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为了提高β-甘露聚糖酶的活性及稳定性,通过基因克隆技术克隆并表达了一株分离自椰果的内生枯草芽孢杆菌YZ-21(Bacillus subtilis YZ-21)β-甘露聚糖酶基因ManA,并使用3,5-二硝基水杨酸法(DNS)测定了酶活性及稳定性。结果表明：β-甘露聚糖酶基因ManA序列全长1 104 bp,与相同来源的β-甘露聚糖酶同源性高达97.56%,具有ManA保守结构域,符合糖苷水解酶家族GH26的典型特征。将ManA连接到pET-32a表达载体上,构建重组表达质粒pET-ManA,并导入大肠杆菌BL21(DE),经诱导获得了β-甘露聚糖酶基因ManA的高效表达。表达产物经过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)凝胶电泳分析,显示条带大小约为56.07 ku。重组酶活性为372.86 U/mL,酶学性质研究发现其最适反应温度为40℃,最适pH为7.0,最佳反应底物是瓜豆胶,酶活性能够达到392.54 U/mL。在55℃处理120 min后,酶活仍保留69.8%,pH为4.0～9.0时处理30 min后酶活性均能保留60%以上,且金属离子Ca2+、Co 相似文献
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从河南省济源市猪场仔猪粪便中筛选得到1株产β-甘露聚糖酶的菌株，通过外观形态学分析、生理生化结果分析、16S rDNA序列分析及构建系统发育树结果，鉴定该菌株为沙福芽孢杆菌（Bacillus safensis），命名为WBT0011。通过β-甘露聚糖酶和魔芋胶、瓜尔豆胶制备甘露寡糖，发现魔芋胶和瓜尔豆胶降解为多种甘露寡糖产物，说明二者水解较为完全，本研究旨在为β-甘露聚糖酶的应用及进一步工业化生产甘露寡糖的工艺优化提供帮助。
[关键词] β-甘露聚糖酶|筛选|沙福芽孢杆菌|甘露寡糖 相似文献
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《养殖与饲料．饲料世界》2017,(12)
β-甘露聚糖酶属于半纤维素酶类,在动物生产、饲料行业中应用广泛。本文综述了β-甘露聚糖酶的酶学性质、酶活力测定方法及影响因素等方面的研究进展,提出了统一的国家级检测方法和掌握影响酶制剂测定过程中各因素的关键点将成为今后研究的重点,为β-甘露聚糖酶的深入研究提供参考。 相似文献
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试验初步研究了一株黑曲霉菌种所产酸性β-甘露聚糖酶的酶学特性,主要是这种酸性β-甘露聚糖酶受到温度、pH值等因素影响时的酶活性变化,并对这种酸性β-甘露聚糖酶降解大豆皮的能力和在石油开采(酸性β-甘露聚糖酶水解瓜儿豆胶的能力)中的应用做了实验。结果表明,这种酸性β-甘露聚糖酶在较大范围的温度条件下酶活性稳定,能够耐受较宽的pH值环境,并且对大豆皮的降解作用明显优于对照样品,这种酸性β-甘露聚糖酶在石油开采中的破胶效果非常好,能够耐受极端的地质条件,与国外产品对比具有很高的性价比,为酸性β-甘露聚糖酶在更宽领域的应用提供指导。 相似文献
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研究β-甘露聚糖酶在低能量日粮下对AA+鸡的影响。选取240羽1日龄健康的AA+肉鸡,随机为4个处理组,分别为正对照组(常规日粮)、负对照组(低能量日粮)、试验Ⅰ组(常规日粮+400 g/tβ-甘露聚糖酶)和试验Ⅱ组(低能量日粮+400 g/tβ-甘露聚糖酶),每组处理3个重复,每重复20只肉鸡。试验期42 d。结果表明:β-甘露聚糖酶能显著提高21~42 d的低能量日粮AA+鸡平均日增质量和营养物质的表观利用率,降低料重比;免疫器官指数也有不同程度的提高,差异不显著;显著降低21 d盲肠内容物的pH和大肠杆菌数量,提高乳酸菌的数量,差异显著。这说明,低能量日粮中添加β-甘露聚糖酶的效果优于常规日粮。 相似文献
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β-甘露聚糖酶的基因工程技术研究 总被引：1，自引：0，他引：1
β-甘露聚糖酶是近年来饲料用酶制剂研究的热点之一,也是近10年来在美国应用最广泛的饲用酶制剂之一(Hashem等,2001;Kurakake等;2001;Parker等,2001)。β-甘露聚糖酶(β-mannanaseEC3.2.1.78)是一种半纤维素水解酶,以内切方式降解β-1,4糖苷键,降解产物的非还原末端为甘露糖,其作用底物包括葡萄甘露聚糖、半乳甘露聚糖及β-甘露聚糖等。β-甘露聚糖酶的来源非常广泛,包括植物、细菌、真菌、放线菌甚至软体动物(Hashem等,2001;Kurakake等;2001;Parker等,2001;陈小兵等,2004,2005)。甘露聚糖是植物性饲料原料中除纤维素、木聚糖之外,分布… 相似文献
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饲用β-甘露聚糖酶的研究及应用 总被引：3，自引：1，他引：2
