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将办云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白ＣｒｙⅠＡ基因的高保守区ＥｃｏＲＩ－Ｆ片段重组到ｐＳＥ－ＬＥＣＴ－１载体的ＥｃｏＲＩ位点，构建出能够高效转录ＲＮＡ的探针载体ｐＳＢＰＬ－１。该载体在Ｔ７ＲＮＡ聚合酶作用了，通过ＤＩＧ体外标记转录制备的ＲＮＡ探针，具有灵敏度高，背景清楚，省时等优点，为苏云金芽胞杆菌分子生物学研究，及对鳞翅目有特异毒性高效菌株的筛选提供了一种方便而有效的方法。 相似文献
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家蚕核多角体病毒Lef—1和DA26基因的克隆及部分序列分析 总被引：2，自引：1，他引：2
ｌｅｆ－１和ＤＡ２６基因分别位于ｅｇｔ基因的上游和下游．从ｐＵＡｃ－ｅｇｔ中分离出ＥｃｏＲＩ－ＸｂａＩ１．１ｋｂ的ｅｇｔ基因片段，进行缺口平移标记，获得探针。与ＢｍＮＰＶＤＮＡ经ＨｉｎｄⅢ酶切、电泳、转移至ＮＣ膜的ＤＮＡ进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ杂交，发现ＢｍＮＰＶＤＮＡ的ＨｉｎｄⅢＤ片段呈阳性。从ＢｍＮＰＶ基因组中分离出１０．４ｋｂ的ＨｉｎｄⅢＤ片段，用ＥｃｏＲＩ酶切得到ＨｉｎｄⅢ－ＥｃｏＲＩ２．２ｋｂ、ＥｃｏＲＩ１．４ｋｂ和ＥｃｏＲＩ－ＨｉｎｄⅢ６．８ｋｂ３个片段，分别克隆于ｐＵＣ１９中，命名为ｐＵＨＥ２．２、ｐＵＥ１．４和ｐＵＥＨ６．８。经双链测序并与ＡｃＮＰＶ相关基因序列进行比较，发现ｌｅｆ－１基因被克隆于ｐＵＨＥ２．２中，ＤＡ２６基因克隆于ｐＵＥＨ６．８中。从所测定的ｌｅｆ－１和ＤＡ２６基因的启动子及５＇端部分序列来看，它们在ＡｃＮＰＶ和ＢｍＮＰＶ之间有极高的同源性。 相似文献
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采用固相亚磷酸三酯法人工化学合成了人胰岛素样生长因子－Ⅰ（ｈｕＩＧＦ－Ｉ）基因的４条寡核苷酸 片段，再通过片段１、２与３、４末端互补配对和Ｋｌｅｎｏｗ酶促补平及酶切连接成为完整的ｈｕＩＧＦ－ＩＤＮＡ片段，用 ＥｃｏＲ Ｉ／ＰｓｔＩ酶切后克隆于 ｐＧＥＭ Ｔ－Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒ，经测序证明所得 ＤＮＡ序列与设计的序列完全一致；选用植物 偏爱密码子校正了启始密码子ＡＴＧ下游的６个密码子，并在ＡＴＧ处增加Ｋｏｚａｋ序列后，插入ｐＢＩ１２１的ＢａｍＨＩ／ ＳａｃＩ位点，构建了以 ３５Ｓ为启动子的植物表达载体；以 Ｈｉｎｄ ＩＩ／ＥｃｏＲＩ切下“３５Ｓ－Ｋｏｚａｋ－ＩＧＦ－Ｉ－ＮＯＳ（ｔｅｒ．）”插入 ｐＣＡＭＢＩＡ２３００之Ｈｉｎｄ ＩＩ／ＥｃｏＲ Ｉ位点，构建成ｈｕＩＧＦ－Ｉ植物表达载体；通过ＣａＣｌ２直接转化法将表达载体导入农 杆菌ＥＨＡ１０５（Ｒｉｆ．ｒ），并以菌落原位杂交技术和 ＤＮＡ ｄｏｔ ｂｌｏｔ对重组农杆菌进行了筛选，所获得的重组农杆菌菌株为培育ｈｕＩＧＦ－Ｉ豆药用植物奠定了基础。 相似文献
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本文重缚和构建了新城疫病毒（ＮＤＶ）融合蛋白基因,并对该基因进行了鉴定,将新城疫病毒Ｆ基因片段经ＲＴ－ＰＣＲ扩增,插入经ＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩ酶切的克隆载体ｐＵＣ１８及表达载体ｐＧＥＭＥＸ,转化大肠杆菌ＪＭ１０９株,用氨苄青霉素平板法初步筛选克隆,再用双酶切法,核酸探针,ＰＣＲ及核苷酸序列分析法鉴定,表明插入成功并且阅读框架正确。 相似文献
