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奶牛乳腺上皮细胞的不同培养方法比较及激素和细胞因子对β-酪蛋白mRNA表达的诱导 总被引：1，自引：0，他引：1
本试验旨在建立一种高效的奶牛乳腺上皮细胞培养方法,并研究不同激素和细胞因子对其表达β-酪蛋白mRNA的诱导作用.分别采用组织块培养法和机械破碎法培养奶牛乳腺上皮细胞,利用成纤维细胞和乳腺上皮细胞对胰酶的敏感性不同,对获得的细胞进行纯化.通过细胞计数法测定纯化细胞的生长曲线,通过免疫荧光组织化学染色法检测角蛋白18的表达,通过实时定量PCR法检测8种不同激素和细胞因子组合培养液诱导细胞表达β-酪蛋白mRNA的效果.结果表明:通过机械破碎法可以分离得到增殖旺盛的奶牛乳腺上皮细胞,与组织块培养法相比,具有细胞迁出速度快等优点.细胞生长曲线呈典型的“S”型.在纯化的乳腺上皮细胞及第20代乳腺上皮细胞中都检测到角蛋白18的表达.100 ng/mL类胰岛素生长因子Ⅰ(IGF-Ⅰ)显著提高了乳腺上皮细胞中β-酪蛋白mRNA的表达(P＜0.05).由结果可知,本试验采用的机械破碎法是一种高效的奶牛乳腺上皮细胞培养方法,100 ng/mL IGF-Ⅰ对细胞中β-酪蛋白mRNA表达的诱导效果最好. 相似文献
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为获得纯净的奶牛乳腺上皮细胞并对细胞中的NOD2受体进行定位,本试验采用胶原酶Ⅰ消化法培养奶牛乳腺上皮细胞,通过免疫荧光技术对细胞进行鉴定并对细胞中NOD2进行定位。结果显示:本试验获得了纯净的奶牛乳腺上皮细胞;NOD2受体多表达于奶牛乳腺上皮细胞的细胞核中,且以核仁的表达量最高。 相似文献
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奶牛乳腺上皮细胞系的培养与鉴定 总被引：4，自引：0，他引：4
《动物营养学报》2015,(8)
本试验旨在培养功能性奶牛乳腺上皮细胞系,为奶牛泌乳调控和奶牛乳房炎发病机制研究提供功能性的细胞模型。采用组织块细胞培养法来分离纯化并鉴定奶牛乳腺上皮细胞;采用有限稀释法单克隆奶牛乳腺上皮细胞;采用噻唑蓝(MTT)法来分析奶牛乳腺上皮细胞的生长曲线是否为正常的"S"形;观察细胞角蛋白18免疫荧光来证明所培养的细胞为上皮型;选择培养至10和20代的奶牛乳腺上皮细胞进行染色体核型分析。结果表明:1)利用组织块细胞分离法能够成功获得奶牛乳腺上皮细胞并传至20代。2)培养5~6 d成纤维细胞迅速增殖且周围分裂出少量的上皮细胞。培养8 d奶牛乳腺上皮细胞迅速增殖,形成岛屿状集落,呈单层"鹅卵石"和"铺路石"形态生长。3)奶牛乳腺上皮细胞角蛋白18鉴定为阳性。4)培养至10和20代的奶牛乳腺上皮细胞染色体数为60条,具有正常的细胞二倍体核型。综上所述,采用组织块培养细胞能够获得具有稳定性、功能性的奶牛乳腺上皮细胞,但不是永生化细胞。 相似文献
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本试验旨在建立原代乳腺上皮细胞系的体外培养方法,并进行β酪蛋白mRNA的表达验证。取新鲜泌乳期的乳腺组织,采用组织块法培养纯化原代乳腺上皮细胞,利用显微镜观察细胞形态并进行细胞生长计数,采用实时荧光定量PCR技术检测β酪蛋白mRNA表达。结果显示,纯化培养的原代乳腺上皮细胞集聚成岛屿状生长,具有典型的铺路石和鹅卵石形状,细胞生长曲线呈"S"形,符合一般细胞的生长规律,并成功表达β酪蛋白mRNA。综上所述,本研究采用组织块法成功培养出具有正常生理功能的奶牛原代乳腺上皮细胞,为后续的乳腺上皮细胞功能研究提供了良好的细胞试验模型。 相似文献
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奶牛乳腺上皮细胞的原代培养及其生物学特性分析 总被引：1，自引：0，他引：1
