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绒山羊生长期次级毛囊cDNA消减文库的构建及其序列分析 总被引：2，自引：1，他引：1
【目的】构建绒山羊生长期次级毛囊的消减文库,寻找绒毛生长的相关候选基因。【方法】以生长期次级毛囊cDNA为tester,休止期次级毛囊cDNA为driver,利用抑制性消减杂交技术构建生长期次级毛囊消减文库并进行生物信息学分析。【结果】构建了具有高消减效率的cDNA文库。随机挑取20个阳性克隆进行PCR扩增,插入片段长度主要分布在250～1 000 bp之间。挑取750个克隆进行测序,得到342条有效序列,平均长度596 bp。进行同源性分析,有298个与nucleotide数据库山羊及其它物种的已知序列同源。在EST数据库中找到38个相似EST序列和6个无同源性序列。对298个已知功能基因的ESTs进行分类,细胞分裂类为13个、细胞信号类为49个、细胞结构蛋白52个、细胞防御类21个、代谢类46个、基因/蛋白表达类37个、未分类的80个。【结论】应用SSH技术,构建了绒山羊生长期和休止期次级毛囊差异表达基因的cDNA文库,为进一步筛选绒毛生长相关的候选基因奠定了基础。 相似文献
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【目的】检测健康C57BL/6和A/J小鼠常规免疫指标,构建脾脏消减cDNA文库并筛选差异表达基因,以探讨两品系小鼠对猪链球菌抗病性差异的分子机制。【方法】利用ELISA法检测血清常规免疫指标,抑制性消减杂交（suppression subtraction hybridization,SSH）技术构建8周龄小鼠脾脏差异表达基因的cDNA文库。【结果】试验结果表明,A/J品系小鼠血清中IgA水平明显高于C57BL/6品系小鼠（P＜0.05）,而血清IgG和IFN水平在两品系小鼠间均无显著差异。对筛选的149个阳性克隆进行测序,去除冗余的cDNA序列载体并聚类拼接后获得56条差异表达序列标签（ESTs）。利用Genebank的BLAST分析核酸和蛋白质同源性比较,26个不同的基因或ESTs具有高度的同源性,2条ESTs未找到同源序列。【结论】筛选到很多EST与信号转导、细胞凋亡及免疫等重要功能基因高度同源,为研究猪链球菌的致病机理和防治提供了实验依据。 相似文献
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【目的】构建白粉菌诱导下中国野生毛葡萄"商-24"的抑制消减文库,获得抗白粉病差异表达基因EST序列。【方法】应用抑制消减杂交(Suppression subtractive hybridization,SSH)技术,构建白粉菌诱导下高抗白粉病的中国野生毛葡萄"商-24"叶片SSH-cDNA文库,通过生物信息学方法对文库中的EST序列进行分析。【结果】成功构建了白粉菌诱导的中国野生毛葡萄"商-24"抑制消减cDNA文库,对消减文库测序后获得了200个EST序列,大小为300～1000bp;BLAST分析表明,其中19个EST序列与已知功能基因序列同源性很高,分别参与了植物的防卫反应、胁迫反应、细胞解毒和信号转导等。【结论】获得了葡萄抗白粉病的EST序列,这为进一步克隆抗葡萄白粉病基因、探明其抗病分子机理奠定了基础。 相似文献
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中国野生华东葡萄抗霜霉病抑制消减文库构建及初步分析 总被引：3，自引：0，他引：3
【目的】分离和获得中国野生华东葡萄抗霜霉病相关基因片段的EST序列。【方法】以高抗霜霉病的中国野生华东葡萄（V.pseudoreticulata）白河-35-1 株系为材料,以田间接种葡萄霜霉菌的幼嫩叶片为处理,以田间自然生长的未接种幼嫩叶片为对照,分别提取RNA,采用抑制消减杂交技术构建抗霜霉病基因的消减正交和反交两个文库,在文库中,选择3个EST序列,用半定量PT-PCR检验构建文库中EST片段的表达情况。【结果】构建的文库中EST片段的大小在150～900 bp,经筛选文库,得到正交库有效的ESTs 85条,反交库ESTs 29条,所获序列经过BLASTn和BLASTx网上序列比对,其中有78条ESTs与GenBank中其它植物相关基因序列有较高的同源性,31条为未知功能序列,已登录GenBank 114条ESTs,登录号:FG106789-FG106902。进一步利用半定量RT-PCR 对文库中3个基因的表达情况进行了分析,证明这些EST序列是可以表达的。【结论】经初步分析这些序列的功能,涉及抗病信号传导、能量代谢、蛋白质代谢、核酸代谢、光合作用及膜运输和代谢等方面,其中获得与抗病直接相关的ESTs 23条,下一步是通过对获得的EST序列进行末端快速分析（RACE）技术,获得抗霜霉病基因全长序列,并进行原核和真核表达研究验证基因全长序列功能,为研究葡萄抗霜霉病的基因提供依据。 相似文献
