋巴细胞与SP2/0进行融合,并用BTV1包被ELISA板,通过间接ELISA方法筛选出3株稳定分泌抗BTV1的MAb的杂交瘤细胞株(2B10、3D4和4H8)。利用表达BTV1主要蛋白的真核表达重组质粒转染BHK-21后,对所制备的杂交瘤细胞株上清进行间接免疫荧光(IFA)以及western blot鉴定,结果显示:2B10和4H8与VP7蛋白反应,而3D4与VP6蛋白反应。同时,IFA鉴定结果进一步表明,3株MAb与24个血清型的BTV均可以发生反应。本研究制备的MAb为建立BTV免疫学检测方法和相关病毒蛋白的功能研究奠定了基础。 相似文献
4.
利用真核表达的猪流感病毒NP蛋白制备其特异性的单克隆抗体 总被引：1，自引：0，他引：1
为制备猪流感病毒(SIV)核蛋白(NP)单克隆抗体(MAb),本研究将重组质粒pMD-NP中含有的SIVNP基因亚克隆于pCAGGS真核表达质粒中,获得重组质粒pCAGGS-NP,将其转染293T细胞,通过间接免疫荧光(IFA)和western blot检测表明NP蛋白在293T细胞中获得了表达。将pCAGGS-NP以100μg/只剂量免疫4周龄～5周龄BALB/c小鼠,3次免疫后,利用杂交瘤细胞融合技术获得1株稳定分泌抗SIVNP的MAb杂交瘤细胞株(3D7);该MAb经Ig亚类鉴定为IgM,轻链为κ链,其诱导小鼠产生的腹水ELISA效价为1:105;纯化3D7腹水并对其进行亲和力及抗原结合活性的测定,ELISA曲线图显示亲和力常数为1.02×106M-1,IFA结果显示其可与H1N1、H3N2、H9N2亚型SIV发生特异性反应,具有良好的反应活性。该MAb的制备将为进一步建立猪流感的诊断方法以及分析NP蛋白抗原表位等方面的研究奠定基础。 相似文献
5.
为制备抗高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV) GP3株的单克隆抗体(MAb),本研究将HP-PRRSV HuN4株免疫BALB/c小鼠,以该病毒感染的细胞及真核表达的GP3蛋白为检测抗原,经间接免疫荧光(IFA)筛选获得了一株稳定分泌MAb的细胞株,命名为4G5.抗体亚类鉴定重链类型为IgG1,轻链类型为K.该MAb细胞培养上清及腹水IFA效价分别为1∶256和1∶1 280.IFA结果显示,MAb 4G5能够识别CH-1R、JXA1-R、HP-PRRSV HuN4株及其疫苗株HuN4-F112,而不识别RespPRRS MLV病毒株.Western blot结果显示,4G5与HP-PRRSV HuN4株及原核表达的GP3蛋白均可以反应,表明其针对的抗原表位为线性表位,中和试验结果显示该MAb无中和活性.通过截短表达GP3蛋白鉴定该MAb抗原表位识别序列为74WCRIGHDRCS83.本研究获得的MAb为进一步研究HP-PRRSV GP3蛋白的结构及功能奠定了基础. 相似文献
6.
为制备猪流行性腹泻病毒(PEDV)抗M蛋白单克隆抗体(MAb),本研究以截短表达的His-M重组蛋白免疫BALB/c小鼠;以截短表达的GST-M重组蛋白作为包被抗原,采用常规的淋巴细胞杂交瘤技术制备杂交瘤细胞,通过间接ELISA进行筛选,得到一株稳定分泌抗M蛋白MAb.MAb亚类鉴定为IgG2b型,轻链为к链,杂交瘤细胞培养上清和诱导的小鼠腹水抗体效价分别为1:3000和1:2×105.Western blot试验表明该MAb能够识别重组及天然的PEDV M蛋白.间接免疫荧光试验表明该MAb能够与PEDV感染的Vero E6细胞产生特异性免疫荧光. 相似文献
7.
