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1.
【目的】以新疆甜瓜地方品种老汉瓜为研究材料,对其全缘叶基因进行基因编辑,构建新疆甜瓜CRISPR/Cas9敲除载体,分析甜瓜耐受潮霉素最大浓度,为研究新疆甜瓜裂叶基因的功能奠定基础。【方法】在课题组前期确定甜瓜全缘叶基因PLL的基础上,结合甜瓜基因组数据,设计PLL基因外显子的特异靶位点,构建甜瓜全缘叶基因PLL的CRISPR/Cas9敲除载体,将构建好的载体转化到大肠杆菌中,并测序验证,然后对甜瓜耐受潮霉素浓度进行分析。【结果】针对全缘叶基因PLL外显子选择一个长约20 bp的靶位点,根据靶位点设计sgRNA框,并成功将其构建到CRISPR/Cas9敲除载体上,然后将载体成功转化到大肠杆菌中。分析出甜瓜可耐受潮霉素的最大浓度为10 mg/L。【结论】成功获得甜瓜全缘叶基因PLL的敲除载体,并转化到大肠杆菌中。分析出甜瓜耐受潮霉素的最大浓度,为进一步利用CRISPR/Cas9基因编辑技术研究新疆甜瓜裂叶基因pll的功能奠定基础。 相似文献
2.
【目的】以调控茶树炭疽病菌(Colletotrichum camelliae)中的植物真菌毒素(Solanapyrones)合成的CcSOL4为例，构建CRISPR-Cas9的基因敲除载体系统，为CRISPR/Cas9介导的基因组编辑技术在茶炭疽菌中的应用奠定基础。【方法】通过对转录因子CcSOL4的基因序列分析，选择5个靶点以PCBC载体为模板扩增目的片段，再与表达载体PKSE401发生重组构建基因标记载体。以携带Cas9编码基因的PKSE401双元双靶点载体系统为骨架，以PCBC载体为模板扩增相应的sgRNA,运用Overlapping PCR以及Golden Gate Cloning技术构建针对炭疽病的双靶点和三靶点CRISPR/Cas9编辑载体。【结果】双靶点载体片段及三靶点载体片段扩增后大小为650～750 bp,将上述PCR片段连入载体PKSE401,双靶点载体1Sol4和2Sol4经阳性鉴定得到650 bp片段，三靶点载体3Sol4经阳性鉴定后得到1 200 bp的片段。【结论】重组载体构建成功，并建立了茶炭疽菌C.camelliae的CRISPR/Cas9敲除体系。 相似文献
3.
【目的】验证基于CRISPR/Cas9系统构建的靶向编辑加工番茄(Solanum lycopersicum) eIF4E1基因载体的有效性,为CRISPR/Cas9系统在培育PVY抗性植株中的应用提供技术支持。【方法】构建靶向编辑番茄真核翻译起始因子elF4E1基因的CRISPR/Cas9系统表达载体,用农杆菌渗透法瞬时转化番茄植株,PCR扩增已转化植株靶位点周围DNA序列后用HaeⅢ进行酶切,回收未切开的条带与pGEM-T载体连接后进行单克隆测序。【结果】对测得的9个克隆序列进行比对分析,在PAM (protospacer adjacent motifs)上游的6~8 bp的碱基处均发生突变,并且都为单碱基的替换,导致多肽链中单个氨基酸的替换。【结论】利用CRISPR/Cas9基因组编辑系统构建的载体能够特异性地靶向加工番茄eIF4E1基因,为利用CRISPR/Cas9系统敲除eIF4E1基因,获得抗PVY病毒的番茄育种材料奠定了基础。 相似文献
4.