旨在从奶牛乳腺组织中分离原代乳腺上皮细胞（bovine mammary epithelial cells,BMECs）并传代培养后探究其生物学特性。本研究从屠宰场采集健康泌乳奶牛乳腺并采用改进的酶消化法从乳腺中分离得到原代奶牛乳腺上皮细胞,通过形态学观察、免疫荧光以及染色体核型分析的方法对其进行鉴定。同时,研究第3、第6和第9代乳腺上皮细胞的生长曲线、群体倍增时间和冻存复苏活力,检测不同代次细胞分泌乳蛋白、乳脂、乳糖的功能及泌乳相关基因的表达。结果表明,所分离的奶牛乳腺上皮细胞纯度较好,细胞生长呈现S型,3个代次细胞的群体倍增时间依次为34.87、41.45和65.04 h,冻存复苏活力为88%~93%;在细胞分泌功能方面,诱导培养2 d后均能检测到酪蛋白、甘油三酯和乳糖,且各代次间无显著差异;此外,3个代次的细胞诱导后均能表达乳成分合成相关基因。本研究成功培养了原代奶牛乳腺上皮细胞,并证明直到第9代细胞仍然具有正常的生物学功能,为体外探究乳腺细胞增殖与分化机制提供了良好的试验材料和技术支撑。 相似文献
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从健康奶牛乳房无菌采取乳腺组织,通过添加两种不同的培养液来分离、培养、纯化牛乳腺上皮细胞,研究乳腺上皮细胞的体外培养效果。结果表明,使用组织块接种可以得到大量细胞用于体外培养。在以DMEM/F12为基础的普通培养液中进行乳腺上皮细胞体外培养,原代细胞生长较慢,细胞形态不典型。而添加表皮生长因子、胰岛素、氢化可的松所组成的完全培养液中,奶牛乳腺上皮细胞生长良好。并通过细胞形态学观察,细胞染色体核型分析,荧光免疫细胞染色方法鉴定了培养的细胞表达上皮细胞特异的角蛋白K14,K15。结果表明,分离培养的细胞是牛乳腺上皮细胞。 相似文献
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目的：建立荷斯坦奶牛乳腺上皮细胞的分离培养方法。方法：采用组织块种植法培养奶牛乳腺上皮细胞,利用胰蛋白酶差时消化法分离、纯化上皮细胞。结果：成功培养出奶牛乳腺上皮细胞,显微镜下观察,纯化的乳腺上皮细胞呈典型上皮细胞形态,细胞之间排列紧密,呈鹅卵石铺路样,形态均一,多角形的单层聚集。通过荧光免疫细胞染色方法对细胞骨架蛋白-角蛋白18进行鉴定,呈现阳性反应。乳腺上皮细胞增殖旺盛,经25次以上传代后长势仍然良好。结论：采用组织块种植法结合胰酶差时消化法成功获得纯化的奶牛乳腺上皮细胞。 相似文献
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以奶牛乳腺上皮细胞为细胞模型,用MTT法检测细胞的存活和生长情况,用不同浓度的黄酮溶液(0、100、200、400、600、800mg/L)刺激奶牛乳腺上皮细胞12h,再用相同浓度的黄酮溶液(400mg/L)作用于奶牛乳腺上皮细胞不同时间(1、4、9、12、16、24h),分别提取细胞总RNA,用荧光定量PCR法测定GHR、β-CN、IL-6、IL-8、TNF-α和IFN-γ泌乳相关基因的表达,研究葎草提取物总黄酮对乳腺上皮泌乳及炎性相关因子表达的影响。结果表明,试验组与空白组相比,奶牛乳腺上皮细胞中IFN-γ、TNF-α、IL-6、IL-8的表达水平降低(P0.05);生长激素受体(GHR)、β-酪蛋白(β-CN)的表达量高于对照组(P0.05)。说明葎草黄酮能上调奶牛乳腺上皮细胞β-CN和GHR的表达量,以浓度为400mg/L培养4h~12h的效果最佳。 相似文献
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研究旨在构建具有高效抗菌、活性持久的奶牛乳腺特异性表达质粒,探索研制新型抗菌制剂,为利用基因工程技术防治奶牛乳房炎提供重要材料。根据GenBank中奶牛溶菌酶基因(lysozyme,Lyz)mRNA序列(GenBank号:NM_180999.1)设计引物,从奶牛乳腺上皮细胞中RT-PCR扩增Lyz基因编码序列,将其克隆到携带增强型绿色荧光蛋白通用型表达载体pEGFP-N1中测序。重组质粒pEGFP-N1-Lyz经Ase I+Hind III双酶切除CMV启动子,将奶牛乳腺特异性表达β-乳球蛋白基因(BLG)启动子同源重组替换到Ase I和Hind III酶切位点,构建奶牛溶菌酶基因(Lyz)乳腺特异性表达质粒pBLG-EGFP-N1-Lyz,采用脂质体法转染奶牛乳腺上皮细胞(BMEC)、人肾脏上皮细胞(HEK293T),荧光显微镜检测转染细胞中绿色荧光蛋白的表达情况。结果表明,重组表达质粒pBLG-EGFP-N1-Lyz测序结果与目的片段长度相符,转染至BMEC细胞和HEK293T细胞,在奶牛乳腺上皮细胞观察到绿色荧光, HEK293T细胞未观察到绿色荧光,奶牛Lyz基因乳腺特异性表达质粒构建成功。 相似文献