《中国预防兽医学报》2019,(3)
为了制备具有阻断能力的抗猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的单克隆抗体(MAb),本研究以PRRSV SD53株感染Marc-145细胞后的上清作为免疫原免疫BALB/c雌鼠,筛选获得一株稳定分泌抗PRRSV MAb的杂交瘤细胞株(1H4)。鉴定结果显示,1H4 MAb是Ig G1亚类,轻链为κ链。1H4细胞上清经间接免疫荧光(IFA)检测其效价是1∶40,腹水的IFA效价是1∶3 200。阻断ELISA试验显示1H4 MAb与病毒的结合能够被PRRSV阳性血清阻断。Western blot试验显示1H4 MAb可以特异性识别PRRSV的N蛋白,经截短表达N蛋白鉴定该MAb的抗原识别序列为N蛋白末端aa 107～aa 123。该抗原表位在美洲型PRRSV中高度保守,该MAb的制备为进一步建立特异性强、灵敏度高的PRRSV阻断ELISA检测方法奠定了基础。 相似文献
8.
猪圆环病毒3型Cap蛋白单克隆抗体的制备及其在免疫组化试验中的初步应用 总被引：1，自引：0，他引：1
为制备猪圆环病毒3型(PCV3)Cap蛋白单克隆抗体(MAb),并初步应用于感染细胞或组织样品中PCV3抗原的间接免疫荧光试验(IFA)或免疫组化(IHC)检测,本研究将PCV3 Cap蛋白的去核定位信号肽基因克隆于原核表达载体pET-28a中,经IPTG诱导表达了具有免疫原性的融合蛋白。以表达的重组蛋白免疫BALB/c小鼠,共获得8株能够稳定分泌针对PCV3 Cap蛋白的MAb杂交瘤细胞株。Western blot与IFA试验结果显示,8株MAbs均能够与真核表达的重组Cap蛋白反应。选取3株杂交瘤细胞制备3株MAbs,小鼠腹水效价分别为1∶409 600、1∶204 800和1∶409 600。利用3株MAbs对自然感染PCV3临床病猪的腹股沟淋巴结进行IHC检测,结果显示3株MAbs的腹水均能够与感染PCV3的临床样品发生特异性的免疫反应。本研究制备的MAbs具有较好的特异性,为深入研究Cap蛋白的结构和PCV3快速诊断奠定了基础。 相似文献
9.
抗牛边缘无浆体MSP5单克隆抗体的制备 总被引：2，自引：1，他引：1
为制备抗牛边缘无浆体膜表面蛋白(MSP5)单克隆抗体(MAb),以原核表达的重组MSP5蛋白(rMSP5)免疫BALB/c鼠,应用常规杂交瘤技术获得2株能稳定分泌特异性MAb的杂交瘤细胞株(1D8和2F3).间接ELISA检测腹水效价分别为5.49×105和7.83×104,亚类鉴定其重链为分别为IgG2b和1gG2a,轻链均为K型;ELISA叠加试验表明这2株MAb识别的抗原位点相同或相近;Western blot结果显示2株MAb均能与rMSP5发生反应.特异性抗MSP5的MAb的获得,为牛边缘无浆体检测奠定了基础. 相似文献
10.
为建立鹿源牛病毒性腹泻-粘膜病病毒(BVDV)检测方法,本研究制备了抗鹿源BVDV特异性单克隆抗体(MAb)。用纯化的BVDV免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,经3次有限稀释法克隆和间接ELISA法筛选,获得2株稳定分泌MAb的杂交瘤细胞株2A3和4B12。通过间接ELISA检测,MAb效价为:上清液及腹水分别为1∶512、1∶640和1∶12800、1∶16000;MAb的亚类鉴定结果表明,2株杂交瘤细胞分泌的抗体亚类均为IgGl亚类;经ELISA测定,2A3和4B12与BVDVC24V株、HCV、BDV、PRV均不发生交叉反应,但与BVDVCCSYD株发生交叉反应;IFA试验结果显示,4B12和2A3与接种BVDVN71株病毒液的细胞反应产生较强的特异荧光;抗原识别位点分析结果表明,2A3和4B12两株MAb所识别的抗原位点相同。这两株MAb的获得为鹿BVDV的检测方法的建立奠定良好的基础。 相似文献
11.
