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1.
牛支原体可引起牛肺炎、乳腺炎和关节炎等多系统炎症,关于其黏附宿主细胞的机理有待深入研究。本试验以牛支原体08M株和牛肾细胞MDBK为研究对象,抗牛支原体多克隆抗体为一抗,FITC标记的兔抗牛IgG为二抗,通过优化牛支原体黏附滴度、黏附时间及一抗、二抗工作浓度,建立牛支原体黏附宿主细胞的间接免疫荧光检测方法。最终确定牛支原体的最适黏附滴度为1×109 CFU/mL,黏附时间为4h,一抗最适工作浓度为1∶250,二抗最适工作浓度为1∶250。本试验建立的间接免疫荧光方法可用于牛支原体黏附宿主细胞的检测,为牛支原体体外感染的检测及黏附机理的研究提供有效的技术手段。 相似文献
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本研究旨在建立一种简单、方便、准确、特异的方法检测新城疫病毒（Newcastle disease virus, NDV)。比较间接HRP-免疫细胞化学法与间接免疫荧光法两种方法检测NDV在COS-7细胞中的定位。两种试验方法都可以检测到NDV主要定位在COS-7细胞的胞浆内。间接HRP-免疫细胞化学法检测NDV要求一抗滴度≤1∶100,间接免疫荧光法要求的滴度≤1∶100。间接HRP-免疫细胞化学法检测NDV要求二抗滴度≤1∶300,间接免疫荧光法要求的滴度≤1∶50。而且结果观察中间接HRP-免疫细胞化学法要比间接免疫荧光法方便。间接HRP-免疫细胞化学法进行NDV检测优于间接免疫荧光法,是一种简单、快捷、准确的适用于检测NDV的技术。 相似文献
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本试验用布鲁氏菌强、弱毒株侵染小鼠巨噬细胞RAW264.7,旨在探讨NF-κB信号通路与布鲁氏菌强、弱毒株在胞内生存的关系。采用光滑型牛布鲁氏菌2308、粗糙型牛布鲁氏菌RB51在不同感染复数下侵染小鼠巨噬细胞RAW264.7,侵染0、4、8、24 h后,裂解细胞收集蛋白,Western blotting检测布鲁氏菌对激活NF-κB信号通路的影响。利用不同浓度的NF-κB信号通路抑制剂处理小鼠巨噬细胞RAW264.7,然后用布鲁氏菌在不同感染复数下侵染小鼠巨噬细胞RAW264.7,ELISA试剂盒检测细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6的表达量;同时对胞内菌CFU进行计数。结果显示粗糙型牛布鲁氏菌RB51可以强烈激活NF-κB信号通路,光滑型牛布鲁氏菌2308对其激活作用较弱;同时对NF-κB信号通路的激活具有浓度依赖性,在感染复数为80:1、侵染时间为8 h时光滑型牛布鲁氏菌2308和粗糙型牛布鲁氏菌RB51对NF-κB激活程度最强,且该通路参与产生TNF-α、IL-1β和IL-6;NF-κB信号通路抑制剂BAY11-7082影响布鲁氏菌在胞内的生存。因此,粗糙型牛布鲁氏菌RB51胞内存活与NF-κB信号通路密切相关,为进一步研究布鲁氏菌的胞内致病机制奠定基础,也为布鲁氏菌新型药物的研发、家畜布鲁氏菌病预防和治疗提供科学依据。 相似文献
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为寻求一种检测鸭出血症病毒 (duck hemorrhagic disease virus,DHDV)快速、敏感、实用的方法 ,建立了间接免疫荧光试验 ,并测定了一抗 (兔抗鸭出血症病毒阳性血清 )、二抗 (FITC标记的羊抗兔 Ig G)的最佳使用浓度及最佳感作时间分别为 1∶ 2 0、6 0 m in和 1∶ 10 0、6 0 min。以建立的间接免疫荧光试验检测了 DHDV于番鸭胚成纤维细胞中的复制动态 ,结果表明 ,接毒后 36～ 6 0 h为 DHDV大量复制期 ;6 0～ 12 0 h为 DHDV从核膜以出芽方式进入胞浆中成熟的阶段 ;12 0～ 14 4 h为大量 DHDV自胞浆中释放至胞外阶段。该方法快速、特异 ,可用于该病的实验室诊断。 相似文献
