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胞质三磷酸甘油醛脱氢酶（ＧＡＰＣ）是糖酵解中的关键酶,近年的研究表明其对盐、低温、高温、氧化、高渗、低磷等多种逆境胁迫均有响应。本实验采用ＲＴ－ＰＣＲ,分别从马铃薯和拟南芥中克隆ＧＡＰＣ 的编码区序列（ＣＤＳ）,并作生物信息学比较,同时构建２个基因的植物表达载体。结果表明,StGAPC 和AtGAPC２ 的ＣＤＳ 长度均为１０１７ｂｐ,相似性８４％,编码３３８个氨基酸,相似性为９２％。蛋白分子量分别为３６．６５和３６．９１ｋＤａ,理论等电点为６．３４和６．６７,均属稳定蛋白;三级结构预测表明两者和水稻（２ｅ５ｒＣ）ＧＡＰＣ 蛋白结构相似,具有ＧＡＰＣ 保守功能域。多种植物犌犃犘犆基因的序列进化分析表明同科属植物的同源性较高可归于同一分支,与现有的分类系统相对应。以ｐＢＩ１２１为基础载体,构建了由ＣａＭＶ３５Ｓ启动GAPC 基因的植物表达载体,导入农杆菌ＥＨＡ１０５,经ＰＣＲ检测确定获得阳性克隆。本研究为获得转GAPC 基因的材料并进一步研究ＧＡＰＣ 在逆境中的功能奠定基础。 相似文献
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马铃薯SGAs合成代谢途径末端SGT酶基因克隆及序列分析 总被引：1，自引：0，他引：1
糖苷生物碱（ＳＧＡｓ）是一类存在于茄科植物和百合科植物的重要次生代谢物,与植物抗逆性和产品品质有密
切关系,同时在医药上具有广泛的药理学活性。茄啶：糖基转移酶（ＳＧＴ）为ＳＧＡｓ合成代谢途径末端关键酶,研究
其基因结构及其编码的酶蛋白特性,对于调控植物体内ＳＧＡｓ合成及其通过微生物发酵生产ＳＧＴｓ有重要的作用
和意义。通过生物信息学分析方法预测３个糖基转移酶ｃＤＮＡ 编码的酶蛋白结构和特性。以马铃薯块茎表皮总
ＲＮＡ 为模板,采用ＲＴ－ＰＣＲ 的方法扩增出３个糖基转移酶（ＳＧＴ１、ＳＧＴ２和ＳＧＴ３）基因片段并克隆到ｐＭＤＲ１９ Ｔ
载体。阳性克隆经ＰＣＲ 鉴定后进行测序,序列分析结果表明,克隆到的sgt １、sgt ２ 和sgt ３ 三个同源的序列片段
（１４６７～１５１８ｂｐ）,编码４８８～５０５ 个氨基酸;所得序列与ＧｅｎＢａｎｋ 中注册的高等植物ＳＧＴ 酶基因核苷酸序列
（Ｕ８２３６７．２、ＤＱ２１８２７６．１和ＤＱ２６６４３７）的同源性均在９９．１２％以上,氨基酸同源性达到９９％以上,３个基因都具
有ＵＤＰＧ 糖基转移酶保守结构域及许多重要功能位点;ＰＩ为５．５２～５．６２。三级结构预测表明,该氨基酸同糖基转
移酶单体结构模型相似,都为糖基转移酶家族成员,具有合成类固醇糖苷生物碱的功能,基因序列已注册到Ｇｅｎ
Ｂａｎｋ,序列注册号分别为：sgt １,ＪＮ６９５００５;sgt ２,ＪＮ６９５００６;sgt ３,ＨＭ１８８４４７。 相似文献
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将编码人雄激素受体（ｈＡＲ）的雄素结合区（ＬＢＤ）的ｃＤＮＡ片段（１００５ｂｐ）克隆到由Ｐ１启动子控制的硫氧还蛋白表达载体ｐＴｒｘＦｕｓ上,构建了表达质粒ｐＴｒｘＡＲ,并转化到大肠杆菌Ｇ１７２４中,经色氨酸诱导表达后,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析,可观察到一高效表达的融合蛋白产物,此融合蛋白 分子了量与理论值相吻合,氨基酸组分分析证明了ＬＢＤ目的基因的表达。 相似文献