Mx蛋白为GTP酶动态蛋白家族成员,已被证明具有抗禽流感病毒、Thogoto病毒和水泡性口膜炎病毒等的作用.为制备鸡Mx蛋白的单克隆抗体(MAb),本研究以原核表达并纯化的鸡Mx蛋白为免疫原,免疫BALB/c小鼠,分离脾细胞与SP2/0细胞融合,采用间接ELISA方法筛选阳性克隆,经3次细胞克隆纯化后获得4株稳定分泌抗鸡Mx蛋白抗体的杂交瘤细胞株.间接ELISA测定4株MAb纯化后腹水的效价介于1∶3.2×104～1∶2.5×105之间.Westem blot结果证实4株MAb均具有良好的反应性;间接免疫荧光试验表明其中一株MAb与真核表达的鸡Mx蛋白发生反应.本研究为鸡Mx蛋白功能及表达鸡Mx蛋白的转基因动物等研究奠定了基础. 相似文献
12.
为制备针对沙门菌Pho N蛋白的单克隆抗体(MAb)，并以其制备沙门菌的免疫磁珠，本研究构建了重组原核表达质粒p Cold I-pho N和p GEX-6P-1-pho N，利用大肠杆菌系统表达并通过亲和层析纯化了鼠伤寒沙门菌重组蛋白His-Pho N和GST-Pho N，分别作为免疫原和筛选抗原，利用B淋巴细胞杂交瘤技术，经间接ELISA方法筛选获得5株能稳定分泌Pho N蛋白MAb的杂交瘤细胞株，分别为8H2、11E5、4B2、8F2、3B2。采用亚类鉴定试剂盒、间接ELISA和western blot方法分别鉴定各MAb的亚型、效价及特异性结合沙门菌Pho N蛋白的能力，结果显示，5株MAb的亚型均为Ig G2a，测定其效价达1∶4 096 000以上，均能特异性结合His-PhoN和GST-Pho N，而不与His-OmpC、His-OmpF蛋白反应，表明MAb特异性较好。选取4B2 MAb进一步分析其对不同血清型沙门菌和非沙门菌的特异性，western blot结果显示4B2 MAb仅特异性识别不同血清型沙门菌，而不与大肠杆菌、志贺杆菌、空肠弯曲菌和单核细胞增生李斯特菌反应；... 相似文献
13.
为获得抗猪分泌型IgA(SIgA)的单克隆抗体(MAb),本研究以纯化的SIgA蛋白为抗原,免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0细胞融合,通过间接ELISA方法筛选出1株稳定分泌抗SIgA SC片段的杂交瘤细胞株,命名为2F9。MAb亚类鉴定结果显示其亚类为IgG1/κ链。杂交瘤细胞培养上清液和腹水的效价分别为1∶200和1∶16 000。Western blot鉴定显示该MAb能够识别天然SIgA蛋白;IFA显示该MAb可以识别真核细胞表达的SIgA SC蛋白。抗猪SIgA SC片段的MAb制备,为建立一系列猪消化道病原的特异性SIgA诊断方法及研究黏膜免疫提供了重要工具,具有广阔的应用前景。 相似文献
14.