β-甘露聚糖酶是最重要的饲用酶制剂之一,是一种新型饲料添加剂。添加β-甘露聚糖酶主要有促进动物生长,预防动物疾病;提高动物的饲料转化效率;减少粪便排泄,减轻环境污染等作用。作者从β-甘露聚糖酶的来源、理化性质、作用机理及其在动物生产中的应用4个方面阐述了饲用β-甘露聚糖酶的研究及应用。 相似文献
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β-甘露聚糖酶是一种新型的内切酶制剂,能够水解甘露聚糖等含有β-1,4-D-甘露糖苷键的非淀粉多糖,具有消除抗营养因子的作用。β-甘露聚糖酶不仅能够降低肠道黏度,促进营养物质的高效吸收,还能够分解甘露聚糖,使植物性饲料细胞壁中包裹的营养物质得到充分释放,提高饲料的利用率。甘露寡糖具有益生元的作用,通过调节肠道微生物菌群平衡优化肠道环境,增强机体免疫力。β-甘露聚糖酶作为饲料添加剂用于动物生产,可改善畜禽的生长性能和饲料转化率,促进动物生长发育。文章就β-甘露聚糖酶的来源、分子结构、生物学功能及其在动物生产中的应用进行综述,为β-甘露聚糖酶在饲料中的研究与应用提供参考。 相似文献
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鸡毒支原体黏附蛋白PvpA的原核表达与纯化 总被引：1，自引：0，他引：1
利用基因重组技术将PvpA基因的PCR扩增产物与原核表达栽体pET-41a(+)连接,转化入DH5a感受态细胞,通过PCR、双酶切及测序鉴定后,将阳性重组质粒转化入大肠杆菌BL21(D3)受体菌,用IPTG诱导蛋白表达.用纯化后的融合蛋白免疫新西兰大白兔,制备PvpA蛋白多克隆抗血清,并用Western blotting检验抗体特异性.结果表明,本研究成功获得PvpA纯化蛋白,在免疫印迹试验中,兔抗PvpA高免血清能与目的蛋白发生阳性反应,证实表达产物为特异性蛋白. 相似文献
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本试验旨在探讨固态酶制剂评估中酶的适宜提取液及固-液分离方法。采用4×3双因素完全随机设计,其中提取液分别为去离子水、乙酸-乙酸钠缓冲液(0.1 mol/L,p H 5.50)、磷酸盐缓冲液(0.05 mol/L,p H 6.00)和0.9%Na Cl溶液;溶液提取后的固-液分离方法分别为不分离、3 000 r/min离心3 min和中速滤纸过滤。每个处理5个重复,每个重复设2个平行,测定各个处理下酶的活性,并考察提取液的类型对酶制剂产品(α-半乳糖苷酶除外)溶解离心后溶液中溶质及蛋白质含量的影响。结果表明,磷酸盐缓冲液溶解木聚糖酶后活性最高(P0.05);乙酸-乙酸钠缓冲液、磷酸盐缓冲液及0.9%Na Cl溶液溶解β-葡聚糖酶后活性相当(P0.05),且均显著地高于去离子水(P0.05);去离子水溶解β-甘露聚糖酶后活性最高,其次为乙酸-乙酸钠缓冲液,两者都显著地高于磷酸盐缓冲液和0.9%Na Cl溶液(P0.05)。提取液类型对α-半乳糖苷酶活性无显著影响(P0.05)。酶制剂溶解后的固-液分离方法对木聚糖酶的测定活性无显著性影响(P0.05);提取液离心或过滤后β-葡聚糖酶活性最高(P0.05);提取液离心后β-甘露聚糖酶活性最高(P0.05);而提取液不分离时α-半乳糖苷酶的活性最高(P0.05)。提取液的种类和酶制剂溶解后的固-液分离方法对4种非淀粉多糖酶的测定活性有极显著的交互作用(P0.01)。乙酸-乙酸钠缓冲液对木聚糖酶制剂的溶解度最大(P0.05),去离子水和0.9%Na Cl溶液均对β-葡聚糖酶及β-甘露聚糖酶制剂的溶解度最大(P0.05)。然而,乙酸-乙酸钠缓冲液溶解木聚糖酶、β-葡聚糖酶、β-甘露聚糖酶后提取液中蛋白质的含量均最低(P0.05)。上述结果表明,乙酸-乙酸钠缓冲液溶解4种固态酶制剂可以最有效地将酶蛋白提取出来,α-半乳糖苷酶提取后不宜固液分离,而其他3种酶的提取液适宜进行离心分离。 相似文献
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为表达马驽巴贝斯虫新疆伊犁株Bc48基因,制备多克隆抗体,试验根据GenBank中马驽巴贝斯虫Bc48基因序列,设计合成1对特异性引物,以提取的新疆株Bc48基因组DNA为模板进行PCR扩增,将扩增产物克隆至原核表达载体pET-28a（+）中,阳性质粒转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中,经IPTG诱导后表达产物进行SDS-PAGE分析,切胶纯化蛋白后免疫6周龄雌性BALB/c小鼠,制备多克隆抗体;同时把该基因克隆至真核表达载体pCMV-N-flag中,将阳性质粒转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中,提取pCMV-N-flag-Bc48质粒转染到293T细胞中进行真核表达。结果显示,获得了大小约为15 ku的融合蛋白,与预期目的蛋白大小相一致;免疫BALB/c小鼠制备的多克隆抗体经ELISA和Western blotting检测、验证,能特异地识别相应抗原,其抗体效价可达1：128 000,说明该多克隆抗体有较高的抗体效价和特异性;真核表达质粒在293T细胞中表达Bc48蛋白。本试验可为进一步研究马驽巴贝斯虫功能基因及建立快速的检测方法奠定基础,在虫株的分类学研究及候选疫苗的研制中有重要意义。 相似文献