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为分离鉴定巨型艾美球虫上海株与南通株间免疫原性的差异表达基因,分别以巨型艾美球虫上海株孢子囊cDNA为驱动组,以南通株孢子囊cDNA为试验组,或相反,利用抑制消减杂交(SSH)方法,通过2轮杂交和2次PCR分别构建了2个抑制性消减文库.随机从2个消减文库中分别挑取96个克隆产物,经PCR鉴定上海株和南通株孢子囊消减文库的重组率分别为91%和94%,差异基因片段大小为250～1 000 bp.从每个文库中随机挑取30个阳性克隆测序,并进行同源性比较分析,结果表明:从上海株cDNA消减文库中获得了19个单一有效序列,其中15个为未知序列;从南通株cDNA消减文库中获得了16个单一有效序列,其中13个为未知序列.这些结果将为分离巨型艾美球虫新功能基因和进一步探索球虫抗原变异相关的分子机理奠定基础. 相似文献
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【目的】筛选影响绵羊羊毛性状的重要候选基因,为研究羊毛性状形成的分子机制奠定基础。【方法】利用抑制性消减杂交技术构建中国美利奴超细型和哈萨克羊兴盛期皮肤组织间正、反向消减cDNA文库,并对差异基因进行测序和生物信息学分析;应用半定量RT-PCR和实时荧光定量RT-PCR对部分差异基因进行鉴定。【结果】①从所构建绵羊皮肤组织的正、反向消减cDNA文库中分别获得153和143个ESTs,其中分别包括5和4个未知功能的ESTs,推测可能是新基因;对部分已知功能ESTs进行了GO聚类分析、通路分析和蛋白互作分析,结果显示粗、细毛羊之间存在一定差异;②文库中的3个差异基因KRTAP8-2、Trichohyalin和KRTAP3-2均能在皮肤中特异性地高表达,其中KRTAP8-2和Trichohyalin基因在中国美利奴超细型羊皮肤组织中的表达丰度分别是哈萨克羊的3.45和2.07倍,而KRTAP3-2基因在哈萨克羊皮肤组织表达丰度是中国美利奴超细型羊的1.87倍。【结论】成功构建了中国美利奴超细型和哈萨克羊皮肤组织间抑制性消减cDNA文库,初步筛选出一批可能影响羊毛性状的差异表达ESTs。 相似文献
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《云南农业大学学报(自然科学版)》2015,(5)
蜜蜂的蜂王和工蜂是两种不同的表型,这是基于基因的差异表达,而不是遗传物质的多态性。本研究以雌性东方蜜蜂为材料,利用抑制消减杂交技术构建东方蜜蜂蜂王和工蜂的基因差异表达的文库。挑选插入片段大于200 bp的330个阳性克隆进行测序,蜂王消减文库176个,工蜂消减文库154个。测序后蜂王消减文库获得161条ESTs序列,工蜂消减文库获得142条ESTs序列。获得的序列采用DNAstar seq Man软件进行载体、接头和低质量序列去除后进行ESTs分析,蜂王消减文库获得110个contings,工蜂消减文库获得81个contings,蜂王和工蜂文库均有部分重叠的ESTs序列。在NCBI上进行在线BLASTx和t BLASTn同源比较,发现在蜂王的ESTs中有62个已知ESTs,3个未知ESTs,工蜂的ESTs中有49个已知ESTs,8个未知ESTs。通过基因本体论进行功能分析,大部分差异表达的基因为酶类和结合蛋白,主要参与基因的转录、翻译和新陈代谢过程。雌性东方蜜蜂差减文库的构建,为进一步研究蜜蜂级型分化的机制奠定了基础。 相似文献
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【目的】构建烟草叶片全长cDNA文库并测序,发掘与烟叶发育、代谢和抗逆相关的基因,为进一步研究功能基因奠定基础。【方法】以烟草苗期叶片为试验材料,利用改进的Cap-trapper法构建烟草叶片全长cDNA文库。利用测序技术获得大量的EST序列,采用生物信息分析手段,对所测EST进行拼接和功能注释。【结果】构建了烟草叶片的全长cDNA文库,该文库滴度为1.2×106 pfu•mL-1,平均插入片段在1.4 kb左右。利用该文库测序了5 280个克隆,获得5 233条高质量表达序列标签（EST）,序列拼接出3 922个单一基因;同源比对分析表明,89.7%的基因与已知功能基因具有较高的同源性,这些基因涉及细胞生长、信号转导、翻译合成、抗逆反应和能量代谢等功能;并详细鉴定了部分与烟碱合成和抗病相关的基因。【结论】通过Cap-trapper法成功构建了高质量的烟草幼苗叶片全长cDNA文库;大规模EST测序分析挖掘到大量与烟草幼苗叶片发育、抗逆、抗病、烟碱代谢相关的侯选基因。 相似文献