[目的]利用高效基因编辑系统(pHDE-Cas9)构建巨桉细胞分裂素氧化酶/脱氢酶(CTX)基因家族规律成簇的间隔短回文重复(CRISPR)载体,为开展巨桉CTX基因家族功能验证研究打下基础.[方法]设计巨桉CTX基因靶位点和引物,扩增pCBC质粒上的目的片段,BsaⅠ酶切pHDE载体并与目的片段连接形成重组质粒,转化DH5α感受态细胞.提取单克隆进行菌液PCR初步验证、重组质粒PCR验证,挑选阳性克隆质粒进行测序分析,构建CTX基因家族CRISPR载体.[结果]重组质粒PCR鉴定及测序结果表明,重组载体序列无突变,与预期序列高度一致.成功构建了巨桉CTX基因家族pHDE-CTXA、pHDE-CTXB和pHDE-CTXC同源表达载体.[结论]利用pHDE-Cas9成功构建了巨桉CTX基因家族CRISPR载体,构建过程快速、高效,为桉树基因组定点编辑打下了基础,也可为其他桉树CRISPR/Cas9表达载体的构建提供借鉴. 相似文献
5.
【目的】研究棉花GhPAO3基因的功能,通过CRISPR/Cas9技术构建棉花GhPAO3基因的基因编辑载体。【方法】筛选合适的两个PAM位点设计引物,在引物中添加接头,重叠延伸PCR,将两个靶标片段连接在一起。通过限制性核酸内切酶BsaⅠ对pRGEB32-7载体进行单酶切,使用一步法连接重叠延伸产物与线性化的pRGEB32-7载体。【结果】使用电击转化法将构建好的棉花GhPAO3基因的基因编辑载体转入农杆菌LBA4404感受态,通过卡那霉素筛选阳性单克隆菌株。【结论】条带大小与预期一致,棉花GhPAO3基因的基因编辑载体构建成功。 相似文献
6.
近年来的研究显示,CRISPR/Cas9系统是强有力的基因编辑新技术.以蝗绿僵菌为试验对象,以同源重组敲除系统为对照,研究CRISPR/Cas9系统敲除蝗绿僵菌的基因isp4核苷酸序列.阐明了CRISPR/Cas9载体构建的方法,比较了CRISPR/Cas9和Recombinase敲除技术的异同,最后通过PCR和突变菌株的表型验证了CRISPR/Cas9系统能够应用于绿僵菌.结果表明,CRISPR/Cas9在昆虫病原真菌绿僵菌中是有效的基因编辑技术. 相似文献
7.
[目的]全氟辛酸(PFOA)处理能显著诱导拟南芥Ib bHLH(Ib basic helix-loop-helix)家族4个转录因子bHLH38、bHLH39、bHLH100和bHLH101的转录水平。为了进一步分析这4个基因在响应PFOA中的潜在作用,利用CRISPR/Cas9技术构建了它们的共敲除载体。[方法]以野生型拟南芥基因中的外显子为模板,设计引物,通过两步PCR扩增法将靶向基因连接到CRISPR/Cas9载体上;将构建成功的重组质粒转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中,挑取阳性菌落,PCR鉴定正确后,将其质粒转入农杆菌GV3101感受态细胞中,再次挑取阳性菌落进行PCR鉴定正确后,提取质粒进行表达盒测序。[结果]通过两步PCR扩增法,成功将4个靶点表达盒转入到CRISPR/Cas9载体中,构建了bHLH38、bHLH39、bHLH100和bHLH101的双元CRISPR/Cas9敲除载体。[结论]成功构建的Ib BHLH家族CRISPR/Cas9敲除载体,为后续拟南芥Ib BHLH家族四突突变体材料的获得提供了可用性载体。 相似文献
8.