研究旨在表达流行性出血病病毒（EHDV） VP7蛋白并制备其多克隆抗体，为EHDV检测方法的建立提供材料。试验通过大肠杆菌进行VP7重组蛋白的诱导表达，通过镍离子亲和层析与透析进行重组蛋白的纯化与复性并免疫家兔制备多克隆抗体，通过间接ELISA、Western blotting与间接免疫荧光试验（IFA）分析多克隆抗体的效价与反应原性。结果显示，在37℃与IPTG （0.1 mmol/L）的诱导下，VP7重组蛋白（分子质量46 ku）以包涵体形式高效表达，纯化与复性处理后的重组蛋白纯度达94.52%，可与不同血清型的EHDV阳性血清特异性结合。制备的兔抗VP7蛋白多克隆抗体效价达1∶24 000；以制备的多克隆抗体为一抗，通过IFA与Western blotting检测到EHDV感染细胞中VP7蛋白的表达。本研究在大肠杆菌中实现了EHDV VP7蛋白的高效表达，制备的兔抗VP7蛋白多克隆抗体具有良好的反应原性与特异性，为EHDV诊断抗原的制备与血清学检测方法的建立提供了试验材料。 相似文献
15.
禽腺病毒血清4型Fiber2蛋白单克隆抗体制备及其抗原表位鉴定 总被引：2，自引：1，他引：1
旨在制备禽腺病毒血清4型（FAdV-4）纤突蛋白（Fiber2）的特异性单克隆抗体（MAb）,本研究将原核表达的可溶性重组蛋白NusA-Fiber2作为免疫原免疫BALB/c雌鼠,筛选获得3株能稳定分泌抗FAdV-4 Fiber2蛋白MAb的杂交瘤细胞株2G5、2G8、4C2,取细胞株2G5制备腹水并纯化,利用间接免疫荧光试验（immunofluorescence assay,IFA）和Western blot鉴定该单抗的特异性。用制备的单抗包被酶标板,通过一系列的优化,建立了FAdV-4 Fiber2双抗夹心ELISA检测方法。通过逐步截短分析鉴定出单克隆抗体识别的抗原表位区域。结果表明：成功获取3株单克隆细胞株2G5、2G8、4C2。MAb 2G5可与原核表达纯化的Fiber2蛋白及FAdV-4特异性反应。建立的双抗夹心ELISA检测方法具有很好的特异性、灵敏性和重复性。该MAb识别的表位序列是N端aa1—33。本研究成功制备了具有良好Western blot和IFA反应原性的单克隆抗体,为Fiber2蛋白功能研究和FAdV-4新型表位疫苗商品化研发奠定了基础。 相似文献
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为制备牛副流感病毒3型(BPIV3)核衣壳蛋白(NP)单克隆抗体(MAb),本研究利用原核表达并纯化的重组NP (rNP)免疫BALB/c小鼠,取免疫后小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合.采用以BPIV3为检测抗原的间接ELISA方法筛选阳性细胞克隆,经3次克隆纯化后获得1株稳定分泌抗NP特异性MAb的杂交瘤细胞株(5E5)并制备腹水,采用rNP及BPIV3包被的ELISA效价分别是2×106和1.28×105.间接ELISA、western blot、IFA试验表明该MAb具有良好的反应性和特异性.经抗体亚类鉴定该MAb亚类为IgGl/κ.特异性试验表明该MAb不与牛传染性鼻气管炎病毒、牛病毒性腹泻病毒反应.免疫组化试验表明该MAb可以检测BPIV3感染动物体内的病原.该MAb还可用于建立检测BPIV3病原及抗体的诊断方法,同时为研究NP的结构和功能提供了条件. 相似文献
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为获得鸡传染性支气管炎病毒(Avian infectious bronchitis virus, IBV)N蛋白的单克隆抗体,通过原核表达IBV N蛋白,纯化后作为免疫原免疫BALB/c小鼠,并按常规方法制备杂交瘤细胞。经ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞,经过3次亚克隆获得3株杂交瘤细胞株,命名为1#、18#、19#,并进行了抗体亚类的鉴定、Western-blot和IFA检测。结果显示：制备的3株单克隆抗体亚型均为IgG1,Western-blot和IFA试验结果表明单克隆抗体均能与IBV发生特异性反应而与其他禽病常见病毒均无交叉反应。本研究成功制备了IBV单克隆抗体,为进一步建立IBV检测方法和深入研究IBV的生物学特性奠定了基础。 相似文献