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【目的】寻找苹果短枝型枝条形成相关基因,为进一步探索苹果短枝型芽变形成机理及选育新的短枝型苹果品种奠定基础。【方法】利用抑制性差减杂交技术构建正反向苹果短枝型芽变枝条和正常型枝条差异表达cDNA文库,利用荧光定量RT-PCR验证文库中克隆的插入片段。【结果】从两个文库中共获得291个有效阳性克隆,插入片段大小主要分布在300—600 bp之间。利用GenBank的BLAST比对分析,其中126个表达序列标签（EST）找到了与之匹配的同源序列。获得的cDNA片段功能涉及代谢、转录、胁迫响应、转运、光合和信号转导;有165个EST片段未找到同源序列。对文库中EST序列进行实时荧光定量RT-PCR验证,结果显示这些EST序列在短枝型芽变枝条与正常型枝条之间差异性表达。【结论】通过构建短枝型苹果正反向文库,得到一些与短枝型苹果枝条节间长度相关联的基因,这些基因可能对短枝型苹果枝条的伸长具有一定作用。 相似文献
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【目的】分离半番鸭羽色相关基因,探索半番鸭羽色基因表达调控的分子机制。【方法】以半番鸭白羽皮肤和黑羽皮肤分别作为试验组（tester）和驱动组（driver）,利用双链特异性核酸酶（duplexspecific nuclease,DSN）介导的均一化消减杂交方法,构建半番鸭羽色相关基因消减cDNA文库,同时采用实时荧光定量PCR方法对文库质量进行验证。【结果】①从文库中随机选取144个阳性克隆进行测序分析,最终共获得64条有效序列,平均长度为1 031 bp;经BLAST比对发现,21条具有同源序列,且同源性平均为92.8%;43条未找到匹配序列,推测可能为羽色相关新基因;②Geneontology功能分析表明,已知基因参与信号转导、细胞结构、物质转运、细胞凋亡、细胞与机体防御、转录与表达调控等诸多生物学过程,并且与色素形成和转运存在不同程度的相关性。【结论】经实时荧光定量PCR鉴定后,所建文库质量良好,能够有效地富集白羽皮肤特异表达基因。 相似文献
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【目的】肉鸡胫骨软骨发育不良（TD）是肉鸡常见的一种骨骼性疾病,研究重组GSTA3蛋白对福美双诱导的TD肉鸡软骨细胞中抗凋亡基因BAG-3表达的影响,为治疗TD提供新的思路和方法。【方法】将120羽1周龄肉雏鸡随机分为6组（编号为A、B、C、D、E、F组）。A、B、C组为基础日粮对照组,D、E、F组为添加福美双日粮诱导TD组。试验饲喂福美双2 d诱发TD,在添加福美双第1、3、5、7天,腿部肌肉注射重组鸡GSTA3蛋白和磷酸盐缓冲液,A组与D组注射（100 μg·kg -1）磷酸盐缓冲液;B组与E组注射低剂量（100 μg·kg -1）GSTA3;C组与F组注射高剂量（200 μg·kg -1）GSTA3。试验历时23 d。添加福美双后1、2、4、6、10和15 d采集胫骨生长板。通过Real-time qPCR检测BAG-3基因的mRNA水平,利用免疫组化来检测BAG-3蛋白表达水平。【结果】Real-time qPCR结果显示,TD损伤修复期内,相比较于基础日粮对照组,福美双对照组肉鸡胫骨生长板中BAG-3 mRNA的表达水平基本都显著上调（P<0.05）;相比较于福美双对照组,E和F组在第2、4、10、15天都有显著差异,且在第10和15天显著低于福美双对照组（P<0.05）,表明与D组相比恢复较快。免疫组化结果表明BAG-3蛋白在肉鸡胫骨软骨细胞的增殖区和前肥大区无表达,只在肥大区细胞质中表达;福美双组与空白对照组相比,BAG-3蛋白表达增加;福美双高低剂量组与未注射蛋白的福美双组相比,重组GSTA3增加了肥大区的蛋白表达水平（第10和15天）。【结论】在福美双诱导肉鸡发生TD的过程中,GSTA3重组蛋白能够通过调控BAG-3表达参与凋亡途径,抑制细胞凋亡。在TD损伤修复期,注射GSTA3后使抗凋亡基因BAG-3蛋白表达增强,从而可参与细胞凋亡来缓解TD损伤,使得肉鸡TD生长板功能较快地恢复正常。 相似文献
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蓝塘猪和大白猪消减cDNA文库与差异基因分析 总被引：1，自引：0，他引：1
