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不同类型的转基因细胞为核供体生产猪的转绿色荧光蛋白基因克隆胚胎 总被引：1，自引：0，他引：1
2005年我国获得了体细胞克隆猪的成功,但是在体细胞转基因克隆猪方面还处于起步阶段。猪的转基因克隆在农业和医学方面有着巨大的应用前景,在农业上可以提高猪肉品质和培育抗病猪种等;医学上可以为人类异种器官移植、疾病模型和新药筛选提供理想材料。体细胞核移植结合基因组修饰技术,是目前生产转基因家畜的一种有效方式。供体细胞的类型是影响转基因克隆效率的一个关键因素,因为供体细胞的类型决定着体细胞转基因效率和重组胚的发育潜力。目前所知,较成功用于生产转基因克隆猪的供体细胞仅限于胎儿成纤维细胞,因为它易培养、增殖期限长、重构胚的发育能力高。此外骨髓间充质细胞,一种成体干细胞,作为转基因克隆猪的供体细胞有着巨大的潜力,国内外仅有个别报道。前脂肪细胞,一种易于获得的体细胞,有报道称利用成年猪前脂肪细胞为核供体构建的克隆胚发育能力和胎儿成纤维细胞相当,并且获得了克隆猪的后代。而利用猪前脂肪细胞生产转基因克隆胚胎,将为后续组织工程研究奠定基础。因此本研究选择猪胎儿成纤维细胞、骨髓间充质细胞和前脂肪细胞为转基因克隆的供体细胞,目的是比较不同类型转基因供体细胞对生产克隆胚胎效率的影响。本研究首先建立了近交系五指山小型猪(WZSP)胎儿成纤维细胞系(FF)、新生猪骨髓间充质细胞(MSCs)系和成年猪前脂肪细胞系(PreA)。采用组织块法建立胎儿(27日龄)成纤维细胞系;髓间充质细胞从新生猪后腿骨冲取骨髓,加入到Percoll分离液中离心,吸取中间界层面细胞,贴壁法培养骨髓间充质原代细胞,培养基为低糖DMEM。对间充质细胞向脂肪细胞进行诱导分化,油红O染色鉴定;前脂肪细胞从猪的皮下脂肪取样,用0.1%胶原酶消化法建立前脂肪细胞原代细胞,并对前脂肪细胞进行诱导分化为成熟的脂肪细胞,油红O染色鉴定。为了获得转基因细胞系,利用脂质体lipofectamineTM2000(Invitrogene)介导的方法将质粒pEGFP-N1转染了胎儿成纤维细胞、骨髓间充质细胞和前脂肪细胞,经过800μg/mL G418筛选后均获得了阳性细胞株。分别以3种类型转基因和未转基因细胞为核供体进行猪的体细胞核移植,比较克隆胚胎的发育能力。结果如下:(1)比较了3种类型非转基因细胞的重组胚的囊胚发育率,发现胎儿成纤维细胞(8.2%)、骨髓间充质细胞(7.1%)和前脂肪细胞(8.8%)囊胚发育率差异不显著(P>0.05);(2)比较了3种类型转基因细胞的重组胚的囊胚发育率,发现胎儿成纤维细胞(9.6%)和骨髓间充质细胞(9.9%)最高,前脂肪细胞(3.7%)最低,前两者与后者差异显著(P<0.05);(3)分别比较了每一类型供体细胞转基因和非转基因对重组胚的囊胚发育率的影响,转基因对胎儿成纤维细胞(9.6%vs 8.2%)和骨髓间充质细胞(9.9%vs 7.1%)的重构胚囊胚发育率影响不大(P>0.05);前脂肪细胞转基因重组胚的囊胚发育率显著降低(3.7%vs 8.8%,P<0.05)。以上结果表明,某些供体细胞类型转基因与否对猪克隆胚胎的早期体外发育影响不明显,有些细胞类型转基因对克隆胚的发育能力影响较大。通过体细胞核移植技术,猪胎儿成纤维细胞和骨髓间充质细胞可以有效地生产猪转基因囊胚,但前脂肪细胞转基因克隆胚胎的囊胚发育率能否进一步提高,还需要进一步的实验观察。 相似文献
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本试验旨在优化电转染电压并构建转基因体细胞,为生产转基因广西巴马小型猪打下技术储备。以新生广西巴马小型猪肾脏成纤维细胞和pEGFP-N1为材料、以细胞存活率和转染率为电转染效率评价指标,筛选最佳电压,然后用优化电压进行电转染并经G418抗性筛选获得转基因体细胞系,通过体细胞核移植技术获得转基因克隆胚胎。本研究筛选出最佳电压为120 V,用优化电压进行电转染并成功构建表达GFP的转基因细胞,最后通过体细胞核移植成功获得表达GFP的转基因克隆胚胎。结果表明优化的电转染电压可以高效构建广西巴马小型猪转基因体细胞,并可通过体细胞核移植生产转基因克隆胚胎。 相似文献