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为建立免疫荧光检测鹅细小病毒（Goose parvovirus，GPV）的方法，本研究利用超速离心纯化的GPV作为免疫原，制备了3株抗GPV特异性单克隆抗体，依次命名为GPV-Mab-6C8、GPV-Mab-1B9、GPV-Mab-2H8。试验结果表明，3株抗GPV抗体特异性良好，并能够中和GPV对鹅胚成纤维细胞的感染能力。利用抗GPV单抗作为一抗，FITC标记的羊抗鼠IgG为二抗，建立了检测GPV的间接免疫荧光方法（indirect immunofluorescence assay, IFA），该方法不仅能够检测鹅胚成纤维细胞中的GPV，还能够检测发病鹅组织冰冻切片中的GPV。本研究制备的抗GPV特异性单克隆抗体和建立的检测GPV的免疫荧光方法，为今后GPV细胞活疫苗的检测评价和临床诊断提供了技术手段。 相似文献
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为研究布鲁氏菌clpP基因与细菌毒力的关系,采用同源重组的方法,构建牛种布鲁氏菌clpP基因缺失株,用巨噬细胞RAW264.7感染模型和小鼠感染模型评价clpP基因缺失株的毒力,同时测定该缺失株免疫小鼠后产生的免疫保护力。研究发现:牛种布鲁氏菌clpP基因缺失后,在细胞感染模型和小鼠感染模型中的毒力显著降低;clpP基因缺失株感染小鼠后,不引起脾脏肿胀,并且在脾脏内的持续期短于A19疫苗株,说明该基因缺失株具有更高的安全性;使用clpP基因缺失株免疫小鼠后,该基因缺失株无法抵御牛种布鲁氏菌2308株和羊种布鲁氏菌M28株的感染。本研究为揭示布鲁氏菌致病机制和新型布病疫苗研发提供了参考。 相似文献
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单克隆抗体间接免疫荧光检测猪瘟病毒方法的建立 总被引：1，自引：0，他引：1
以作者制备的抗猪瘟病毒单克隆抗体(anti-CSFV McAb)为一抗、荧光素标记羊抗小鼠IgG为二抗,通过反应条件的优化,建立检测猪瘟病毒抗原的间接免疫荧光(IFA)检测方法。确定IFA最佳工作条件:CSFV最佳接种浓度和培养条件为CSFV 10-3倍稀释后接种PK15细胞,37℃5%CO2恒温箱中培养36 h;McAb最适工作浓度为1∶1 000倍稀释;荧光素标记的羊抗小鼠IgG荧光抗体的最适工作浓度为1∶50倍稀释。特异性试验表明,用建立的IFA检测方法检测CSFV感染PK15细胞为阳性,而检测伪狂犬病病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)、猪2型圆环病毒(PCV-2)感染PK15细胞均为阴性。结果表明,建立的检测细胞培养中CSFV抗原的IFA检测方法具有敏感特异、简便快速等优点,可用于CSFV感染的实验室诊断及CSFV在感染细胞中的定位和动态分布研究。 相似文献
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布鲁氏菌胞内存活机制与巨噬细胞极化关系研究进展 总被引：1，自引：1，他引：0
