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近十多年来,随着分子生物学(包括基因工程、蛋白质工程)的飞速发展及人们对生物免疫系统认识的不断深入,抗体技术已从细胞工程抗体(杂交瘤技术)进入了分子重组抗体即基因工程抗体时代. 相似文献
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用血卵涡鞭虫可溶性抗原免疫BALB/c小鼠,经常规融合、间接ELISA方法筛选,将所得阳性克隆再经3次亚克隆后,共获得3株针对血卵涡鞭虫的单克隆抗体(2B2、3G4、4G7),单克隆抗体亚类鉴定表明,三者为IgG类抗体。用筛选的杂交瘤细胞株制备小鼠腹水抗体,其细胞上清及腹水效价分别为5.12×10-4和8.00×10-4。进一步利用单克隆抗体建立间接荧光抗体方法对单抗特异性进行鉴定,阳性虫体被染上黄绿色荧光,而正常梭子蟹血淋巴则未被染色。用单克隆抗体和多克隆兔抗血清以羊抗鼠HRP-IgG为酶标抗体,建立了检测血卵涡鞭虫的双抗体夹心ELISA方法,该方法对血卵涡鞭虫阳性标本检测符合率为100%。结果表明,制备的单克隆抗体效价高、特异性好,可用于血卵涡鞭虫的早期临床诊断。 相似文献
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病毒性出血性败血症病毒单链抗体的原核表达及其功能鉴定 总被引：1，自引：1，他引：0
为制备病毒性出血性败血症病毒(VHSV)单链抗体(single chain variable fragment antibody,ScFv)并鉴定其生物学功能,本研究提取抗VHSV单抗1G5的杂交瘤细胞株总RNA并反转录获得cDNA模板,通过PCR扩增VHSV抗体的轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)编码序列,将其拼接成单链抗体Sc Fv基因后插入载体pET28a中,构建原核表达重组质粒并在大肠杆菌中诱导表达。结果表明,单链抗体主要以可溶性形式表达,分子量约28 ku,能特异性识别VHSV病毒的G蛋白并对VHSV病毒具有体外中和活性,其对VHSV病毒的G蛋白亲和力(KD)达到1.4×10~(–8) M。单链抗体ScFv的制备为进一步研究VHSV的治疗性抗体、快速诊断试剂奠定了基础。 相似文献
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杀香鱼假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)是大黄鱼(Larimichthys crocea)内脏白点病的主要致病菌,为制备能识别杀香鱼假单胞菌的特异性抗体,采用固相化抗原筛选方法,以杀香鱼假单胞菌重组溶血素共调节蛋白为抗原,从兔天然噬菌体scFv文库中筛选出特异性的单链抗体(scFv);通过构建含有针对杀香鱼假单胞菌单链抗体(scFv)的重组质粒,对筛选出的scFv进行原核诱导表达。通过4轮淘选,共获得16株针对杀香鱼假单胞菌溶血素共调节蛋白的单链抗体(scFv),通过亲和力分析,最终筛选出7株特异性较高的单链抗体(scFv)进行原核表达;成功构建了含有抗杀香鱼假单胞菌溶血素共调节单链抗体(scFv)的重组质粒pET-30a-Hcp-scFv,转化到大肠杆菌表达菌株中,其中6个重组质粒可稳定表达,经过蛋白质可溶性分析和Western Blot鉴定,目的蛋白主要以包涵体的形式存在。研究结果为快速制备大量抗杀香鱼假单胞菌抗体提供了一种简便的方法,为今后大黄鱼内脏白点病的临床快速诊断奠定了基础。 相似文献
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一种基于Ⅱ型鲤疱疹病毒衣壳蛋白72的免疫学检测方法 总被引：4，自引：1，他引：3