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本文应用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术从构建的新城疫病毒（ＤＮＶ）ｃＤＮＡ文库中扩增含编码Ｆ糖蛋白前体－Ｆｏ酶切位点序列的３５９ｂｐ的Ｆ蛋白基因ｃＤＮＡ片段。将此３５９ｂｐ ｃＤＮＡ片段经光敏生物素标记后，即成ＤＮＶ－ｃＤＮＡ探针。该探针能特异性地从感染的尿囊液中检测出ＤＮＶ强毒株和疫苗毒株的基因组ＲＮＡ，而不与ＩＢＤＶ－ｄｓＲＮＡ，ＡＩＢＶ－ｓｓＲＮＡ，ＥＤＳ７６－ｄｓＤＮＡ、ＭＤＶ０ｄｓＤＮＡ、Ｆ 相似文献
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人工合成Cecropin AD基因在酵母中表达 总被引：6，自引：2，他引：4
Ｃｅｃｒｏｐｉｎ ＡＤ 是由Ｃｅｃｒｏｐｉｎ Ａ的Ｎ 端１ １１ 位氨基酸残基和Ｃｅｃｒｏｐｉｎ Ｄ 的Ｃ 端１２ ３７ 位氨基酸残基构成的一个杂合肽,抗菌活性高于天然抗菌肽。根据Ｃｅｃｒｏｐｉｎ ＡＤ 的氨基酸序列,以酵母偏爱密码设计了Ｃｅｃｒｏｐｉｎ ＡＤ 基因,全长１４０ｂｐ 。采用基因片段化学合成结合ＰＣＲ 法合成Ｃｅｃｒｏｐｉｎ ＡＤ 基因。合成的Ｃｅｃｒｏｐｉｎ ＡＤ 基因克隆到ｐＣＲＴＭ２１ 上,进行ＤＮＡ 序列测定,证实合成的Ｃｅｃｒｏｐｉｎ ＡＤ 基因的ＤＮＡ 序列与设计序列完全一致。将Ｃｅｃｒｏｐｉｎ 基因定向克隆到大肠杆菌 酵母穿梭质粒ｐＣＬＷＡ２ 的Ｂａｍ ＨＩ和Ｓａｌ Ⅰ位点上,构建成含Ｃｅｃｒｏｐｉｎ 基因的重组质粒ｐＣＡＤ,将重组质粒转化入宿主酵母ＡＢ１０３ ,以大肠杆菌Ｋ１２Ｄ３１ 为指示菌,用活性蛋白酸性ＰＡＧＥ 法测定,具有抑菌活性,表明Ｃｅｃｒｏｐｉｎ 基因在酵母中获得表达。 相似文献
6.
利用Ｉｎ-Ｆｕｓｉｏｎ技术将酶切位点不匹配、目的基因内部含载体酶切位点的CRY ⅢA 基因和植物表达载体ｐＢＩ１２１相连接，分别成功构建了组成型启动子ＣａＭＶ３５Ｓ和马铃薯茎叶特异表达启动子ＳＴ-ＬＳ１驱动的CRY ⅢA 基因植物表达载体。利用冻融法将２个重组质粒转入根癌农杆菌ＬＢＡ４４０４，转化马铃薯栽培品种陇薯３号和甘农薯２号获得了转化植株，经卡那霉素筛选和ＰＣＲ 测，共有１０株阳性植株CRY ⅢA 基因成功整合到马铃薯基因组中。经实时荧光定量ＰＣＲ 检测表明，CRY ⅢA 基因在ＣａＭＶ３５Ｓ驱动的CRY ⅢA 转基因植株的根、茎、叶中均有表达，且在叶中表达量较高，茎和根次之；在马铃薯茎叶特异表达启动子ＳＴ-ＬＳ１驱动的CRY ⅢA 转基因植株中，在根中未见表达，仅在茎、叶中表达，且在叶中表达量较高。 相似文献
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马立克氏病病毒（MDV）糖蛋白D基因的分离克隆,定序及其在大肠杆… 总被引：1，自引：0，他引：1
用聚合酶链式反应（ＰＣＲ）技术，从马立克氏病病毒（ＭＤＶ）ＧＡ株感染的鸡胚成纤维细胞（ＣＥＦ）基因组ＤＮＡ中扩增出ＭＤＶ糖蛋白（ｇＤ）抗原基因１２０９ｂｐ编码序列。将该ＰＣＲ扩增产物于ＥｃｏＲＩ和ＫｐｎⅠ位点克隆进行ｐＵＣ１８质粒载体中。将ｇＤ重组ｐＵＣ１８质粒ＤＮＡ用Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ（Ｄｉｇ）标记后，在Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ中，该探针能识别ＭＤＶ基因组ＤＮＡ的Ｂａｍ ＨＩ－Ａ克隆中的Ａ 相似文献
8.