布鲁氏菌（Brucella）是一种兼性胞内寄生致病菌,虽无典型的毒力因子却有很强的致病力,且常导致慢性持续感染。布鲁氏菌病被列入世界上严重的人兽共患病之一,直接对畜牧业造成重大经济损失,严重威胁人类健康和公共卫生安全。布鲁氏菌感染的靶细胞主要是巨噬细胞,其发展了更高的策略逃逸宿主免疫细胞的杀伤,甚至在细胞内大量繁殖,削弱巨噬细胞的功能,使巨噬细胞的杀伤作用和抗原递呈功能部分丧失,从而能在宿主细胞内长期持续性感染。文章围绕布鲁氏菌胞内存活机制进行探讨,分析了不同极化类型的巨噬细胞在布鲁氏菌感染过程中的调控作用,以及相关炎症通路对机体炎症发展的作用;揭示了布鲁氏菌胞内生存不仅可适应持续感染期间不同的免疫微环境,也可适应感染期间靶细胞营养物质利用率的差异;证实了在慢性感染的过程中免疫逃避和与宿主细胞代谢的相互作用起关键作用;解释了NF-κB通路是调节M1/M2型巨噬细胞亚型平衡状态的关键因素。布鲁氏菌在宿主细胞中持续感染是国内外学者所面临的巨大难题,其免疫逃逸机制和致病机制仍需进一步研究。 相似文献
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布鲁氏菌胞内存活机制与巨噬细胞极化关系研究进展 总被引：2，自引：2，他引：0
布鲁氏菌(Brucella)是一种兼性胞内寄生致病菌,虽无典型的毒力因子却有很强的致病力,且常导致慢性持续感染。布鲁氏菌病被列入世界上严重的人兽共患病之一,直接对畜牧业造成重大经济损失,严重威胁人类健康和公共卫生安全。布鲁氏菌感染的靶细胞主要是巨噬细胞,其发展了更高的策略逃逸宿主免疫细胞的杀伤,甚至在细胞内大量繁殖,削弱巨噬细胞的功能,使巨噬细胞的杀伤作用和抗原递呈功能部分丧失,从而能在宿主细胞内长期持续性感染。文章围绕布鲁氏菌胞内存活机制进行探讨,分析了不同极化类型的巨噬细胞在布鲁氏菌感染过程中的调控作用,以及相关炎症通路对机体炎症发展的作用;揭示了布鲁氏菌胞内生存不仅可适应持续感染期间不同的免疫微环境,也可适应感染期间靶细胞营养物质利用率的差异;证实了在慢性感染的过程中免疫逃避和与宿主细胞代谢的相互作用起关键作用;解释了NF-κB通路是调节M1/M2型巨噬细胞亚型平衡状态的关键因素。布鲁氏菌在宿主细胞中持续感染是国内外学者所面临的巨大难题,其免疫逃逸机制和致病机制仍需进一步研究。 相似文献
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为构建表达Strep-tag II的重组塞内卡病毒(SVA),本研究在感染性cDNA克隆p SVA-I212V/S460L的基础上,采用重叠延伸PCR扩增Strep-tag II并采用无缝克隆法将其插入SVA VP1基因C端,构建感染性cDNA克隆,命名为p SVA-Strep,并采用双酶切和测序鉴定正确后,将p SVA-Strep转染BHK-21细胞拯救重组病毒,收集病变细胞上清,并将含有病毒的细胞上清和野生型SVA(SVA-WT)分别感染BHK-21细胞,以未感染病毒的BHK-21细胞作为阴性对照,感染后24 h分别以鼠源SVA VP2蛋白单克隆抗体(MAb) 5D10 (1∶1 000)、鼠源Strep-tag II MAb (1∶2 000)作为一抗,以FITC标记的山羊抗小鼠Ig G (1∶2 000)为二抗,采用间接免疫荧光试验(IFA)对重组病毒鉴定。IFA结果显示,以鼠源SVA VP2蛋白MAb 5D10为一抗,SVA-WT和重组病毒感染的细胞均出现绿色荧光,以Strep-tag II MAb作为一抗时,仅有重组病毒感染的细胞出现绿色荧光,经SVA-WT感染的BHK-2... 相似文献
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根据布鲁菌属特异性基因BCSP31和布鲁菌种间特异性标志IS711插入序列,设计合成了3对引物,以牛种布鲁菌544A、104M和羊种布鲁菌16M基因组DNA为模板,通过优化反应条件,建立了可同时检测布鲁菌属、牛种布鲁菌和羊种布鲁菌的多重PCR方法。牛种布鲁菌可扩增出301和114 bp 2条带,羊种布鲁菌可扩增出301和253 bp 2条带,该方法对牛种布鲁菌544A和羊种布鲁菌16M混合DNA模板的最小检出量为100 pg,对大肠杆菌O157∶H7、小肠结肠炎耶尔森菌等15种参照菌的核酸扩增结果均为阴性。应用该方法对吉林省某牛场的106份粪便进行检测,虎红平板凝集试验作对照,结果PCR检测9份为阳性,且全为牛种布鲁菌阳性,对应的虎红平板凝集试验也为阳性。结果表明,建立的多重PCR方法具有良好的敏感性和特异性,为布鲁菌病的鉴别诊断提供了一种分子检测工具。 相似文献