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《黑龙江畜牧兽医》2020,(4)
为了探讨漏芦乙醇提取物对奶牛乳腺上皮细胞泌乳信号通路的影响,试验以体外培养的奶牛乳腺上皮细胞为模型,先利用CASY细胞活力分析仪检测漏芦乙醇提取物(质量浓度分别为25,50,100,200,400μg/mL)作用于奶牛乳腺上皮细胞后乳腺上皮细胞的活力和增殖能力,选择添加对细胞生长增殖不受抑制即对细胞无毒性的漏芦乙醇提取物浓度来研究其对奶牛乳腺上皮细胞泌乳信号通路信号分子表达的影响。采用确定浓度的漏芦乙醇提取物处理细胞,然后用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测奶牛乳腺上皮细胞泌乳信号通路关键信号分子信号转导与转录激活因子5(STAT5)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、胆固醇调节元件结合蛋白1(SREBP1)、过氧化物酶增殖体激活受体γ(PPARγ)、丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶1(AKT1)和葡萄糖转运蛋白1(GLUT1)基因的mRNA表达水平,以及采用Western-blot技术检测奶牛乳腺上皮细胞泌乳信号通路关键信号分子的蛋白质表达水平。结果表明:较高剂量(200,400μg/mL)的漏芦乙醇提取物显著抑制了奶牛乳腺上皮细胞活力及增殖能力(P0.05),因此选择25,50,100μg/mL的漏芦乙醇提取物来研究其对乳腺上皮细胞泌乳信号通路信号分子表达的影响;25,50,100μg/mL的漏芦乙醇提取物可显著提高细胞泌乳信号通路信号分子STAT5、mTOR、SREBP1、AKT1、GLUT1基因的mRNA表达水平(P0.05)及p-STAT5、p-mTOR、SREBP1、p-AKT1、GLUT1蛋白质表达水平(P0.05),但对PPARγ基因的mRNA表达及蛋白质的表达无显著影响(P0.05)。说明漏芦乙醇提取物能通过调节泌乳信号通路关键信号分子的表达,进而促进奶牛乳腺上皮细胞乳蛋白、乳脂和乳糖的合成。 相似文献
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本试验旨在研究蛋氨酸三肽(Met-Met-Met)对奶牛乳腺上皮细胞(BMECs)酪蛋白和小肽转运载体基因表达量的影响。采用酶消化法培养的第3代奶牛乳腺上皮细胞为模型,各处理在培养基中分别添加0(对照)、40、50、60、70和80μg/mL的蛋氨酸三肽,每个处理5个重复,每个重复1个培养孔,分别培养细胞24、48和72h,检测奶牛乳腺上皮细胞的相对增殖率,整体试验重复2次,确定最佳培养时间;各处理在培养基中分别添加0(对照)、40、50、60、70和80μg/mL的蛋氨酸三肽,每个处理3个重复,每个重复1个培养孔,以最佳培养时间培养,用实时定量PCR法检测酪蛋白基因的表达量,确定适宜蛋氨酸三肽浓度,整体试验重复3次;以最佳培养时间和适宜蛋氨酸三肽浓度培养细胞,以未添加蛋氨酸三肽的培养基为对照,每个处理3个重复,每个重复1个培养孔,测定小肽转运载体基因的表达量,整体试验重复3次。结果表明:在培养基中添加蛋氨酸三肽培养奶牛乳腺上皮细胞24h时,相对增殖率最高;培养基中加入60μg/mL的蛋氨酸三肽培养细胞24h,αs1-酪蛋白和β-酪蛋白的基因表达量最高,同时发现奶牛乳腺上皮细胞中小肽转运载体1和小肽转运载体2基因表达量显著高于对照处理(P0.05)。综上所述,培养基中添加60μg/mL的蛋氨酸三肽能够提高奶牛乳腺上皮细胞酪蛋白和肽转运载体基因的表达量。 相似文献