Ⅱ型鲤疱疹病毒(cyprinid herpesvirus 2,Cy HV-2)是引起养殖异育银鲫(Carassius auratus gibelio)造血器官坏死症的致病病原。在临床筛查中基于病毒核酸的PCR和real time PCR技术已经建立,但是稳定性更强的免疫学诊断技术国内外尚无报道。本研究目的是利用Cy HV-2编码的ORF72基因(Gen Bank登录号:AFJ20502.1)所编码的衣壳蛋白作为捕获抗原,通过识别感染病毒的鱼体中的相应抗体,从而对样本进行临床免疫学检测。首先采用PCR方法从纯化的Cy HV-2基因组中扩增ORF72基因,并把该基因克隆至原核表达载体PGEX-4T-3,并转化到大肠杆菌中诱导表达,诱导表达的产物通过SDS-PAGE进行鉴定,对表达的重组蛋白进行纯化。用已纯化的72重组蛋白对小鼠进行免疫,制得72重组蛋白的抗体。Western blot检测表明所制备的多克隆抗体既能识别原核表达的重组蛋白,也可以识别Cy HV-2病毒粒子上的衣壳蛋白72。在上述基础上建立了基于Western blot技术的Cy HV-2抗体检测技术:用纯化的72重组蛋白作为检测抗原,鲫鱼血清用作一抗,兔抗鲫Ig M多克隆抗体作为二抗,酶标羊抗兔作为三抗鉴定鲫鱼是否存在Cy HV-2特异性抗体。在对急性感染期的临床样本检测中,本方法能在所有样本中检测出ORF72特异性抗体存在,表明72重组蛋白作为相应抗体捕获原可以用于确诊鲫鱼是否感染Cy HV-2。本研究建立的实验室免疫学检测方法为商品化免疫学检测技术的开发奠定了基础,对Cy HV-2的检验检疫具有一定的临床应用价值。 相似文献
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红笛鲷头肾消减cDNA文库的构建与分析 总被引：2，自引：0，他引：2
应用抑制性消减杂交技术(SSH)构建红笛鲷(Lutjanus sanguineus)头肾消减cDNA文库,筛选红笛鲷免疫相关基因的EST.以哈氏弧菌(Vibrio harveyi)灭活疫苗体内诱导红笛鲷为实验组,以注射无菌生理盐水的红笛鲷为驱动组,通过SSH技术构建红笛鲷头肾消减.DNA文库.利用PCR技术和斑点杂交对文库进行筛选,从2 424个含插人片段的阳性克隆中筛选了680个克隆在上海生工进行了序列测定.使用BLASTx和BLASTn工具对获得的ESTs与GenBank数据库进行同源性比较并根据相似性序列的名称通过GO法对ESTs进行注释.结果获得了30个与红笛鲷免免疫防御相关基因的EST,如组织相容性抗原复合物基因(MHC I和MHCII),免疫球蛋白基因(IgH和IgL)、热休克蛋白基因(HSP10,HSP70和HSP90)等.本研究构建了哈氏弧菌灭活疫苗免疫后与正常组织差异表达的消减cDNA文库,并获得一批与红笛鲷免疫防御相关的ESTs,旨在为探讨红笛鲷分子免疫防御机制、筛选参与免疫防御调控相关的功能基因,揭示红笛鲷免疫抗病机制、提高机体抗病力、实现遗传改良奠定基础. 相似文献
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牙鲆淋巴囊肿病毒双抗体夹心ELISA检测方法的建立 总被引：4，自引：0，他引：4
以牙鲆淋巴囊肿病毒(Lymphocystis disease virus,LCDV)特异性单克隆抗体为捕获抗体,纯化的兔抗LCDV血清为检测抗体,建立了LCDV病毒双抗夹心间接ELISA检测方法.该方法最佳反应条件为:单克隆抗体包被质量浓度为2 μg/ml,兔抗血清工作浓度为1∶1200稀释,以3%牛血清白蛋白作为封闭液.应用本方法对体表具有明显发病症状的牙鲆、与发病鱼同池但体表无症状的牙鲆及健康牙鲆的肝、脾、肾、胃、肠、心脏、鳃等7种组织进行检测,在前两种鱼的胃、肠、鳃等组织检测到病毒,而健康牙鲆各组织器官反应结果均为阴性,试验结果表明,所建立的ELISA检测方法具有特异性强、可靠性高的特点,可用于养殖牙鲆LCDV的检测. 相似文献
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鱼呼肠孤病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立及鉴定 总被引：4，自引：0，他引：4