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牛布鲁氏菌膜蛋白的免疫抗原筛选 总被引：1，自引：1，他引：0
试验旨在通过免疫蛋白质组学筛选布鲁氏菌保护性抗原。利用双向电泳技术对试验条件下培养的布鲁氏菌强毒株544A膜蛋白进行分离,结合Western blotting技术分别用豚鼠、牛抗布鲁氏菌血清寻找发生免疫反应的蛋白质。16个免疫蛋白点经胶内酶切、质谱(LC-MS/MS)进行鉴定。利用生物信息学工具发现这些蛋白不全是膜蛋白,还存在胞质蛋白,其功能涉及生物合成和物质代谢等领域。成功建立了布鲁氏菌膜蛋白的免疫蛋白质组学研究方法,为寻找保护性抗原及为新型疫苗抗原候选提供新思路。 相似文献
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为初步调查SPF鸡感染鹦鹉热嗜性衣原体状况及相关SPF鸡胚源疫苗是否出现污染,本试验通过采集不同日龄的SPF鸡血清70份、SPF种蛋卵黄膜30份,收集市场上销售的SPF鸡胚源疫苗共41支,利用国产间接血凝试剂盒检测抗体,进口免疫荧光试剂盒分别测定其抗体、抗原阳性率,以评价SPF鸡鹦鹉热嗜性衣原体的流行状况和相关疫苗的污染状况。本试验结果显示,SPF鸡血清阳性率分别为31.4%(荧光法)、5.7%(间接血凝法);SPF种蛋阳性率33.3%,SPF鸡胚源疫苗平均阳性率31.7%。SPF鸡已经感染了鹦鹉热嗜性衣原体,且发现经鸡胚卵黄膜而传播病原的新途径,进而造成SPF鸡胚源疫苗出现衣原体污染。因此,加强SPF鸡鹦鹉热嗜性衣原体监测已势在必行。 相似文献
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慢性瘤胃酸中毒状态下奶山羊瘤胃细菌内几种相关细菌数量变化的研究 总被引：1，自引：0，他引：1
研究慢性瘤胃酸中毒（subacute rumen acidosis,SARA）状态下,相关瘤胃微生物数量的变化。将6只体重相近,体况良好,并安装有永久性瘤胃瘘管的泌乳期关中奶山羊作为试验对象,以逐渐增加精料的方式诱导动物发生SARA。试验分4期进行,4期日粮的精粗比分别为5∶5、6∶4、7∶3和8∶2。分别采用16S rRNA 探针杂交法和传统培养法对SARA状态下瘤胃内微生物数量变化进行测定。随着日粮精料比例的增加,牛链球菌、乳酸杆菌、反刍兽新月单胞菌、埃氏巨型球菌和淀粉分解菌的数量出现不同程度的增加,而3种主要纤维分解菌的数量有所下降,其中淀粉分解菌的数量极显著增加（P<0.01）。在SARA状态下瘤胃细菌总数、乳酸产生菌和乳酸利用菌数量均有所增长,同时3种主要纤维分解菌的数量明显下降。 相似文献
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为了解兰州地区宠物犬弓形虫病的感染情况以及不同弓形虫检测方法检测结果的差异,本研究对兰州地区272例宠物诊所受检犬进行弓形虫阳性检出率的统计分析;对66份犬血样进行间接血凝试验（IHA）与酶联免疫吸附试验（ELISA）检测,并将2种方法进行比较。结果表明,弓形虫的感染率与年龄有关,随着年龄的增长感染率增加,犬小于1岁感染率最低,为3.77%,1～3岁感染率为10.59%,3～5岁感染率为15.28%,大于5岁时感染率最高,为22.58%,不同性别之间感染无显著差异（P>0.05）;IHA与ELISA检测结果经t检验比较差异不显著（P＞0.05）。 相似文献