【目的】探究同源臂长度对CRISPR/Cas9系统介导人乳铁蛋白基因（hLF）打靶山羊β-乳球蛋白基因（BLG）座位点效率的影响,为今后体细胞核移植制备BLG -/hLF +基因打靶山羊提供科学依据,也为CRISPR/Cas9基因编辑系统介导BLG基因或其他基因座位点定向精准分子修饰的遗传育种提供借鉴。【方法】针对山羊BLG基因第一外显子区域设计构建sgBLG/Cas9载体,电转染山羊胎儿成纤维细胞,PCR验证BLG基因座位点致突变活性;以BLC14乳腺特异性表达载体为基础构建3种同源臂长度（6.0、3.5和1.2 kb）的hLF基因打靶载体,分别与sgBLG/Cas9载体共转染山羊胎儿成纤维细胞,经500 μg/mL G418筛选后,采用PCR检测基因打靶情况。【结果】sgBLG/Cas9载体在山羊胎儿成纤维细胞BLG基因座附近切割DNA双链的致突变活性效率在30%~35%。构建获得3种同源臂长度的hLF基因打靶载体（BLC14-1、BLC14-2和BLC14-3）,对应的同源臂长度分别为6.0、3.5和1.2 kb;将3种hLF基因打靶载体与sgBLG/Cas9载体共转染山羊胎儿成纤维细胞,经5次电转染和G418筛选,分别获得83、77和86株药物抗性细胞,经PCR同源重组检测最终获得42、38和44株BLG -/hLF +基因打靶细胞株,即hLF基因在山羊胎儿成纤维细胞BLG基因座的平均打靶效率分别为50.6%（42/83）、49.4%（38/77）和51.2%（44/86）。3种不同长度同源臂构建的hLF基因打靶载体在山羊BLG基因座位点的打靶效率在统计学上无显著差异（P>0.05）,表明同源臂长度对CRISPR/Cas9介导hLF基因打靶山羊BLG基因座位点无显著影响。【结论】利用CRISPR/Cas9系统介导hLF基因打靶山羊胎儿成纤维细胞BLG基因座位点能成功获得多株hLF +/BLG -基因打靶细胞株（BLG基因座定点打靶hLF基因）,但打靶载体同源臂长度对CRISPR/Cas9系统介导BLG位点定向整合hLF基因的打靶效率无明显影响。 相似文献
9.
【目的】克隆山黧豆β-腈基丙氨酸合成酶基因(CASase)DNA全长序列,构建CRISPR/Cas9敲除载体,为筛选"低毒、高硫"山黧豆品系奠定基础。【方法】以萌发4d山黧豆幼苗根部为材料,提取其基因组DNA,利用PCR克隆CASase基因全长;经序列同源性、内含子、外显子、sgRNA靶位点和脱靶分析后,在CASasecDNA上选取5个sgRNA靶位点进行寡核苷酸链设计和体外活性检测;从5个sgRNA靶位点中取活性较高的4个sgRNA,利用酶切连接法构建基因敲除载体pPLHACas9-sgRNA20r、pPLHACas9-sgRNA68r、pPLHACas9-sgRNA225f和pPLHACas9-sgRNA256f。【结果】获得了CASase基因3 143bp的DNA全长序列,该序列编码β-腈基丙氨酸合成酶;在CASase cDNA中选取5个sgRNA靶位点在体外均能有效剪切靶序列;菌落PCR检测结果显示,4个CRISPR/Cas9基因敲除载体构建成功。【结论】克隆了山黧豆CASase基因DNA全长,成功构建了该基因上4个sgRNA靶位点的CRISPR/Cas9敲除载体。 相似文献
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番茄U6启动子的克隆及CRISPR/Cas9基因编辑体系的建立 总被引：1，自引：1，他引：0