采用杂交瘤技术,用浓缩的鱼呼肠孤病毒(Fish Reovirus FRV)免疫BALB/C小鼠,取脾细胞与小鼠骨髓瘤SP2/O细胞融合,经筛选克隆,共获得B_7、C_6.D_9.G_7、E_4、F_5,F_7七株分泌抗鱼呼肠孤病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株。这七株细胞经液氮反复冻存、复苏及连续培养,可稳定分泌抗FRV的单克隆抗体.这七株杂交瘤细胞的染色体数为90～98条,明显高于SP2/O细胞(71条).分泌的单克隆抗体经琼脂双扩散法证实分别属于小鼠r球蛋白中的IgG_1、IgG_(2a)和IgG_(26)亚类.ELISA测得腹水抗体滴度1:2万～1:40万,病毒中和试验显示C_6、G_7有中和作用,滴度达1:64. 相似文献
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目的:为了进一步确定不同生长阶段生猪猪瘟抗体水平,对某规模化猪场不同阶段生猪进行了猪瘟抗体检测分析。方法:在一年之内分季度检测了首免前的4周龄仔猪的猪瘟母源抗体,及经产母猪、首免后及二免后生猪的猪瘟病毒抗体水平。结果:结果显示,4周龄(首免前)仔猪猪瘟(母源)抗体水平偏低,平均为36.65%;其一免和二免的生猪猪瘟抗体水平有明显的提高,平均值分别为56.67.%和93.34%。结论:通过该实验数据分析,及时对规模化猪场进行免疫程序的完善,对提高猪瘟的防控水平具有一定的意义。 相似文献
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鲢鱼骨骼肌过敏原小清蛋白的分离纯化及多克隆抗体制备与应用 总被引：1，自引：0，他引：1
小清蛋白是鱼类的主要过敏原,对该蛋白的研究不仅有利于过敏原检测方法的建立也可为低致敏性水产品的开发提供理论依据。通过组织捣碎、冷冻离心、热处理、Superdex75凝胶过滤等方法从鲢白色肉中纯化得到过敏原小清蛋白。Tricine-SDS-PAGE显示,在非还原条件下,该蛋白呈分子量分别为12ku、14ku、24ku的3个条带。而在还原条件下,仅有分子量为12ku的条带。Western-blotting分析表明,分子量为12ku、14ku和24ku的这3个条带都与小鼠抗蛙小清蛋白单克隆抗体(PARV-19)发生特异性反应,提示它们均为小清蛋白的不同形态。用纯化的小清蛋白制备多克隆抗体,经Protein A Sepharose亲和层析纯化得到高纯度的免疫球蛋白G(IgG)。Dot-blot检测发现,抗体稀释至1/51200时仍能与纯化的小清蛋白有显色反应。用制备的多克隆抗体进行Western-blotting分析,能特异地检测4种鱼(鲤、鲢、鲫、黄鳍鲷)中的小清蛋白。 相似文献
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体内诱导抗原技术及其在病原性细菌毒力基因研究中的应用 总被引：1，自引：0，他引：1
体内诱导抗原技术是筛选病原性细菌毒力基因的重要方法,自2000年建立以来,不断应用于结核分支杆菌和沙门氏菌等多种病原性细菌的研究。该文对其原理及在病原性细菌毒力基因研究中的应用进行综述,并分析其优缺点。 相似文献
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采用SDS-PAGE分离纯化彩鲫(Carassius auratus gibelio)ran基因编码区cDNA全长序列的原核表达蛋白,并以此为抗原免疫家兔,制备了相应的多克隆抗体;W estern b lotting结果表明,该抗体效价为1∶1000,具有较高的特异性。并从抗原蛋白相对分子质量、每次注射蛋白量、注射方式、注射途径等诸方面对该技术的要点进行了介绍。 相似文献
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猪瘟灭活疫苗抗体消长规律动态分析 总被引：2，自引：0，他引：2
猪瘟(CSF)是由猪瘟病毒(CSFV)引起的一种猪的急性、烈性传染病,被国际兽疫局(OIE)列为A类传染病。我国每年都投入大量的人力、物力、财力进行猪瘟疫病的研究及控制工作。但近年来猪瘟仍有发生,且有增强的趋势。至今尚无特效的治疗药物,疫苗预防仍是我国防治猪瘟的主要手段。通过对母源抗体跟踪监测和对猪瘟灭活疫苗不同免疫剂量和不同首免日龄进行比较试验,系统地反映了猪瘟母源抗体及灭活疫苗免疫后抗体的消长规律和免疫效果。为进一步掌握猪瘟灭活疫苗的免疫效力及免疫期、为该病的防治制定合理的免疫程序及为猪瘟的扑灭和净化提供科学的依据。 相似文献
