共查询到18条相似文献，搜索用时 179 毫秒
1.
应用分段RT-PCR的方法从家蚕质多角体病毒(Bombyx mori cytoplasmic polyhedmsis virus,BmCPV）中国株的dsRNA中成功地克隆了RDRP基因(RNA-dependent RNA polymerase),基因序列全长3691bD,并登录GenBank,序列号为AY496445。利用质粒载体pET-28b成功地构建了表达质粒pET28b-RDRP,并用IPTG诱导的方法在大肠杆菌(Escherichia coil)BL21（DE3)中获得表达,分子量约为138kD。以重组蛋白的兔抗为一抗,15mm山羊抗兔IgG-胶体金为二抗,进行免疫标记,电镜定位,结果显示在病蚕中肠的柱状细胞的游离病毒粒子和多角体内的病毒粒子上均能结合胶体金颗粒,标记率为35％左右,证明BmCPV病毒的RDRP复合物确实位于病毒衣壳上。 相似文献
2.
39K同源基因存在于所有鳞翅目昆虫杆状病毒基因组中,其编码产物为一种磷蛋白.迄今的研究表明,39K基因与病毒基因表达调控有关,但家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori Nucleopolyhedrovirus,BmNPV) 39K基因对病毒复制和转录的具体调控作用尚不清楚.本研究利用Red重组技术和Bac-to-Bac系统分别敲除和回补39K基因,构建了39K缺失型病毒39K-ko-Bacmid和修复型病毒39K-re-Bacmid,并分别转染家蚕(Bombyx mori)细胞系BmN细胞,发现二者均能产生具有感染活力的病毒粒子,表明39K基因不是BmNPV复制的必需基因,但是该基因的缺失可显著降低病毒滴度.进一步利用qPCR发现,39K基因缺失对病毒基因组早期基因组的复制没有显著影响,但在后期会降低病毒基因组的复制水平,并导致病毒各时期基因转录水平的极显著下降(P＜0.01).为了进一步了解39K基因对BmNPV极晚期基因多角体启动子的表达调控作用,本研究构建了由BmNPV多角体启动子驱动的萤火虫萤光素酶和家蚕胞质肌动蛋白A3启动子驱动海肾萤光素酶的双萤光素酶报告系统,通过定量检测荧光素酶活性的变化情况,证明了39K基因对多角体启动子具有显著的负调控作用.综上所述,可知39K基因不是BmNPV复制的必需基因,但该基因的缺失可显著降低病毒各时期基因的表达水平,并导致多角体基因启动子的启动活性增强.本研究结果将为深入了解BmNPV 39K基因对病毒基因组复制、转录的影响奠定基础,同时也将为家蚕杆状病毒(Bombyx mori baculovirus)表达系统高效转录机制的研究提供资料. 相似文献
3.
根据BmNPVT3株中p10基因侧翼保守序列设计一对特异性引物,以家蚕核型多角体病毒埃及株(Bombyx mori nuclear polyhedrosis vinus strain Egyptian,BmNPV Eg)基因组DNA为模板,应用PCR技术扩增得到p10基因(GenBank登录号：AF533970)。扩增片段全长为877bp。含有1个213bp的开放阅读框(ORF)、编码70个氨基酸,推测其分子量为7．5kD。序列分析表明：与苜蓿银纹夜蛾(Autographa califoraica)核型多角体病毒(AcMNPV)p10基因及张耀洲得到的BmNPVp10基因相比,BmNPV埃及株及BmNPVT3株的p10基因由于在ORF的第209nt后缺失了1个dATP,从而导致他们的编码区减少了24个氨基酸残基。与BmNPVT3p10相比,BmNPVEgp10又缺失了终止密码子TAA后66～67nt的1个10bp的序列,其中包括poly(A)信号序列。 相似文献
4.