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本研究旨在获得一种高效转染水牛细胞的方法。本研究首先以水牛胎儿成纤维细胞（BFF）为研究对象,建立、优化核转染法;随后,比较核转染法、脂质体法、电穿孔法转染BFF的效率;最后选用较优的方法,探讨转染水牛原代骨髓间充质干细胞和类胚胎干细胞的可行性。结果发现随电压的增加,核转染BFF的效率升高;核转染电压为225V,脉冲时间为10ms时,细胞EGFP阳性率为（83.1±1.4）%,转染效率显著高于脂质体法（（11.7±1.2）%）和电穿孔法（（35.5±2.0）%）。运用优化的核转染条件可以成功将外源基因导入水牛原代骨髓间充质干细胞和类胚胎干细胞,且不影响其细胞生物学特性。本研究为以多能干细胞介导的水牛转基因克隆胚胎的生产奠定了基础。 相似文献
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脂质体法是一种传统的向哺乳动物细胞导入外源基因的方法,然而其转染效率受多种因素影响。本研究将从脂质体和质粒DNA量、转染暴露时间以及混合孵育时间等四方面进行探索,以寻找最佳的转染体系。试验结果表明最佳转染体系为：脂质体1.25μL、DNA 0.7μg、脂质体-DNA混合孵育0 min以及转染暴露6 h。随后我们用优化过的转染体系对新生广西巴马小型猪肾脏成纤维细胞进行转绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）操作,获得了（26.45±2.11）%的转染率,并以此为核供体经体细胞核移植技术成功构建表达GFP的广西巴马小型猪克隆胚胎,同时证实转基因克隆胚的体外发育能力比得上非转基因克隆胚。这为我们构建用于人类疾病研究的基因修饰广西巴马小型猪奠定了基础。 相似文献
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脂肪组织中含有大量的间充质干细胞,目前对于间充质干细胞的研究主要是关注其基本的生物学特性和临床应用方面。脂肪干细胞因具有与骨髓间充质干细胞相似的生物学特性,且有易获取、安全、可迅速扩增等特点,已成为现有干细胞生物工程研究的最理想来源。利用脂肪干细胞建立大动物模型,以研究人类疾病、异体器官移植、动物疾病治疗和组织修复等方面,已成为脂肪干细胞的一个研究趋势。本文将对家畜脂肪干细胞的分离培养、表面抗原鉴定、分化能力、应用前景及存在问题做一综述。 相似文献
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猪作为重要的疾病模型动物,目前猪诱导多能干细胞(iPS 细胞)已有建系,但是细胞的冻存和传代的效率较低,影响后续的实验研究。Rho 相关蛋白激酶(ROCK)抑制剂 Y-27632 可提高人胚胎干细胞的解冻存活率,促进其克隆形成。本实验以猪(Sus scrofa)iPS 细胞为研究对象,通过在猪 iPS 细胞冻存和解冻过程中添加Y-27632,发现其可以减少猪 iPS 细胞在冻存和解冻复苏过程中的凋亡。在细胞的传代过程中,使用 Y-27632 可以促进猪 iPS 细胞的贴壁和克隆形成。虽然高浓度 Y-27632 会对猪 iPS 克隆的形态产生一定的影响,但并未影响细胞的碱性磷酸酶(AP)活性和多能性基因 Oct4、Sox2 和 Nanog 的表达水平。最后将转座子报告质粒 PB[Act-RFP]DS 导入猪 iPS 细胞中,经流式筛选后得到的带有红色荧光的细胞,并将其注射于猪孤雌胚胎中进行发育能力检测,发现 Y-27632 的处理能减少细胞在流式筛选和胚胎注射中的凋亡,促进其在胚胎内的嵌合发育。研究结果说明,ROCK 抑制剂 Y-27632 可以提高猪 iPS 细胞冻存和传代的效率,促进其在胚胎中的嵌合。该研究有助于猪 iPS 细胞及其他多能干细胞的保存,传代和筛选等相关研究。 相似文献