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应用抗牙鲆免疫球蛋白单克隆抗体(2D8、1H1)对牙鲆外周血系统、肾、脾、肝、胰、肠道组织中抗体阳性细胞进行了定位观察,并对其组织学特征进行了描述。两株单抗均能在外周血滴片和组织切片中成功地检测到抗体阳性细胞。外周血系统中的抗体阳性细胞主要为淋巴细胞,没有发现抗体阳性的巨噬细胞;牙鲆头肾中没有肾单位,肾小管、肾小球等主要存在于后肾中,脾脏和肾脏都含有巨噬细胞、粒细胞、淋巴细胞等免疫相关细胞,抗体阳性细胞存在方式也极为相似,成簇或单独分布于黑色素巨噬细胞中心和血管周围;牙鲆的胰组织镶嵌在肝上,形成肝胰脏,也参与免疫应答,抗体阳性细胞单个存在,分布于肝组织中,胰组织中没有发现抗体阳性细胞;肠道抗体阳性细胞主要存在于固有层中,有成簇存在现象,在上皮层也可见到单个存在的抗体阳性细胞。 相似文献
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抑制性消减杂交技术在养殖鱼类免疫基因克隆中的应用 总被引：1，自引：0，他引：1
抑制性消减杂交技术(SSH)是近年来兴起的一种分离、克隆差异基因的新技术,它结合了消减杂交和抑制PCR的优点,具有操作简便、特异性强、背景低及重复性好的优点。目前已经用SSH技术鉴定出了鱼的许多免疫相关基因,如白细胞介素、趋化因子、肿瘤坏死因子、溶菌酶、NKEF、补体、干扰素及急性期蛋白基因等,对它们的结构和功能进行了较为深入的研究。本文对SSH技术在养殖鱼类中克隆的免疫基因进行了归纳与总结,旨为全面了解鱼类的抗病免疫基因提供基础资料。 相似文献
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为实现黄鳝血清转铁蛋白基因的原核表达并制备其多克隆抗体,利用基因特异性引物从黄鳝肝脏cDNA中扩增黄鳝转铁蛋白的C端序列,亚克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,构建pET/Tf-C重组表达载体;转化大肠杆菌BL21(DE3)后进行IPTG诱导。利用Ni离子亲和层析技术纯化Tf-C蛋白,并免疫新西兰兔制备多克隆抗体;通过间接ELISA技术和组织蛋白印迹对制备的多克隆抗体进行检测。试验结果表明,成功构建pET/Tf-C原核表达载体,并实现了蛋白的表达和纯化;制备的多克隆抗体效价大于1∶25 600,并能特异性地识别来源于黄鳝不同组织的血清转铁蛋白。研究结果对黄鳝血清转铁蛋白功能的研究奠定了基础。 相似文献
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为深入研究鱼类干细胞多能性转录因子Nanog的功能,本实验进行了团头鲂Nanog基因的原核表达和多克隆抗体的制备。首先,从团头鲂卵巢克隆出Nanog基因的编码区,将其连接到p ET32a载体上构建原核表达载体。接着将重组载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)pLysS,通过异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,获得预期大小的Nanog重组蛋白,并获得大量蛋白以制备抗体。最后通过ELISA检测抗体的效价和采用Western blot技术检测Nanog抗体的特异性。结果显示,在37°C,0.5 mmol/L IPTG诱导4 h可获得Nanog重组蛋白的高效表达;制备的多克隆抗体能够有效识别原核表达的Nanog蛋白及团头鲂肝脏和精巢的内源Nanog蛋白;该抗体也可应用于检测HepG2细胞中过表达的团头鲂Nanog蛋白。本研究为蛋白的原核表达和特异性抗体的制备及验证提供了研究思路,也为研究鱼类Nanog基因功能提供了特异性抗体。 相似文献