家蚕谷胱甘肽转移酶基因的克隆、序列分析及其表达模式 总被引：2，自引：0，他引：2
谷胱甘肽-S-转移酶(GSTs)是昆虫体内重要的解毒酶系,在对外源和内源化合物解毒代谢中起着重要的作用。以GenBank中已知的昆虫GST的氨基酸序列在家蚕(Bombyx mori)基因组序列中作TBLASTN检索,获得了多个可能的家蚕GST同源基因。对其中的一个GST新基因进行了EST分析和克隆,结果表明,该基因编码区全长663bp。以该基因推导的氨基酸序列与其它物种的GSTs进行相似性比较和系统发育分析,发现此基因为delta家族的成员,并命名为BmGSTd3。RT-PCR结果表明,BmGSTd3基因在家蚕5龄第3天的8个组织中都有表达,中肠和表皮的表达丰度较高。在辛硫磷处理家蚕后的72h内,BmGSTd3基因的转录水平与对照组相比没有显著的变化。对BmGSTd3基因的5'侧翼区的调控序列进行了预测,共发现12个可能与内源和外源物代谢以及抗氧化相关的转录调控元件。 相似文献
5.
为研究应用PCR技术进行家蚕核型多角体病毒广东株的敏感性检验以及探讨不同地理株系的基因水平的相互关系,本文通过对家蚕核型多角体病毒BmNPV广东株的人工繁殖与纯化,引用了一对根据多角体蛋白基因设计的引物phy35／phy36,对BmNPV的基因组模板DNA进行了PCR扩增,并对其产物进行测序分析。结果显示,PCR技术均可扩增检测出3×10^8个／mL至3×10^2个／mL不同浓度的BmNPV模板DNA,特异目标片段大小约为680bp,且扩增带的亮度随着病毒液浓度的降低而减弱,说明应用引物phy35／Dhy36进行PCR方法可以有效地应用于检测BmNPV病毒感染的家蚕。同时,测序获得了BmNPV广东株多角体蛋白pof佩edrin基因674bp大小的片段,GC含量为46．4％。经过BLAST比对分析,与BmNPV泰国株的相似性为99％,暗示家蚕BmNPV广东株与泰国株的BmNPV（登录号AY779044）亲缘关系非常相近,两者可能属于BmNPV的不同地理株系。通过系统发育树的进一步分析发现,家蚕核型多角体病毒广东株polyhedrin基因部分序列与家蚕NPV分离株s9多角体蛋白基因（DQ231336）关系很近。 相似文献
6.
家蚕线粒体基因组全序列测定与分析 总被引：15，自引：0，他引：15
家蚕（Bombyx mori)线粒体基因组全序列为15664bp,AT含量较高，为81．3％，包括13个蛋白质编码基因，2个rRNA基因，22个tRNA基因 一段498bp的A＋T富集区域。与其它10种节肢动物线粒体基因组全序列相比，家蚕与果蝇（Drosophila melanogaster)在核苷酸组成，编码偏好性，以及氨基酸组成上较相近，只是在基因排列上，tRNA^Met的位置发生了重排，在家蚕线粒体基因组中，tRNA^Met位于A＋T富集区与tRNA^Ile之间，而在果蝇中，其位于tRNA^Tln与ND2基因之间。 相似文献
7.
家蚕肌钙蛋白CⅢ(TnCⅢ)是肌钙蛋白C(TnC)的一种亚型结构,本研究利用大肠杆菌表达TnCⅢ融合蛋白,并制备其多克隆抗体.从本实验室的家蚕(Bombyx mori)蛹cDNA文库中搜索到1条编码家蚕肌钙蛋白CⅢ亚型的cDNA序列,将其命名为BmTnCⅢ(Bombyx mori TnCⅢ).该cDNA序列含有完整的ORF,可编码153个氨基酸残基组成的TnCⅢ蛋白.根据该cDNA序列,设计带有BamH Ⅰ和HindⅢ酶切位点的引物,通过RT-PCR的方法从家蚕蛹总RNA中扩增到BmTnCⅢ亚型基因的完整的ORF序列(GenBank登录号为DQ889211),并将其重组到原核表达载体pET-28a相应的酶切位点上.将获得的重组质粒pET-28a-BmTnCⅢ转化大肠杆菌(Escherichia coli)Rosetta(DE3),经1 mmol/L IPTG诱导表达重组蛋白后,在分子量约21 kD处出现融合蛋白条带.用亲和层析的方法纯化目的蛋白His-Tag BmTnCⅢ,并以此为抗原免疫雄性新西兰白兔(Oryctolagus cuniculus),制各了该融合蛋白的多克隆抗体.Western blot结果表明,该多克隆抗体具有较高的特异性,可用于后续的组织分布与定位研究. 相似文献
8.