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利用ＰＣＲ片段延伸连接技术将ｃｒｙ１Ｅ的原启动子准确地更换与ｃｒｙ３Ａ启动子,重组ｃｒｙ１Ｅ经载体ＰＨＴ３１５克隆至枯草芽胞杆菌无芽胞突变株ＩＳ８和苏云金杆菌以色列亚种无晶体突变株４Ｑ７,获得重组菌３Ａ１ＥＢｓ和３Ａ１ＥＢｔ。聚丙烯酰胺凝胶电泳和生物测定表明,克隆改造后的ｃｒｙ１Ｅ可表达,表达的Ｃｒｙ１Ｅ对海灰翅夜蛾有毒。 相似文献
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用限制性内切酶ＥｃｏＲⅠ和ＨｉｎｄⅢ,从克隆载体ｐＵＴＳⅡ中切出一个０．９８８ｋｂＴＳＰＧⅡ基因,经ＥｃｏＲＩ和ＢｓｔＸＩ酶切鉴定,同时表达载体也用相同的酶进行酶切,经琼脂糖凝胶电泳,分别回收ＴＳＰＧⅡ基因和ｐＳＶ·ＳＰＯＲＴⅠ表达载体,用Ｔ４ＤＮＡ连接酶定向连接,转化大肠杆菌感受态细胞,挑取重组子,经ＥｃｏＲⅠ,ＢｓｔＸⅠ和ＨｉｎｄⅢ酶切鉴定,构建了重组表达质粒ｐＳＶ·ＴＳⅡ． 相似文献
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本文通过对ｐＥ３－ｍＭＴ－Ｉ－ｃＤＮＡ克隆质粒的分离纯化及鉴定，确定了ｍＭＴ－Ｉ基因确实已整合进入ＰＥ３植物双元表达载体上。并通过三亲株杂交法将ｐＥ３－ｍＭＴ－Ｉ基因转化根癌农杆菌ＬＢＡ４４０４。原位杂交结果表明，转化后的根癌农杆菌菌株ＬＢＡ４４０４中带有ｍＭＴ－Ｉ基因。 相似文献
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以ＡｃＭＮＰＶ ｅｇｔ基因为探针,通过Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交和原位杂交,克隆了含ＥｏＳＮＰＶ ｅｇｔ基因的４．９５ｋｂ ＥｃｏＲ Ｉ－Ｋ片段,并进一步亚克隆了含完整ｅｇｔ基因编码区的１．８ｋｂ ＨｉｎｄⅢ－ＥｃｏＲＶ片段。应用双脱氧链终止法,测定了基因编码区中的Ｘｈｏ Ｉ－ＨｉｎｃⅡ片段４７１ｂｐ的核苷酸全序列,计算机分析表明,该片段编码的１５７个氨基酸序列与其它杆状病毒ｅｇｔ基因保守区的Ⅳ（部分） 相似文献
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根据能形成伴胞晶体的特征，芽胞杆菌CTC菌株被鉴定为苏云金芽胞杆菌幕虫亚种。但该菌株明显不同于典型的苏云金芽胞杆菌，因为其伴胞晶体蛋白并不是由杀虫晶体蛋白基因编码，而是编码细胞表面S-层蛋白基因的产物，且伴胞晶体蛋白没有检测到对昆虫的毒性。本研究基于对CTC菌株及参照菌的16S-23S rRNA间隔区、编码S-层蛋白的基因进行扩增并测序，从系统发育水平检测到CTC菌株明显与苏云金芽胞杆菌幕虫亚种典型菌株T02存在差异，表明芽胞杆菌CTC菌株更接近蜡状芽胞杆菌。 相似文献
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IBDV南京野毒株VP2结构蛋白基因克隆与表达 总被引：5，自引：0，他引：5
用微机辅助设计合成了一对引物，用于扩增传染性法氏囊病病毒中国地方株ＶＰ２基因片段。ＲＴ－ＰＣＲ增出－１３２１ｂｐ的目的的片段，分子杂交鉴定为ＶＰ２基因。 相似文献
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外源基因在转基因抗虫油菜中的遗传行为 总被引：3，自引：0，他引：3