【目的】寻找肉质性状候选优势表达基因,研究猪肉质优良性状的遗传基础和分子机制。【方法】利用抑制性消减杂交技术构建蓝塘猪和大白猪肌肉组织差异表达的消减cDNA文库,利用实时荧光定量PCR法研究基因的差异表达。【结果】获得61个有效克隆。对整个文库进行测序分析,获得47条有效序列。用BLAST在线软件与GenBank 和GenBank EST等数据库进行同源序列比较,发现其中有2条未知序列。对文库中所包含的MYL1、LDHA、KPNA3、TPM3、HUMMLC2B、GNTN和Oaz等基因进行了实时荧光定量PCR检测,结果显示MYL1、LDHA、KPNA3、TPM3和HUMMLC2B这5个基因在蓝塘猪肌肉组织的表达量显著高于大白猪（P＜0.05）;GNTN和Oaz基因在大白猪肌肉组织中的表达量显著高于蓝塘猪（P＜0.05）。【结论】很多EST与肉质有关的重要基因具有很高的同源性,这些基因在蓝塘猪和大白猪中表达差异显著（P＜0.05）。 相似文献
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琯溪蜜柚BAC文库的构建和汁胞粒化相关基因的筛选 总被引：1，自引：0，他引：1
【目的】构建琯溪蜜柚BAC文库,利用该文库筛选与汁胞粒化相关的基因。【方法】用温和的物理方法获得高分子量DNA,部分酶切后进行回收、连接、转化,超低温保存阳性克隆。构建DNA样品混合样,PCR法筛选文库,生物信息学分析DNA序列。【结果】改进了适合琯溪蜜柚BAC文库构建的方法;构建的琯溪蜜柚BAC文库含有26112个单克隆,空载率小于1%,叶绿体DNA的污染率不超过1%,插入片段平均大小大约120kb,覆盖8倍的琯溪蜜柚基因组。利用与琯溪蜜柚汁胞粒化相关的EST序列设计PCR引物筛选文库,得到一段大小为1088 bp的DNA序列,该序列含有两段大小分别为122bp和172bp的内含子,经同源比对发现,该序列中部分序列与蓖麻(Ricinus communis)、杨树(Populus trichocarpa)多铜氧化酶(multicopper oxidase)cDNA序列分别有85%和71%的同源性;与毛叶番荔枝(Annona cherimola)和拟南芥(Arabidopsis thaliana)果胶酯酶(pectinesterase)cDNA序列分别有76%和73%的同源性。【结论】本研究构建的BAC文库适用于琯溪蜜柚功能基因组的研究,从BAC文库筛选获得的DNA序列与汁胞粒化相关的基因有高度同源性。 相似文献
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[目的]分离和鉴定扩展莫尼茨绦虫(Monieziaexpansa)新基因,为进一步研究该基因的功能奠定基础.[方法]构建扩展莫尼茨绦虫成虫cDNA文库,随机挑取重组阳性克隆进行测序,对部分序列进行引物步移法测序,获取其全长cDNA序列;采用生物信息学等分析技术对该cDNA序列进行开放阅读框(ORF)的寻找、编码氨基酸的推导、核苷酸和氨基酸同源性比较及蛋白质二级结构的初步预测.[结果]获得了1个扩展莫尼茨绦虫新基因蛋白激酶C相互作用蛋白,全长1 527 bp,编码447个氨基酸,CDS预测存在明显的BAR,PDZ结构域.编码蛋白的理论分子质量为50.173 3 ku,等电点为5.22.[结论]获得了扩展莫尼茨绦虫蛋白激酶C相互作用蛋白的全长cDNA序列,为该基因功能的试验性鉴定工作奠定基础. 相似文献
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【目的】构建茄子单性结实差减文库,分离获得茄子单性结实相关基因,研究茄子单性结实形成的分子机制。【方法】以茄子单性结实品系D-10低温条件下无籽的子房和果实,以及适温条件下有籽的子房和果实为材料,采用抑制差减杂交（SSH）技术构建正向和反向差减文库。对阳性克隆测序、BLAST比对分析、GO（gene ontology）功能注释及分类和荧光定量PCR分析。【结果】正反向文库共获得了2 347个阳性克隆;测序、序列拼接后,共获得1 248个高质量的unigenes;将其与非冗余数据库BLAST比对后,有1 109个unigenes找到同源序列,139个unigenes无同源序列为新基因。1 248个unigenes中527个在GO数据库中有功能注释,其中细胞组分、分子功能和生物过程的unigenes分别为206、445和361条,分析表明,茄子单性结实果实的差异主要发生在细胞内部,单性结实性状的表达可能受到一些因子和激酶的调控。【结论】成功构建了茄子单性结实不同时期果实的抑制差减文库,获得3个可能与茄子单性结实相关的unigenes,包括MADS-box基因、雌蕊伸展相关蛋白和果实膨大相关基因。 相似文献