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奶牛乳腺上皮细胞体外培养研究进展 总被引：1，自引：0，他引：1
《中国奶牛》2021,(9)
体外培养的奶牛乳腺上皮细胞(BMECs)常被用于研究乳成分的合成调控以及乳腺的生理代谢。近年来,随着越来越多永生化奶牛乳腺上皮细胞系的建立,其应用也更为广泛。本文综述了奶牛乳腺细胞系的种类和奶牛乳腺细胞体外培养的方法,为研究乳腺上皮细胞的功能及泌乳机制提供参考。 相似文献
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为体外培养纯化出稳定的奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞,试验通过外科手术的方法取妊娠后期或泌乳期的荷斯坦奶牛乳腺组织,分离乳腺腺泡,用组织块法体外培养奶牛乳腺细胞,应用差时胰酶消化法和差速贴壁法将奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞分别纯化出来,并用免疫组化的方法对细胞的纯度进行鉴定。结果表明:纯化的奶牛乳腺上皮细胞多为多角形,细胞核呈圆形或椭圆形,核仁清晰可见,多呈鹅卵石样或铺路石样生长,并可分泌乳滴,角蛋白-18反应阳性,波形蛋白反应阴性;纯化的奶牛乳腺成纤维细胞多为长梭形,呈旋涡状或放射状生长,角蛋白-18反应阴性,波形蛋白反应阳性;经纯化后2种细胞的纯度均可达95%以上,可满足后续试验的要求。 相似文献
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实验用奶牛乳铁蛋白肽特异性PCR引物从奶牛乳腺组织中扩增奶牛乳铁蛋白肽基因,然后将其连入pCMV-N-eGFP载体中,构建奶牛乳铁蛋白肽的真核表达载体GFP-LfcinB,并将其转染进奶牛乳腺上皮细胞中,分别运用蛋白质免疫印记和牛津杯法等方法检测GFP-LfcinB蛋白在细胞中的表达及其对金黄色葡萄球菌的抗菌活性.结果表明,试验成功的建立了奶牛乳铁蛋白肽的真核表达载体GFP-LfcinB,并且此重组载体能在奶牛乳腺上皮细胞中正常表达具有抗金黄色葡萄球菌活性的GFP-LfcinB蛋白. 相似文献
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应用特异性方法检测转化生长因子(TGF-β1)对奶牛乳腺上皮细胞增殖和凋亡的作用,用不同浓度的TGF-β1作用于体外培养的奶牛乳腺上皮细胞,在不同时间收集培养细胞及其培养液,应用MTT法检测细胞增殖、应用分光度法检测caspase-3活性、测定DNA片段化率法检测细胞凋亡。结果表明,1、5、10ng/mL TGF-β1试验组与对照组比较细胞增殖差异显著(P<0.05),随TGF-β1浓度增大抑制细胞增殖作用增强。细胞凋亡检测显示,1、5、10ng/mL TGF-β1试验组与对照组比较细胞凋亡差异均显著(P<0.05),随TGF-β1浓度增大促进细胞凋亡作用增强。TGF-β1可以抑制奶牛乳腺上皮细胞的增殖,促进奶牛乳腺上皮细胞凋亡。 相似文献
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机械破碎法分离奶牛乳腺上皮细胞的体外培养研究 总被引：10，自引：1，他引：10
采用机械破碎法分离奶牛乳腺上皮细胞 ,并对分离细胞 (试验组 )和未分离的乳腺组织块 (对照组 )进行体外培养 ,研究乳腺上皮细胞体外培养的效果。培养液由DMEM /F1 2 加 2 0 %小牛血清组成 ,培养条件为 5 %CO2 、 37℃。机械破碎法分离的细胞在培养 2d开始生长增殖 ,7d基本长满培养板底部 ;而培养的乳腺组织块细胞到 5d后才呈现旺盛生长 ,长满培养板底部需 1 4～ 1 5d。结果表明 ,机械破碎法是分离乳腺上皮细胞的一种有效方法 相似文献