本研究根据从巴西橡树胶乳cDNA文库中获得的一个EST片段的序列信息设计引物,通过RACE的方法获得了橡胶树编码含有C2结构域蛋白的cDNA（命名为HbC2）。序列分析表明,HbC2长为1185bp,含有813bp的阅读框,140bp的5＇-UTR和232bp的3＇-UTR,编码270个氨基酸,分子量为30.9KD,等电点为6.29,含有保守的C2结构域。半定量RT-PCR分析表明HbC2在花、芽、叶、胶乳和树皮中都有表达,其中在胶乳中表达量最高。茉莉酸可抑制HbC2的表达,乙烯对HbC2的表达没有影响。此研究为进一步研究C2蛋白基因在橡胶树中的生物学功能奠定基础。 相似文献
9.
家蚕真核细胞翻译起始因子(BmeIF4E)基因的克隆、表达及功能分析 总被引：1，自引：0，他引：1
本研究从自建的家蚕(Bombyx mori)蛹期cDNA文库中筛选到一条cDNA序列,发现其在序列和结构上与其他物种的真核细胞翻译起始因子钮基因(BmeIF4E)具有较高的相似性,推测可能是家蚕eIF4E基因,将该序列命名为BmeIF4E,GenBank登录号为DN443192.为研究BmeIF4E的生物学功能,将该基因插入原核表达载体pET-28a(+)中,构建重组质粒pET-28a(+)-BmeIF4E,转化感受态细胞BL21(DE3),IPTG诱导表达并纯化该重组蛋白,制备多克隆抗体.利用家蚕Bm5细胞进行亚细胞定位研究结果表明,BmeIF4E既存在于细胞质中也存在于细胞核中.荧光定量PCR和Westem blot分析结果表明,在不同组织及发育时期该基因的表达有差异,在各组织中BmeIF4E表达量从高到底依次是马氏管、表皮、脂肪体、气管、卵巢、中肠、头和丝腺;在卵、幼虫、蛹和蛾4个发育时期中,蛾中的表达量最高,其次是蛹,再次是五龄幼虫,而在卵中表达量较低.以该基因的ORF为模板体外转录dsRNA,脂质体法转染Bm5细胞,72 h后提取细胞总蛋白作Western blot检测RNA干扰情况,发现BmeIF4E基因被干扰后,总蛋白中目的蛋白含量明显低于阴性对照组.MTT法检测结果表明,干扰后细胞活力也明显下降.研究结果提示,BmeIF4E作为一种重要的管家基因,在家蚕的整个生命周期中均有表达,起着十分重要的作用. 相似文献
10.
家蚕胞质肌动蛋白基因启动子的克隆及piggyBac转座子表达载体的构建 总被引：4，自引：0，他引：4
摘要: 利用PCR方法从家蚕（Bombyx mori）总DNA中克隆到细胞质肌动蛋白基因（cytoplasmic actin）启动子片段，序列分析表明，该片段中含有典型的组成型表达的细胞质肌动蛋白基因A3（BmA3）调控序列：SRE元件（serum response element）和ActE1元件(active element 1)。该序列的核苷酸序列与来自欧洲的一个家蚕品种的序列同源性为94%。通过多次重组，将A3启动子片段(不含信号肽序列)与转座子 piggyBac的转座酶编码区融合构建成辅助质粒；将其(含信号肽序列和部分编码区)与报告基因多管水母绿色荧光蛋白基因gfp融合，插入到人工合成的转座子piggyBac两反向重复末端序列之间，进而构建成基于转座子piggyBac的转基因载体。研究中构建的转座子转基因载体仅6.4 kb，并在两反向重复末端序列之间设计了1个多克隆位点区，便于目的基因的插入。 相似文献
11.