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为建立对高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（H-PRRSV）快速准确的检测方法,本试验构建兽医临床用病毒样颗粒内标表达载体,制备检测H-PRRSV的病毒样颗粒内标。在H-PRRSV Nsp2基因保守区域设计了1对特异性引物和1个TaqMan荧光探针,通过对反应体系和扩增条件的优化,建立了检测H-PRRSV的荧光定量RT-PCR检测方法;将MS2噬菌体的成熟酶蛋白和衣壳蛋白基因序列定向插入pET-32a载体的相应位置,在载体下游插入人工合成包含引物和探针的内标基因序列,采用双酶切和PCR鉴定阳性质粒,将阳性质粒转化大肠杆菌BL21工程菌,IPTG诱导表达,制备了病毒样颗粒内标。试验结果表明,所建立的方法特异性强,灵敏度高,对8份已知病毒的检测结果显示特异性为100%,检测滴度为1 TCID50/mL病毒液,对42份临床样本的检测结果与农业部备案试剂盒检测结果完全一致,体现了较好的实用性。 相似文献
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目的克隆边缘无浆体MSP5基因,构建重组质粒,并进行表达与鉴定。方法根据GenBank公布的边缘无浆体MSP 5基因序列(AY714547)设计一对引物,无菌颈静脉采集边缘无浆体阳性的牛血,用PCR方法从4血的DNA模板中扩增MSP 5基因582bp的片断。将该片段克隆到原核表达载体pGEX-KG中,构建原核表达载体KG-MSP5,转化BL21,经IPTG的诱导表达蛋白。利用BugBuster GST Bind Purification Kit将其纯化,经Western blotting进行分析。结果重组质粒KG-MSP5,转化BL21,在IPTG的诱导下表达大小约46 kPa蛋白。western blotting分析表明其具有很好的免疫原性。结论本研究为边缘无浆体的血清学诊断试剂盒的研制奠定了基础。 相似文献
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为建立PRRSV抗体的检测方法,通过扩增PRRSV ORF6基因,将其克隆至pET-28a（＋）中,IP TG诱导重组质粒转化菌表达,经SDS-P AGE和Western blot鉴定,表明重组质粒能够表达目的蛋白;经亲和层析纯化表达蛋白,以SP A标记胶体金,用纯化M融合蛋白和羊抗猪抗体为检测线和质控线研制胶体金试纸,检测猪血清样品,比较与IDEXX ELISA试剂盒检测结果的符合率。结果表明,表达蛋白具有良好的反应性,制备的胶体金试纸与IDEXX ELISA试剂盒检测符合率为89％,该方法为P RRSV抗体的检测提供了快速简便的方法。 相似文献
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本研究用PCR方法获得猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白基因,经酶切后将ORF2 3′端部分基因克隆至原核表达载体pGEX-6p-1中,转化大肠杆菌BL21,加入终浓度为0.3 mmol/LIPTG,在30℃诱导表达6 h后,经SDS-PAGE及western-blot分析,目的基因得到正确表达,大小约为40 ku。收集菌体并进行超声裂解后证实,表达产物以可溶蛋白与包涵体共同存在。对可溶蛋白与包涵体分别进行纯化,分别用做ELISA包被抗原检测PCV2抗体,结果两者无明显差异。 相似文献
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目的表达小反刍兽疫病毒H蛋白的主要抗原位点用于检测与预防。方法用DNAStar分析小反刍兽疫病毒H基因的主要抗原位点,采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,从病羊组织中扩增PPRV的H基因的主要抗原位点并克隆到原核表达载体PET-28b中,最后用PCR、酶切和测序分析对重组质粒进行鉴定;将重组质粒转化到大肠杆菌Rosetta中,经不同浓度的IPTG诱导表达PPRVH基因的主要抗原位点;用SDS-PAGE和Western-blotting分析所有蛋白的表达。结果将RT-PCR产物电泳,得到与预期大小相符的特异性片段;对重组质粒PET-28b-H66-249和PET-28b-H281-550酶切后,均出现预期相符的片段;DNA测序表明插入片段的序列与小反刍兽疫H蛋白基因完全一致,其大小分别为569bp和831bp;将重组表达的蛋白经SDS-PAGE和Western-blotting检测,证明所有的蛋白均得到表达。结论成功表达了PPRVH基因的主要抗原蛋白,为日后的检测与预防工作奠定了基础。 相似文献