【目的】从番茄中克隆高效转录的SlU6启动子,构建CRISPR/Cas9基因编辑载体,并在番茄中建立CRISPR/Cas9系统,为番茄功能基因组学和分子育种研究提供技术基础。【方法】采用PCR方法从‘中蔬四号’番茄品种中克隆4种SlU6启动子,利用Transfer PCR方法分别对4个启动子进行两种不同长度的截短,分别构建8个截短的SlU6启动子驱动GUS的植物融合表达载体。利用农杆菌瞬时转化法分别转染番茄叶片,通过GUS染色筛选出在番茄叶片中转录活性较高的SlU6-2启动子。采用DNA重组技术构建以SlU6-2为启动子驱动sgRNA,以番茄白粉病相关基因MLO1和EDR1为靶序列的CRISPR/Cas9基因组编辑载体。载体构建成功后,采用PEG法转化番茄原生质体,提取基因组DNA,采用酶切/PCR法分析内源基因突变情况;采用测序法分析内源基因突变的类型。利用突变位点频率分布图来验证番茄内源启动子在番茄CRISPR/Cas9系统中的有效性。【结果】经过两轮PCR,共获得4种8个不同长度的番茄U6启动子,其长度分别是452、202、448、206、433、190、448和218 bp,启动子序列比对分析发现番茄U6启动子与拟南芥U6启动子一样,也含有比较保守的两个元件,USE和TATA框。成功构建了8个SlU6启动子分别驱动GUS的植物融合表达载体。番茄叶片染色结果显示转化后的番茄叶片均被染成蓝色,表明克隆的番茄8个SlU6启动子均具有转录活性。选择SlU6-2P4为启动子驱动sgRNA,成功构建番茄白粉病相关基因MLO1和EDR1为靶序列的CRISPR/Cas9基因组编辑载体,验证结果表明番茄内源启动子SlU6-2P4能有效地驱动sgRNA的转录,并成功实现对番茄内源基因的编辑。内源基因突变的类型都为碱基替换,突变热点仅存在于内源基因靶序列区。【结论】成功克隆了4种在番茄叶片中高效转录的SlU6启动子;基于SlU6-2启动子的CRISPR/Cas9基因组编辑载体,在番茄中成功实现对内源基因的编辑。 相似文献
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干酪乳杆菌CRISPR基因座分析 总被引：1，自引：0，他引：1
目的 目前基于酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)spCas9为核心的CRISPR/Cas9基因编辑系统在乳酸菌上的应用受到很多限制,亟待开发适合于乳酸菌的基因编辑系统。对6株干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)的CRISPR系统进行深入分析,并预测激活干酪乳杆菌自身Cas9蛋白所识别的PAM序列,为开发适用于乳酸菌的CRISPR/lcCas9基因编辑系统奠定基础。方法 以已完成全基因组测序的6株干酪乳杆菌为研究对象,利用生物信息学方法对其CRISPR系统进行深入分析,重点对不同菌株的CRISPR系统结构进行解析,并且对Cas蛋白以及spacer的同源性进行分析,最后对CRISPR区重复序列的二级结构以及Cas9蛋白识别的PAM序列进行预测。结果 6株干酪乳杆菌CRISPR系统具有相似的结构,均具有特征性的Cas9蛋白,并且Cas基因序列保守。预测到tracrRNA位于Cas9和Cas1之间,重复序列可以形成茎部长达7个碱基的二级结构。根据CRISPR的间隔区序列,6株干酪乳杆菌可被分为3个基因型,将间隔区逐一进行blast比对,结果表明6个间隔区比对上14个来源不同的原间隔序列,这些间隔序列均来源于不同质粒。干酪乳杆菌lcCas9蛋白识别PAM序列的1、3位碱基偏好T/C、A/C,2、4位碱基对G、A的偏好性比较大。结论 6株干酪乳杆菌CRISPR系统均为type-ⅡA型,Cas序列和重复序列高度保守。DR序列可以形成稳定的二级结构,TGMA为干酪乳杆菌Cas9蛋白高效识别的PAM序列。 相似文献
12.