为了探明在浓核病毒镇江株（BmDNV-ZJ）侵染早期,家蚕部分组织蛋白所产生的免疫抵抗性变化机制,本实验采用差异蛋白质组学技术研究分析了BmDNV-ZJ感染早期,家蚕的中肠、血液组织中特异性表达的差异蛋白。实验结果表明：在浓核病毒侵染初期,感受性家蚕的中肠组织受病毒感染而得到特异性表达的蛋白可能为丝氨酸蛋白酶抑制剂和巯基抗氧化酶蛋白,前者具有调控蛋白酶活性和细胞凋亡的功能,后者具有抗氧化的作用。血液组织受病毒感染诱导而产生的蛋白可能是丝裂原活化蛋白激酶和类抗氧化酶蛋白,前者具有调控细胞凋亡的功能,后者具有抗氧化、消除自由基作用。由于试验中所得的差异蛋白点很少,这表明在BmDNV-ZJ感染早期,蚕体对浓核病毒的感染而产生的反应很小。蚕体可通过被侵染的中肠组织（浓核病毒感染的靶部位）P2及血液（免疫组织）共同产生一些抗氧化或调控细胞凋亡的酶蛋白等来抗击浓核病毒的侵染。 相似文献
12.
本研究以优良杂交品种“两广二号”家蚕为试材,克隆了该杂交品种家蚕两个抗家蚕核型多角体病毒（BmNPV）基因：脂肪酶基因Bmlipase-1和丝氨酸蛋白酶基因BmSP-2,测序并分别与不同品种蚕的同源基因序列进行比较。结果显示,“两广二号”家蚕Bmlipase-1基因ORF长度为885bp,编码294个氨基酸,BmSP-2扩增长度为855bp,编码284个氨基酸;它们的核苷酸和推导氨基酸序列同源性皆达92％以上,Bmlipase-1更保守,同源性大于99％;“两广二号”家蚕的Bmlipase-1基因脂肪酶活化部位和BmSP-2基因酶催化三联体位点的氨基酸残基与不同品种蚕的完全相同。以上结果说明这两个抗病毒基因在蚕的遗传进化过程中高度保守,提示其可能在机体消化或者免疫防御方面起着重要生理作用。将这两个抗病毒基因在大肠杆菌BL21中进行融合表达,获得的融合Bmlipase-1和BmSP-2蛋白分子量分别为47kD和42kD左右。 相似文献
13.
LST8（lethal with SEC13 protein 8）是TOR（target of rapamycin）复合物的重要组成成分,在生物生长和发育的调控中发挥重要作用。本研究根据马氏珠母贝转录组数据库中注释为LST8的unigene序列设计引物,采用cDNA末端快速扩增（RACE）技术克隆获得了马氏珠母贝LST8基因cDNA全长序列（pm-LST8）;同时利用荧光定量PCR（Real-time PCR）技术检测了pm-LST8在马氏珠母贝各个组织中的表达含量。结果表明,pm-LST8基因cDNA全长1 350 bp,其中开放阅读框为948 bp,编码316个氨基酸残基,5＇UTR为104 bp,3＇UTR为298 bp,含有29 bp polyA。预测其分子量为35.4 kD,等电点为6.11。多序列比对显示pm-LST8与其它物种的LST8有较高的保守性,与牡蛎的同源序列高达82%。蛋白质结构预测显示pm-LST8具有典型的WD40结构域。荧光定量PCR分析表明pm-LST8在马氏珠母贝闭壳肌、鳃、外套膜、肝胰脏、性腺、足、血淋巴七个组织中均有表达,其中在性腺中表达量最高。本研究为进一步阐述LST8在马氏珠母贝生长和发育调控中的作用提供理论基础。 相似文献
14.
IKKε（inhibitor of NF-κB kinasesε）是NF-κB（nucleur factorκB）信号通路中的关键成员,参与调控细胞的分化、发育、凋亡及免疫反应。本研究根据马氏珠母贝转录组数据库中注释为IKKε的unigene序列设计引物,应用cDNA末端快速扩增（RACE）技术克隆获得了马氏珠母贝（Pinctada martensii）IKKε基因cDNA的全长序列（PmIKKε）并对其序列特征进行分析;同时利用荧光定量PCR（Real-time PCR）技术检测了马氏珠母贝六个组织中PmIKKε基因mRNA的表达。结果表明：PmIKKε基因cDNA全长2 843 bp,其中5＇UTR为116 bp,3＇UTR为516 bp,含有27 bp polyA,开放阅读框为2 211 bp,编码737个氨基酸残基。预测其分子量为85.07 kD,等电点为6.17。多序列比对显示PmIKKε与其它物种IKKε有较高的同源性,与牡蛎的序列相似性有45%。软件分析结果显示PmIKKε的N端含有一个蛋白激酶功能结构域和一个MAPKK（mitogen-activated protein kinase kinase）的激活位点,C端含有一个亮氨酸拉链（leucin zipper,LZ）和一个螺旋-环-螺旋结构（helix-loop-helix,HLH）。荧光定量PCR分析表明PmIKKε在马氏珠母贝肝胰脏、性腺、血淋巴、鳃、外套膜、闭壳肌六个组织中均有表达,肝胰脏中表达量最高。本研究为进一步阐述PmIKKε在马氏珠母贝生长、发育及先天性免疫中的作用提供理论基础。 相似文献
15.