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王群 《农业生物技术学报》2007,15(5)
应用PCR技术从含有猪resistin基因cDNA的质粒RSTN-T中扩增目的基因片段，将其克隆至pcDNA3.1(+)表达载体中，经酶切及测序鉴定后，采用LipofectaminTM 2000 转染Hela细胞，用G418筛选稳定表达的Hela细胞株。以RT-PCR、Tricine-SDS-PAGE、Western blot分析其表达情况。测序结果表明成功构建了真核表达载体pcDNA3.1－RSTN，经G418筛选获得了Hela细胞克隆。用RT-PCR、Tricine-SDS-PAGE、western blot技术检测到了RSTN在Hela细胞中的转录与表达。重组质粒pcDNA3.1－RSTN的成功构建和表达为进一步研究猪resistin 的DNA疫苗奠定了基础。 相似文献
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目的：获得转EGFP基因猪羊水干细胞并监测其自我更新、增殖和多向分化潜能。方法：利用羊水干细胞培养技术体系,从胎龄30 d猪胎儿羊水中分离培养羊水干细胞,通过脂质体介导转染技术,将EGFP基因导入羊水干细胞,诱导转基因羊水干细胞贴壁分化,观察其体外增殖、分化特点。采用RT-PCR技术检测干细胞和分化细胞表面标志或相关基因。结果：成功分离培养出羊水干细胞,获得转EGFP基因羊水干细胞,羊水干细胞在表达EGFP的同时仍具有多向分化潜能。羊水干细胞中β-Actin、NogoA、DCX、CyclinD2、CD133、Hes1、Oct4、Desmin、CD-90、Nanog和Sox2表达阳性;体外诱导的羊水干细胞可以分化为星形胶质细胞(表达GFAP)、少突胶质细胞(表达GalC)和神经元细胞(表达NF、NSE和MAP2);能分化为脂肪细胞（表达LPL和PPARγ-D）、成骨细胞（表达Osteonectin和Osteocalcin）、肌细胞（表达myf-6和myoD）和内皮细胞（表达CD31、CD34、CD144 和eNOS）。结论：从猪胎儿羊水分离羊水干细胞具有可行性和有效性,转EGFP基因羊水干细胞具有自我更新、增殖和多向分化潜能,可以用EGFP对羊水干细胞进行标记、追踪。 相似文献
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从杜长大母猪的股骨骨髓中提取基因组RNA，用RT-PCR 扩增抗菌肽PMAP-37 基因，获得1 条约282 bp 的片段，以pGEM-T Easy vector 为载体，将该基因片断克隆到大肠杆菌(Escherichia coli )DH5α 中。从筛选的阳性克隆中分离出PMAP-37 基因，测定其序列。分析表明，该片段为PMAP-37 cDNA 的部分序列，编码167 个氨基酸组成的多肽。研究得到的基因片段与报道的猪骨髓抗菌肽PMAP-37 cDNA 部分序列同源性达到98%。以PMAP-37 基因片段的克隆为基础，构建了优化的半定量RT-PCR 法，以18S rRNA 为内标，研究不同体重猪骨髓抗菌肽PMAP-37 基因表达的差异。结果发现，从刚出生到20 kg，PMAP-37 基因表达呈上升趋势，在20～40 kg，PMAP-37 基因表达呈下降趋势，40～60 kg，PMAP-37 基因表达又呈上升趋势，在60～90 kg，PMAP-37 基因表达呈下降趋势。 相似文献