【目的】稻米香味是水稻品质改良的一个重要内容,其性状主要受1个隐性基因Badh2的控制。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术将常规品种中的Badh2进行编辑,从而获得Badh2发生突变的基因编辑株系,使香味性状得到改良。【方法】利用CRISPR/Cas9基因编辑的原理,在水稻Badh2的第2和第7外显子处设计靶点,通过BLAST分析确定其特异性并构建到CRISPR/Cas9表达载体。以浙江省主要推广的水稻品种嘉58和秀水134的愈伤组织为受体,利用农杆菌介导的遗传转化法,通过潮霉素抗性筛选获得阳性转基因植株。转基因株系经测序明确其在Badh2的突变类型,经PCR分析与鉴定获得Badh2发生突变并无转基因标记成分的稳定株系。利用气相色谱质谱联用仪（GC-MS）检测基因编辑株系糙米米粉中2-AP的含量,明确其香味成分与非转基因对照之间的差异。【结果】在水稻第2和第7外显子处设计靶点构建表达载体,通过遗传转化转基因株系的Badh2完成了定向突变。共获得T0代嘉58基因编辑的株系15株,在第2外显子处发生突变的有8株5种不同的突变类型,均为不同单碱基插入不同位点;在第7外显子处发生突变的有7株5种不同的突变方式,均为碱基或片段缺失。获得秀水134基因编辑的株系11株,在第2外显子处共有5株,均为单碱基插入;在第7外显子处有6株,均为片段缺失。48株T1代秀水134基因编辑株系中,共获得16株无转基因标记的基因编辑株系,其中5株在第2外显子发生突变,11株在第7外显子处发生突变。4个T2代基因编辑株系的米粉中2-AP平均含量分别为0.309、0.347、0.332和0.295 μg·g -1,极显著（P<0.01）高于非转基因对照（0.046 μg·g -1）。【结论】利用CRISPR-Cas9技术可对水稻香味基因Badh2进行定向编辑,并且可获得无转基因成分的基因编辑株系,其香味性状得到明显改良。 相似文献
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【目的】构建甜瓜eIF4E基因的CRISPR-Cas9植物基因编辑系统的gRNA 表达载体。为研究eIF4E基因功能奠定基础。【方法】以新疆主栽甜瓜皇后为材料,在eIF4E基因的第一个外显子区设计gRNA引物,以载体pP1C.4为模板,扩增获得sgRNA克隆框,使用EcoR I、Xba I双酶切pP1C.4载体,利用DNA重组酶构建重组载体pP1C.4-eIF4E。【结果】经菌落PCR检测和测序,gRNA 已经成功连接到植物基因敲除载体pP1C.4。【结论】构建了植物基因敲除载体pP1C.4-eIF4E,pP1C.4-eIF4E能对eIF4E基因进行定向编辑。 相似文献
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利用CRISPR/Cas9技术研究玉米ZmFKF1在开花过程中的作用 总被引：1，自引：0，他引：1
【目的】FKF1是多种植物开花途径中发挥重要作用的关键基因。为研究玉米FKF1功能,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术将ZmFKF1进行定点编辑,获得ZmFKF1编辑突变体。同时以此为材料,通过表型分析及关键开花基因的表达量变化分析,明确ZmFKF1在玉米开花途径中的作用,为玉米分子育种及遗传改良提供理论依据。【方法】以玉米B104为材料,克隆ZmFKF1,通过序列比对明确ZmFKF1的基因结构。以ZmFKF1为靶标基因,根据CRISPR/Cas9技术原理设计靶点,将设计的靶点序列在玉米参考基因组中进行比对分析,排除非特异性靶位点,最终筛选出在ZmFKF1第1外显子上的靶位点ZmFKF1-T1,构建CRISPR/Cas9基因编辑表达载体。利用农杆菌介导法,转化玉米B104幼胚,通过抗性筛选获得抗性愈伤组织,之后诱导出芽和生根,获得T0代ZmFKF1编辑阳性植株,并利用cas9特异引物进行验证。利用靶位点扩增测序法,明确T1代ZmFKF1编辑植株在ZmFKF1预期靶标位点是否发生突变及突变的类型,筛选获得ZmFKF1定点突变纯合株系。获得这些材料后,以野生型B104为对照,统计和分析开花表型。