以高羊茅茎基部与叶基部的mRNA为模板,引用基于多年生黑麦草GAPDH基因序列设计的引物,进行RT-PCR分析,同时结合3＇RACE和5＇RACE方法从高羊茅中扩增出两个GAPDH基因,命名为Fa-GAPDH1（GQ480772）与FaG4PDH2（GQ480773）。两序列cDNA全长分别为1281bp和1348bp,具有完整的开放阅读框（ORF,FaGAPDHI：74～1087bp;FaGAPDH2：106～1119bp）,编码蛋白都为337个氨基酸。保守结构域功能分析表明两基因编码的蛋白质都具有典型的Rossman—NAD连接折叠和C-末端结构域。FaGAPDH1和FaGAPDH2蛋白与禾本科植物的该基因蛋白产物比较发现氨基酸序列的同源性都在90％以上,说明两基因具有高度的保守性。 相似文献
16.
本实验从花生果皮种仁抑制消减文库中筛选出了一个255bp的EST序列并进行了研究。构建了花生果种皮全长cDNA库并从中筛选出该基因的全长,命名为AhPSG8。此基因全长1118bp,开放阅读框第33～833个碱基,编码266个氨基酸残基组成的多肽。由生物信息学分析表明该基因编码多个活性位点蛋白,可能与细胞内DNA的转录有关;结构分析揭示出AhPSG8具有一个跨膜区,N端是一个由20个氨基酸组成的信号肽;该基因与已发表的基因序列没有明显的同源性,为一新基因;RT—PCR研究该基因在花生中的表达,结果显示该基因在果种皮中特异表达,10～40d果皮中丰富表达,推测为与花生果种皮发育相关基因。 相似文献
17.
在成功构建乙烯利刺激条件下巴西橡胶树胶乳差异表达cDNA消减文库的基础上,我们克隆了巴西橡胶树胶乳UEP（ubiquitin extension protein）基因的cDNA全长序列。结构分析表明,该基因cDNA全长771bp,拥有一个468bp的开放阅读框架,77个核苷酸的5`UTR和226个核苷酸的3`UTR,编码156个氨基酸;Southern blot检测结果显示,UEP基因在巴西橡胶树基因组中属低拷贝基因。胶乳UEP基因的表达受到乙稀利的调节。在乙烯利处理后的24小时内,12小时收集的胶乳中UEP基因表达最强,对照和处理6小时的胶乳中表达最弱。乙烯利刺激可以促进巴西橡胶树胶乳增产和加速乳管衰老。这一结果暗示,UEP基因可能参与了乙烯利刺激巴西橡胶树胶乳增产或加速乳管衰老程的分子调控。 相似文献
18.
谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidases,GPXs,EC1.11.19)是生物体内抗氧化防御系统的重要组成部分。本文从草鱼(Ctenopharyngodon idellus)克隆到胞浆谷胱甘肽过氧化物酶基因(GPX1)cDNA全长序列。该序列全长890bp(GenBank accession No.EU828796),包括完全开放阅读框(ORF)576bp、5'非编码区(5'-UTR)17bp和3'-UTR297bp。其ORF编码191个氨基酸残基,包含一个由"UGA"(通常为终止密码子)编码的硒代半胱氨酸(selenocysteine,Sec40)残基,并与另2个残基(Glu75和Trp153)构成酶活性中心。同时,草鱼GPX1cDNA的3'-UTR中具有保守的硒代半胱氨酸插入序列(selenocysteine insertion sequence,SECIS)元件。氨基酸序列相似性比较显示,草鱼GPX1cDNA的推测氨基酸序列(GenBank accession No.ACF39780)与斑马鱼GPX1(GenBank accession No.NP_001007282)的相似性... 相似文献