GsCRCK 基因是参与胁迫早期应答的钙／钙调素调控的受体类蛋白激酶基因,研究发现GsCRCK 正向调控拟
南芥对ＮａＣｌ和ＡＢＡ 胁迫的耐性,将耐盐蛋白激酶基因犌狊犆犚犆犓转化苜蓿,对于增强苜蓿的耐盐性具有重要的现
实意义。本研究采用农杆菌介导法将其转入农菁１号苜蓿,获得大量抗性植株。经ＰＣＲ 和ＲＴ－ＰＣＲ 检测证明
GsCRCK 基因已整合到农菁１号苜蓿基因组中并在转基因植株中转录表达。对获得的２ 个转基因株系进行耐盐
性分析,在３００ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ条件下进行胁迫处理,测定处理０,３,６,９,１２,１５ｄ后的质膜透性、丙二醛（ＭＤＡ）和叶
绿素（Ｃｈｌ）含量,以及胁迫１５ｄ时的ＳＯＤ 活性;并统计４００ ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ处理１５ｄ时各株系的死亡率。结果显
示,３００ｍｍｏｌ／Ｌ 高盐胁迫１５ｄ后转基因苜蓿仍能正常生长,而野生型苜蓿则遭受盐害严重;转基因苜蓿的相对电
导率极显著低于野生型,ＭＤＡ 含量也显著低于野生型,而Ｃｈｌ含量和ＳＯＤ 活性都显著高于野生型;在４００
ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ处理下,２个转基因株系的死亡率分别为１３．３３％和１０．００％,明显低于野生型植株（６３．３３％）。表明
GsCRCK 基因的导入提高了转基因苜蓿的耐盐性。 相似文献
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采用随机扩增多态性ＤＮＡ（ｒａｎｄｏｍｌｙ ａｍｐｌｉｅｄ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃＤＮＡ,ＲＡＰＤ）技术对产气英膜梭菌进行ＰＣＲ扩菌。结果,产气英膜梭菌Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ４个型均可扩增出约４３０ｂｐ的条带,Ｂ、Ｃ型还扩增出约２１０ｂｐ的条带,Ｂ、Ｄ型还扩增出约１２１０ｂｐ的条带,Ａ型还扩增出约２４０ｂｐ和６９０ｂｐ的条带,各型之间的条带差别明显。 相似文献
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ＷＲＫＹ 转录因子家族在植物生长发育各个阶段发挥重要作用。本研究运用电子克隆和ＲＴ－ＰＣＲ 结合的方法获得１个紫花苜蓿ＷＲＫＹ 转录因子家族成员的ｃＤＮＡ 序列,命名为MsWRKY56。该序列长１２６７ｂｐ,包含１个９５１ｂｐ的最大开放阅读框,编码３１７个氨基酸;构建该基因的瞬时表达载体,通过基因枪轰击洋葱表皮的方法对编码蛋白进行亚细胞定位研究,结果表明该基因编码蛋白定位于细胞核,符合转录因子的亚细胞定位特征,为进一步研究该基因编码蛋白的结构和功能奠定了基础。 相似文献
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BANYULS(BAN)基因编码的花青素还原酶是缩合单宁合成有关的一个关键酶.利用同源克隆的原理,采用RACE的方法,从紫花苜蓿中克隆得到了BAN基因(MsBAN),并对其进行了初步的分析.该基因cDNA全长1313bp,包括开放阅读框1017bp,编码339个氨基酸,在N端存在一个NADP结合位点“VIGGTGFVASLLIKQLLEKGY”.实时荧光定量PCR结果表明,该基因在紫花苜蓿荚果中表达量最高,花中最弱.在NaCl和PEG诱导下,MsBAN基因表达量明显高于对照.在外源激素ABA和GA3处理下,该基因被诱导表达.表明单宁可能在紫花苜蓿的抗逆性调控中也起到一定的作用. 相似文献
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从碱茅酵母cDNA文库中经过NaCl、NaHCO3筛选,均得到长为1153 bp碱茅6-磷酸海藻糖合成酶基因(PutTPS)片段。通过3'End cDNA amplification方法获得基因缺失的3'序列,该基因全长3358 bp,编码882个氨基酸。氨基酸序列比较结果表明,PutTPS氨基酸序列与水稻、拟南芥、玉米等多种高等植物的TPS蛋白的同源性高达60%90%。利用Northern blot技术,研究该基因的组织表达模式及NaCl、NaHCO3胁迫处理下基因的表达模式变化;同时对转pYES2- PutTPS基因酵母菌株进行盐、碱、氧化胁迫、渗透胁迫处理,观察其在逆境下的生存表现。结果表明,PutTPS具有组织表达特异性,其中在根和花中表达量最大;NaCl、NaHCO3会诱导PutTPS 基因在根和叶中的上调表达;同时重组酵母菌株对盐碱、氧化、渗透胁迫及干旱等逆境的适应能力显著增强。以上研究结果表明,碱茅PutTPS基因与逆境之间具有一定的应答关系,并在植物适应环境逆境过程中起着重要的作用。 相似文献