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羊水干细胞是一种存在于胎儿羊水中Oct4阳性的多能性干细胞.该细胞具有增殖能力强、分化潜能高和免疫原性低等特点,在生物学和医学研究上具有广泛的应用前景.本实验从不同胎龄的猪胎儿标本中分离猪羊水干细胞,并通过诱导其向脂肪细胞分化来检测其多向分化潜能.结果表明,从胎龄为30～70 d的猪胎儿羊水中分离出的羊水干细胞贴壁率高,增殖能力强,活性好,并建立了两株猪羊水干细胞系.经流式细胞仪和RT-PCR检测,猪羊水干细胞表达CD117、CD44、CD166和CD90表面抗原,不表达CD45、CD54和CD34;稳定表达Oct4、Nanog、C-myc和HLA-abc干细胞特异标志基因;转染报告基因载体pOct4-EGFP和pNanog-EGFP后表达绿色荧光;此外,猪羊水干细胞还能够在体外诱导分化为脂肪细胞.研究结果为大动物羊水干细胞的研究提供了可借鉴的材料. 相似文献
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本研究通过PCR方法从小鼠(Mus musculus)基因组中扩增出Oct4启动子的CR4区和CR1区,将其克隆到真核报告载体pEGFP-1,构建了携带Dct4启动子片段的小鼠生殖细胞特异性报告载体CR1,4-pEGFP-1.用该载体转染多种细胞,在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(EGFP)在细胞中的表达情况,同时以半定量RT-PCR检测转染细胞中Oct4及其它生殖细胞特异性基因的转录情况.结果显示,GFP在小鼠胚胎干细胞、小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)和C2C12细胞中均不表达,而在P19细胞和睾丸细胞中表达.RT-PCR结果显示,Oct4在P19、睾丸细胞和生殖干细胞中特异性转录.这表明所构建的绿色荧光蛋白报告载体只在生殖细胞和多能生殖干细胞中内表达,该质粒可作为示踪生殖细胞的工具,同时也可以作为生殖干细胞多能性状态的一个监测标记. 相似文献
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鸡γ-干扰素基因(ChIFN-γ)的瞬时表达及其抗病毒活性检测 总被引：1，自引：0，他引：1
采用PCR技术从质粒pET-ChIFN-γ中扩增得到鸡(Gallus gallus)γ-干扰素(chicken interferon gamma,ChIFN-γ)基因,将其亚克隆到真核表达载体pCAGGS中.将鉴定正确的克隆命名为pCAGGS-ChIFN-γ,体外转染鸡胚成纤维(CEF)细胞,24 h后经间接免疫荧光(IFA)和免疫印迹(Western blot)检测,表达蛋白具有良好的免疫原性.然后利用表达绿色荧光蛋白(GFP)的重组水疱口炎病毒(VSV*GFP)在CEF细胞上检测表达的ChIFN-γ抗病毒活性(AVA),经检测其抗病毒活性为2×10~3AU/mL,并且其活性可被抗鸡IFN-γ的多克隆抗体阻断. 相似文献
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为了从新转染方法与传统转染方法的比较中找出更为高效的转染方法,本研究以绿色荧光蛋白(GFP)质粒DNA为外源基因,分别采用核转染法、电穿孔法和脂质体法转染牛的3种常用核移植供体细胞(胎儿成纤维细胞、胎儿输卵管上皮细胞、卵丘颗粒细胞).针对不同类型的细胞,实验首先对核转染法和电穿孔法的转染参数进行了系统的摸索和优化,然后将优化后的核转染法、电穿孔法与脂质体法在可控实验条件完全一致的情况下进行了转染对比实验,分析比较了转染48 h后的绿色荧光比率和细胞存活率.