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旨在制备抗丝状支原体丝状亚种(Mmm)的特异性单克隆抗体(MAb),为牛传染性胸膜肺炎(CBPP)病原诊断的免疫学方法提供特异性抗体。本研究利用生物信息学技术分析了Mmm国内分离株Ben-1不同传代株的全基因组序列,选取M0071蛋白作为研究对象。将原核表达的可溶性重组蛋白M0071(rM0071)作为免疫原免疫BALB/c小鼠,通过有限稀释法和间接ELISA方法筛选得到能稳定分泌抗rM0071蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株。进一步制备单抗腹水并纯化,利用Western blot方法对该单抗进行特异性鉴定,同时测定其抗体效价和抗体亚类。随后利用间接免疫荧光试验(IFA)评价该单抗对细胞感染Mmm的检测能力。结果表明成功获得1株单克隆细胞株3C4A1,将其分泌抗体命名为MAb 3C4A1。特异性结果表明,MAb 3C4A1能与Mmm的分离株和标准株发生特异性反应,而不与山羊支原体山羊肺炎亚种、丝状支原体山羊亚种、牛鼻支原体、无乳支原体、牛支原体、leachii支原体和牛A型巴氏杆菌等发生反应。抗体亚类鉴定MAb 3C4A1属于IgG1亚类、轻链为κ链。经间接ELISA测定其抗体效价为1∶256 000。IFA试验结果表明,MAb 3C4A1仅与感染EBL细胞的Mmm发生绿色荧光反应,而与牛鼻支原体、无乳支原体、牛支原体感染的细胞不发生荧光反应,特异性良好。本研究制备的MAb 3C4A1具有良好的特异性和免疫反应性,可作为CBPP病原免疫学诊断的工具,为进一步研制CBPP病原鉴别诊断试剂盒提供了基础材料。 相似文献
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以真核表达的猪圆环病毒2型（PCV2）Cap蛋白所形成的病毒样颗粒作为免疫原,按照常规方法免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与骨髓瘤细胞融合。经间接ELISA法和间接免疫荧光试验（IFA）筛选,总共获得了4株分泌抗PCV2 Cap蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为7A6、3F2、3B7、1A6。4株单抗腹水效价均达到1:105。IFA和免疫过氧化物酶单层实验结果显示,4株单抗均能与PCV2发生特异反应,与PCV1无交叉反应。PCV2 Cap蛋白单克隆抗体的制备,为猪圆环2型病毒抗原表位分析及其相关抗原抗体诊断试剂盒的研制奠定了基础。 相似文献
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《畜牧与兽医》2018,(12)
为了制备H5N6亚型禽流感病毒(AIV)的单克隆抗体(MAb),采用纯化的H5N6 AIV免疫BALB/c鼠,利用淋巴细胞杂交瘤技术制备杂交瘤细胞,通过间接ELISA方法进行筛选,获得2株能稳定分泌抗NP蛋白的杂交瘤细胞,分别命名为3D9和2B10。间接ELISA检测2株杂交瘤细胞培养上清液抗体效价分别为1∶1×10~3和1∶1×10~4,腹水的抗体效价分别达到1∶1×10~5和1∶1×10~6; 3D9和2B10亚类鉴定重链为IgM,轻链为κ链; Western blot分析表明,2株杂交瘤细胞上清均能与不同的AIV感染的尿囊液在56 kD处发生特异性反应,并能与原核表达的重组NP蛋白发生特异性反应;间接免疫荧光试验显示,2株单克隆抗体均能与不同的AIV感染的MDCK细胞产生特异性反应。以上结果表明,本研究针对H5N6 AIV的NP蛋白制备了2株单克隆抗体,且都具有较好的特异性、保守性和广谱性,为今后禽流感诊断方法的开发奠定了基础。 相似文献