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黄颡鱼促甲状腺激素受体基因的克隆及其对饲料中添加碘化钾的表达反应 总被引：1，自引：0，他引：1
本试验旨在得到黄颡鱼促甲状腺激素受体(TSHR)基因的c DNA全长序列,同时掌握其组织表达差异,并揭示饲料中添加碘化钾对黄颡鱼甲状腺TSHR基因表达及生长性能的影响。采用c DNA末端快速扩增(RACE)技术克隆TSHR基因c DNA全长序列,再应用荧光定量PCR技术检测TSHR基因的相对表达量,并制备了碘化钾添加量分别为0(对照)、10、50和100 mg/kg的4种试验饲料进行为期27 d的黄颡鱼养殖试验。结果显示:本试验成功克隆得到长度为2 786 bp的TSHR基因c DNA的全长序列,其中开放阅读框2 238 bp,编码745个氨基酸,Blast程序分析表明黄颡鱼TSHR氨基酸序列与其他已知鱼类的相似性为60%~87%。组织表达分析结果表明TSHR基因在甲状腺组织中的相对表达量较高,其次是肝脏、肌肉和肠道。养殖试验结果表明,100 mg/kg组甲状腺TSHR基因相对表达量显著高于其他各组(P0.05),50和100 mg/kg组的增重、特定生长率和饲料系数显著优于对照组(P0.05)。由此得出,饲料中添加适量的碘化钾不仅影响TSHR基因的表达,还能有效促进黄颡鱼的生长。 相似文献
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利用兼并PCR及RACE技术克隆了西伯利亚白刺的肌动蛋白基因(Nitraria sibirica Actin, NsAct),并对其基因结构和表达特性进行了分析。所克隆的NsAct cDNA全长序列为1 831 bp,包含1 134 bp的开放阅读框,编码377个氨基酸;基因组DNA全长序列为2 913 bp,包含5个外显子和4个内含子。系统进化分析结果显示,NsAct与其他植物的肌动蛋白基因具有较高的同源性,与芒果(无患子目)亲缘关系最为接近。基因表达特性分析的结果显示,该基因在根、茎、叶中的表达量基本一致;在干旱、盐、低温及外源脱落酸胁迫下,表达量无明显变化,这些结果验证了该基因作为分子内标的可靠性。 相似文献
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He W Ohashi K Sugimoto C Tsuji M Onuma M 《The Japanese journal of veterinary research》2005,53(1-2):27-35
A cDNA clone encoding a prohibitin-like protein (Toprh) was isolated from a piroplasm cDNA library of Theileria orientalis and its nucleotide sequence was determined. An open reading frame, encoding a polypeptide of 278 amino acid residues, was found in Toprh cDNA sequence. An intron of 89 bp was identified when this cDNA clone was compared with the Toprh gene in the genome of T. orientalis. The deduced amino acid sequence of Toprh shares 93.8, 93.1 and 69.1% identities with the prohibitins of T. parva (from chromosome 1), T. annulata (from chromosome 1), and Plasmodium falciparum, (from chromosome 10), respectively. By Western blot analysis, Toprh was found to be expressed in the piroplasm stage of the parasites. 相似文献
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羊草乙醛脱氢酶基因LcALDH的克隆与表达分析 总被引：1，自引：1，他引：0