结果显示,核转染法转染胎儿成纤维细胞、胎儿输卵管上皮细胞和卵丘颗粒细胞的优化程序分别是V013、T023和U023;在电穿孔法中,当电场强度为90 V/mm,脉冲时间为10 ms时,胎儿成纤维细胞和卵丘颗粒细胞的转染效率最高,胎儿输卵管上皮细胞则在电场强度为80 V/mm,脉冲时间为5 ms时获得了最佳转染效率;最后通过转染对比实验得出,核转染法在3种细胞中都获得了最高的转染效率,分别为(98.78±0.30)％、(88.43±2.10)％和(71.31±0.77)％,均显著高于电穿孔法和脂质体法;转染后的存活率则为脂质体法最高,电穿孔法最低.研究结果说明,核转染法可以成为一种结合牛体细胞克隆技术生产转基因牛更有效的转染方法. 相似文献
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Dvl1及其结构缺失突变体ΔDIX（dsh and axin）和ΔDEP（dsh,Egl-10 and pleckstrin）腺病毒载体的构建并验证其在MSCs（mesenchymal stem cells）中的表达情况。将目的基因定向克隆至pAdTrack-CMV穿梭载体上,并经PmeⅠ线性化后在BJ5183细菌中与pAdEasy-1骨架质粒同源重组,获得重组腺病毒载体,在QBI-293A细胞中包装及扩增,实时荧光定量PCR和Western bolt验证Dvl1在MSCs中的表达情况。经PCR、PacⅠ单酶切鉴定及测序分析,成功构建Ad-Dvl1、Ad-ΔDIX和Ad-ΔDEP腺病毒载体,目的基因序列与GenBank报道一致,并选出150 MOI为最适感染MSCs的感染复数,成功构建了Ad-Dvl1、Ad-ΔDIX和Ad-ΔDEP腺病毒载体,并获得高滴度的病毒子,qPCR和Western blot证实Dvl1在MSCs中高表达并增加了β-catenin在细胞中的累积,为进一步研究Dvl1在MSCs迁移过程的作用奠定了基础。 相似文献
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α-乳清蛋白(α-lactalbumin,α-LA)是哺乳动物乳汁中一种重要的蛋白质,富含机体必需氨基酸和支链氨基酸,其极佳的氨基酸比例、易吸收性以及功能特异性,使得α-LA在婴幼儿个体正常生长中具有重要的意义。本实验旨在构建人α-乳清蛋白真核表达载体pIRES2-ZsGreen1-opLA,将其转染至猪(Susscrofa)的成纤维细胞,获得稳定表达人α-LA的细胞。根据猪基因密码子偏爱性优化并合成人α-乳清蛋白基因mRNA序列opLA,并将其定向克隆入pIRES2-Zs Green1真核表达载体,双酶切及测序方法鉴定重组载体;脂质体介导的方法将载体转染入培养的猪成纤维细胞,荧光显微镜下观察转染效果,G418抗性筛选重组细胞;RT-PCR方法检测目的基因的表达。结果表明,通过酶切以及测序鉴定得到的重组载体pIRES2-Zs Green1-opLA构建成功;荧光显微镜下观察,转染了pIRES2-Zs Green1-opLA和pIRES2-Zs Green1空载体的细胞均发出绿色荧光,且荧光多集中于细胞核;筛选重组细胞的最小G418浓度为400ng/μL;RT-PCR法检测到与目的基因大小一致的片段,而未转染组和转染空载体组均未检测到。本实验成功构建真核表达载体pIRES2-ZsGreen1-opLA,并获得稳定表达目的基因的猪成纤维细胞,该细胞可作为进一步研究转基因克隆猪的供体细胞。 相似文献
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应用PCR技术从含有猪resistin基因(Retn)cDNA的质粒pMD18T-Retn中扩增Retn基因片段,将其克隆至pcDNA3.1( )表达载体中,构建重组表达质粒pcDNA3.1-Retn。采用LipofectaminTM2000转染Hela细胞,用G418筛选稳定表达的Hela细胞株。用RT-PCR、Tricine-SDS-PAGE和Western blot技术检测,结果表明Retn基因在Hela细胞中得到转录与表达。 相似文献