为了选育出稳定的转基因抗虫油菜新品种，采用卡那霉素抗性分析和PCR检测技术对转基因抗虫油菜中Bt杀虫蛋白基因的遗传行进行了研究，连续三代的研究结果表明，Bt杀虫蛋白基因以单拷贝、杂合地整合到转基因植株（T01，T02，T03，T05，T06，T07，T08）的基因组中，并稳定地遗传给后代，纯合转基因株系杂交分析表明，在不同T0转基因植株中Bt杀虫蛋白基因整合位点是不同的，T01和T05或T03和T08的Bt杀虫蛋白若整位点是同源染色体的不同座位，而其他转基因植株的Bt杀虫蛋白若整位点是在非同源染色体上。 相似文献
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用ＥｃｏＲＩ酶切ＰＲ５Ｂ４质粒，采用“Ｖ”字形内槽电洗脱法回收约０．８０４Ｋｂ牛冠状病毒基因工程抗体４Ｈ１２／１Ｄ４单链基因片段，并将其插入载体质粒ＰＥＴ－１７ｂ的ＥｃｏＲＩ位点构成重组质粒ＰＥＴ－Ｄ４，将重组质粒转化ＤＨ５α感受态细胞，在ＩＰＴＧ的诱导下表达，细菌裂解物经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳筛选，发现含ＰＥＴ－Ｄ４细菌经诱导新增一条约２８ＫＤα蛋白带，该蛋白带与设计基因工程抗体的大小相符，经光密度扫描，表达量约占菌体总蛋白的１４％ 相似文献
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对大葱的心叶除去其管状叶内的粘液。经组织捣碎机粉碎、差速离心获叶绿体粗制品;再用蔗糖不连续梯度离心的方法纯化叶绿体。对纯化的叶绿体经蛋白酶及SDS处理后,用酚抽提、乙醇沉淀的方法获得叶绿体DNA。对本法获得的叶绿体DNA用限制性酶解,获得清晰的酶切电泳条带;与烟草rbc L基因探针杂交,确证本法获得的DNA是叶绿体DNA,可供分子克隆及基因分析等进一步研究。 相似文献
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苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白Cry1Ba3活性区的研究 总被引：1，自引：0，他引：1
通过对Cry1Ba3蛋白序列的分析，以及与已知Cry蛋白比较，设计了6对特异性引物，PCR扩增获得6种不同长度的cry1Ba3基因片段。将这些基因片段克隆到pET-21b载体上，导入大肠杆菌BL21中进行诱导表达，最终得到6种不同长度的Cry1Ba3蛋白片段。采用浸叶法检测这些蛋白片段对小菜蛾的杀虫活性，研究结果表明含有第1-685位和含有第22-655位氨基酸的蛋白片段对小菜蛾的毒性，与全长Cry1Ba3蛋白相比，没有改变；含有第54-655位氨基酸的蛋白片段对小菜蛾的毒力明显降低；而含有第22-627位和含有第85-655位氨基酸的蛋白片段完全丧失了对小菜蛾的活性。上述结果表明Cry1Ba3蛋白对小菜蛾的最小活性区在第22-655位氨基酸之间。 相似文献
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提取衣藻总 DNA,以此为模板并参照肌动蛋白基因编码区端的序列合成寡聚核苷酸引物,进行聚合酶链式反应,扩增到一个1.2 kb 的 DNA 片段.将此片段进行克隆并经分子探针杂交,证明此片段为衣藻肌动蛋白基因.经限制性核酸内切酶处理,构建了衣藻肌动蛋白基因的物理图谱.根据物理图谱进行亚克隆以后,测得了编码区5′端的618个核苷酸的顺序.衣藻肌动蛋白基因的编码序列与高等植物之间的同源性大于90%,高于与高等动物、原生动物及真菌的同源性.但在基因的结构上,衣藻肌动蛋白基因又明显地不同于高等植物,在已经测定的基因片段上,没有发现内含子的存在.经限制性内切酶片段多态性分析,衣藻中含有一个肌动蛋白基因拷贝. 相似文献