采用RACE技术从羊草中克隆了乙醛脱氢酶基因LcALDH的cDNA(GenBank登录号EF492045)。长为1 712 bp的LcALDH cDNA序列含有编码500个氨基酸的1 503 bp的开放读码框、66 bp的5′非翻译区和144 bp的3′非翻译区。氨基酸序列中含有醛脱氢酶家族绝对保守的谷氨酸活性位点和半胱氨酸残基活性位点。分析LcALDH基因在不同胁迫条件下的表达情况,结果表明,LcALDH的表达受到低温、干旱、高盐和ABA的正调控作用。研究结果为进一步从分子水平探明羊草的抗逆机制,挖掘并利用植物抗逆基因奠定基础。 相似文献
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禽成髓性白血病病毒p27和gag基因的克隆 总被引：1，自引：0，他引：1
禽成髓性白血病是由禽成髓性白血病病毒引起的一种禽白血病（Avian Leukosis)。禽成髓性白血病病毒的gag基因具有高度保守性，其编码的群特异性抗原p27是禽白血病病毒所共有的主要核心蛋白，可做为禽白血病的诊断抗原。本实验采用AMV感染鸡胚成纤维细胞（CEF），提取感染细胞总RNA，用随机引物反转录成cDNA，根据已经发表的AMV BAI－A株序列设计两对针对p27基因和gag基因的特异性引物，分别进行PCR，成功地扩出p27基因和gag基因，其片段分别为793bp和2．1Kb。以gag基因的PCR产物为模板，采用p27的特异性引物也成功扩出p27片段。分别将p27,gag基因与pGEM－TEasy载体进行连接，转化大肠杆菌，筛选阳性克隆，提取质粒，进行酶切鉴定。对含有p27基因的质粒进行测序，结果证明成功克隆了p27基因，间接证明了2．1Kb的片段是gag基因。p27和gag基因的成功克隆为该病的探针诊断和gag基因的表达提供了基础。 相似文献
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利用同源克隆结合RACE技术从柳枝稷（Panicum virgatum）中克隆得到了cDNA全长为1215bp的柳枝稷质膜型水通道蛋白基因（PvPIP1）,包含867bp开放阅读框序列,编码288个氨基酸,将该基因提交到GenBank,获得登录号KC955176。生物信息学分析表明PvPIP1基因分子量为30.78kD,含有6个跨膜区,2个高度保守的NPA模体结构,存在PIPs的高度保守序列GGGANXXXXGY和TGI/TNPARSL/FGAAI/VI/VF/YN。对其同源性的分析表明,PvPIP1基因与黑麦草（Lolium perenne）和大麦（Hordeum vulgare）的质膜型水通道蛋白同源性高达98%和93%。荧光定量PCR结果显示,在PEG胁迫的任何时间点PvPIP1基因的表达与对照相比都表现上调,在ABA和NaCl胁迫的9h内其相对表达量高于对照,推测PvPIP1基因可能参与柳枝稷对逆境的抗性反应。研究结果将为今后进一步探讨该基因在非生物逆境胁迫中的作用提供依据与信息。 相似文献
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二氢黄酮醇还原酶(dihydroflavonol reductase,DFR)是缩合单宁生物合成途径中的关键酶,在单宁的合成中起着重要的作用。根据同源克隆的原理,利用RACE技术,从“中苜一号”苜蓿中克隆得到DFR基因(MsDFR),并对其进行了序列分析及不同胁迫条件下的表达模式分析。结果表明,MsDFR基因cDNA全长1 402 bp,包括开放阅读框1 023 bp,编码340个氨基酸,在N端存在1个NADP结合位点“VTGASGFIGSWLVMRLMERGY”,中部存在1个底物特异性结合的氨基酸基序“TLNVTEDQKPLWDESCWSDVEFCRRV”。实时荧光定量PCR结果表明,该基因在荚果中表达量较高,根中较弱;在NaCl和GA3诱导下,MsDFR基因表达受到抑制;在黑暗条件下,该基因被诱导表达。由此推测“中苜一号”苜蓿中可能存在不依赖于GA3信号的单宁合成途径。 相似文献
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Sox基因家族是在动物中发现的一类重要的转录调控因子。基于生物信息学和RACE策略,从家蚕胚胎中克隆了一个与果蝇E族Sox基因成员同源的基因的全长cDNA,命名为BmSoxE(GenBank登录号:HQ728280)。BmSoxE的cDNA序列全长为1 398 bp,编码222个氨基酸。生物信息学分析显示,BmSoxE蛋白序列含有典型的HMG-box结构域和数个磷酸化位点。组织表达谱分析发现,BmSoxE基因在家蚕生殖腺中高量表达;时期表达谱分析表明,从家蚕的幼虫期一直到成虫期,Bm-SoxE基因的表达维持在较高水平,暗示BmSoxE基因在家蚕性别决定和分化中可能发挥了调控作用。 相似文献