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为构建和表达抗RT单链抗体(ScFv)蛋白,用RT-PCR方法从能分泌特异性抗RT单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞中分离纯化抗体VH和VL基因。用重叠延伸PCR方法将VH和VL拼接在一起,构建抗RT-ScFv基因。将ScFv基因连接到pMAL-p2X表达载体,转化TB1表达菌。阳性克隆用IPTG诱导18h,Western blotting鉴定重组蛋白。结果表明,试验成功扩增出了ScFv基因,长度约为750bp。通过DNA序列测定和分析,构建出VL-(Gly4Ser)3-VH。其VH全长363bp,可编码121个氨基酸,VL全长324bp,可编码108个氨基酸。SDS-PAGE和Western blotting分析结果表明,抗RT-ScFv在TB1表达菌中获得高效表达,pMAL-p2X表达的ScFv加上同时融合表达的MBP标签分子质量约为75ku。本试验成功构建了pMAL-RT-ScFv表达载体,并获得了高效表达。 相似文献
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检测猪伪狂犬病病毒gE抗体红细胞凝集试验的建立及应用 总被引：2，自引：0，他引：2
以纯化的抗人红细胞单链抗体(ScFv)—猪伪狂犬病病毒(PRV)gE蛋白双功能融合蛋白为抗原,建立了检测猪伪狂犬病毒gE抗体的红细胞凝集试验。利用方阵滴定试验筛选出最佳抗原工作浓度为55μg/mL,血清最佳稀释度为1∶20,作用时间15 min,与猪瘟(CSF)、猪细小病毒(PPV)、猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)、猪乙型脑炎(JE)、猪布氏杆菌病(Brucellosis)阳性血清和PRV gE缺失疫苗接种的猪免疫血清均不出现红细胞凝集现象,与PRV标准阳性血清反应出现肉眼可见的凝集圈。与美国进口的PRV抗体检测gE-ELISA诊断试剂盒检测结果比较,50份猪血清的阴、阳性检出符合率均为100%。红细胞凝集试验检测方法具有操作简便、敏感性和特异性较高的特点,可用于PRV野毒感染的快速筛查。 相似文献
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试验旨在研究饲粮中添加不同水平凝结芽孢杆菌对蛋鸭产蛋性能、蛋品质及血清生化指标的影响。选取200日龄,产蛋率约80%的临武鸭240羽,随机分成4组,每组6个重复,每个重复10羽鸭,对照组饲喂基础饲粮,试验组在基础饲粮中分别添加100 mg/kg、150 mg/kg和200 mg/kg凝结芽孢杆菌,预试期7 d,正试期28 d。结果表明：（1）饲粮添加凝结芽孢杆菌可提高蛋鸭产蛋率、平均日产蛋量、平均蛋重和饲料转化率,但未达显著水平（P>0.05）;添加100 mg/kg和150 mg/kg凝结芽孢杆菌可显著降低产蛋鸭采食量（P<0.05）,添加200 mg/kg与各组间均无显著差异（P>0.05）;(2）饲粮添加凝结芽孢杆菌可显著降低鸭蛋蛋壳厚度（P<0.05）,当添加150 mg/kg和200 mg/kg时,差异达极显著水平（P<0.01）,凝结芽孢杆菌还可显著提高鸭蛋蛋黄颜色,蛋白高度和哈氏单位（P<0.05）;（3）芽孢杆菌对产蛋鸭血清中血糖、总蛋白、总胆固醇、甘油三脂等血清生化指标均无显著影响（P>0.05）。由此可知,饲粮中添加凝结芽孢杆菌能在一定程度上提高蛋鸭饲料转化率和产蛋性能,虽会引起蛋壳厚度降低,但不影响合格蛋率,还可提高蛋黄颜色和哈氏单位,对蛋品质有一定改善。综合考虑,蛋鸭饲粮中凝结芽孢杆菌的添加量以150 mg/kg较为适宜。 相似文献