同时,利用实时荧光定量PCR技术检测上述材料中与玉米开花途径相关的关键基因的表达量变化,对表型进行进一步的验证。【结果】在玉米FKF1的第1外显子上设计靶点构建基因编辑表达载体,通过遗传转化获得的转基因株系实现了对ZmFKF1的定点突变,共获得T0代ZmFKF1编辑阳性株系18株,在预期靶标位点上发生突变的有6株,2种不同的突变类型：单碱基插入和多碱基缺失。通过开花时间统计和分析,与野生型B104相较,3个T2代ZmFKF1编辑纯合突变体的开花时间延迟,显著（P＜0.05）晚于B104。进一步对这些材料中的开花关键基因ZmGI、conz1和ZmZCN8进行表达量检测,发现突变体中这些基因的表达明显（P＜0.05）低于野生型B104,与晚花表型相符。【结论】可利用CRISPR-Cas9技术对ZmFKF1进行定点编辑获得基因编辑突变体,且突变体开花时间明显延迟。 相似文献
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【目的】 回顾近年来基因编辑技术在园艺作物中的研究进展,为园艺作物的基础研究与品种培育提供参考。【方法】 从国内外文献资料中收集查阅CRISPR/Cas9技术在园艺作物研究中的研究报道,对其分析汇总。【结果】 传统育种手段难以满足园艺作物对产量和品质日益增长的需求,CRISPR/Cas9技术为其品种改良开辟新的道路,改变园艺作物育种格局,促进其在抵御生物胁迫,响应非生物胁迫,提高果实品质和作物驯化。【结论】 CRISPR/Cas9技术在园艺作物研究中是育种工作不可或缺的关键性技术。 相似文献
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香蕉CRISPR/Cas9基因编辑技术体系的建立 总被引：1，自引：0，他引：1
【目的】建立香蕉CRISPR/Cas9基因编辑技术体系,为在香蕉上利用CRISPR/CAS9技术开展香蕉基因功能研究和香蕉育种工作开辟新的路径。【方法】根据香蕉A基因组八氢番茄红素脱氢酶(phytoene dehydrogenase,PDS)基因组序列,利用在线工具ZiFiT Targeter Version 4.2确定合适的CRISPR/Cas9靶标序列,选择其中一个位点作为靶标位点,设计包含靶标基因MaPDS序列的sgRNA。利用一套改良的CRISPR/Cas9多靶点载体系统,以pYLg RNA-Lac Z-U6a质粒为模版,Overlapping PCR法构建U6a-sgRNA表达盒,再利用Golden Gate Cloning法将U6a-sgRNA表达盒克隆到pYLCRISPR/Cas9载体中,构建以MaPDS为靶标基因的pYLCRISPR/Cas9-sgRNA载体。构建的质粒含Cas9p和sgRNA表达盒,其中Cas9p由P_(Ubi)启动子驱动,sgRNA由水稻来源的RNA启动子U6a驱动。将构建好的载体转入农杆菌EHA105,转化香蕉主栽品种巴西蕉胚性细胞悬浮系,获得抗性再生植株。设计PCR引物扩增包含靶标序列的MaPDS序列片段,检测和分析再生植株MaPDS被编辑的情况。【结果】试验选择MaPDS作为CRISPR/Cas9靶标基因,设计一个靶标位点,利用Overlapping PCR法获得了U6a-sgRNA表达盒,利用Golden Gate Cloning法将其克隆到pYLCRISPR/Cas9的Bsa I位点,成功构建了针对MaPDS的pYLCRISPR/Cas9-sgRNA载体。经过农杆菌浸染、抗性筛选、抗性胚诱导、萌发及生根,最终获得抗性独立转化株系129个。其中,71个株系出现白化表型,产生白化表型的几率达55%。失绿突变体的出现意味着MaPDS蛋白功能丧失。随机取转化株系中的白化表型株系33个和正常表型株系14个,提取其叶片基因组DNA,扩增含有MaPDS的靶位点片段,序列分析结果表明,白化表型株系的MaPDS靶位点序列发生了基因编辑。主要是在靶位点附近增加1个碱基T或A,或是在靶位点附近或下游发生碱基颠换或转换,出现非靶标位点突变。这些突变形式均能导致MaPDS蛋白翻译错误,从而使MaPDS蛋白丧失功能,表现为白化。转化株系中表型正常植株的MaPDS靶位点序列与野生型一致,未检测到变异。【结论】成功在香蕉体内实现了对内源MaPDS的定点敲除,获得了基因定点敲除的突变体株系,为进一步利用基因编辑技术在香蕉上的应用奠定了基础。 相似文献