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利用苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒(Autographacalifornicamulticapsidnucleopolyhedrovirus,AcMNPV)Bac-to-Bac表达系统在粉蚊夜蛾(Trichoplusiani)TnHi5细胞中表达了GFP与Vip2A(c)酶活成分区域的融合蛋白(GV2融合蛋白),研究了该蛋白对昆虫细胞和病毒产生的影响。Bac-gfpDNA转染48h后部分TnHi5细胞已经检测到荧光,48￣120h出现荧光的细胞数目增加,最后70%左右的细胞都有较强的荧光。而Bac-gv2DNA转染后2￣5d仅有极少TnHi5细胞出现荧光且多呈零散分布,推测这可能是由于杆状病毒极晚期表达的GV2融合蛋白中的Vip2A对细胞骨架成分肌动蛋白进行ADP-核糖基化,从而影响了芽生型病毒粒子(BV)的正常产生或限制了BV在其它细胞间的传播。 相似文献
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睾丸特异蛋白基因对奶牛早期胚胎性别的鉴定 总被引：1，自引：0，他引：1
为方便性别鉴定方法在现场应用，利用睾丸特异蛋白基因（TSPY）建立奶牛早期胚胎的非电泳性别鉴定方法。本实验首先设计并合成TSPY雄性特异引物和雌、雄共有引物并利用已知性别的奶牛血液DNA检测了利用TSPY基因鉴定胚胎性别的可能性。结果显示：雄性特异引物和共有引物对在10pg～60pg范围内性别符合率均为100%；采用非电泳的方法检测TSPY基因鉴定了49枚胚胎的性别，同时，用LAMP法对其中的6枚胚胎的性别鉴定结果进行验证，结果二者完全一致；对其中鉴定为雌性的21枚进行移植，结果9头出生的犊牛均为母牛。结果表明，TSPY基因是一个很好的雄性特异标记，非电泳检测TSPY基因对奶牛早期胚胎性别的鉴定结果准确可靠。 相似文献
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Pseudozyma antarctica隶属于担子菌纲。P．antarctica的双质粒共转化系统包括：pSceI-hyg和pVectour libre，其中pSce I-hyg含有hsp70启动子和终止子以及潮霉素抗性基因；pVectour libre仅含有hsp70启动子和终止子，以便插入要表达的目的基因。设计引物扩增得到绿色荧光蛋白基因后，插入pVectour libre，构建质粒GFP．hsp，将该质粒与pSce I-hyg共转化P．antarctica；实现了该系统在P．antarctica中的绿色荧光表达。 相似文献
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绿色荧光蛋白与黄瓜花叶病毒运动蛋白融合基因的构建及在大肠杆菌中的表达 总被引：1，自引：0，他引：1
采用重组－PCR方法，扩增获得绿色荧光蛋白（GFP）与黄瓜花叶病毒运动蛋白（CMV MP）融合基因，将其克隆到pKEN上，构建了该融合基因的原核表达载体pKENG-M。SDS－PAGE及免疫印迹分析显示，57kD的融合蛋白基因在大肠杆菌DH5α中正确表达，激光共聚焦显微镜分析表明，在488nm光激发下，菌体呈亮绿色，表明融合蛋白保持绿色荧光特性。实验结果为进一步研究CMV MP的功能及其与胞间连丝和其他细胞成分的作用关系奠定了基础。 相似文献