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1.
目的:构建小鼠染色质区解旋酶DNA结合蛋白5(CHD5)基因干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)重组腺病毒载体并在NIH3T3细胞中验证其干扰作用.方法:人工合成靶向CHD5的siRNA干扰序列,用分子克隆的方法插入到穿梭载体pSES-HUS上,并与腺病毒骨架质粒pAdeasy-1在BJ5183细菌中进行同源重组,得到pAdeasy-SES-HUS-CHD5siRNA重组质粒,在HEK293细胞中包装成重组腺病毒Adr-simCHD5,然后感染NIH3T3细胞,用RT-PCR和Western Blot方法检测其对CHD5mRNA和蛋白表达的干扰效果.结果:得到高滴度Adr-CHD5siRNA重组腺病毒,RT-PCR和Western Blot结果表明该重组腺病毒能有效地降低CHD5基因的表达.结论:成功构建Adr-CHD5siRNA重组腺病毒载体,并在NIH3T3细胞上实现CHD5基因表达抑制,为进一步研究CHD5基因功能奠定了基础. 相似文献
2.
构建一个对虾WSSV VP281基因的siRNA筛选体系,获取有效siRNA,为进一步开展siRNA抗WSSV研究建立基础.根据已报道的VP281基因编码序列,设计并合成一对引物,扩增出带双酶切位点的VP2 81.对VP281和质粒pEGFP-C1分别酶切后进行连接,获取表达载体pEGFP-VP281.利用专业软件设计3对靶向VP281的siRNA(VP281 -siRNA1、VP281-siRNA2、VP281 -siRNA3),并合成siRNA,将3种siRNA分别与pEGFP-VP281共转染PK细胞.采用Western blot方法检测GFP-VP281融合蛋白的表达,半定量RT-PCR方法检验siRNA抑制VP2 81基因转录的效果.结果显示,pEGFP -VP281可在BHK细胞正常表达融合蛋白GFP-VP281.3对siRNA对GFP-VP281的mRNA转录均有不同程度的干扰效果,siRNA2的干扰效果最为显著.构建针对WSSV-VP281基因的siRNA筛选体系,初步验证了该系统的有效性,为开展siRNA抗WSSV研究建立了基础. 相似文献
3.
【目的】应用RNA干扰技术沉默小鼠胚胎成纤维细胞（Mouse embryonic fibroblast,MEF）中诱导型热休克蛋白70（Hsp72）基因的表达,从而筛选出对Hsp72基因具有确实干扰作用的siRNA。【方法】设计并合成4对特异性针对Hsp72基因的siRNA,借助LipofectamineTM 2000瞬时转染MEF,41℃热应激处理后,采用RT-PCR和Western blot检测Hsp70 mRNA和Hsp70蛋白表达量。【结果】在热应激组中,siRNA1、siRNA2两组及阳性、阴性和空白3个对照组的Hsp70 mRNA和Hsp70蛋白表达量均极显著高于常温对照组（P＜0.01）,siRNA3和siRNA4两组的Hsp70 mRNA的表达量极显著低于常温对照组（P＜0.01）;siRNA3组Hsp70蛋白表达量极显著低于常温对照组（P＜0.01）,而siRNA 4组与常温对照组差异不显著（P＞0.05）。与空白对照相比,4对siRNA中siRNA3和siRNA4对MEF中Hsp72 mRNA有极显著（P＜0.01）的抑制作用,其对Hsp72 mRNA的抑制率分别为86.2%和75.4%（P＜0.01）,对Hsp72蛋白表达的抑制率分别为77.3%和57.0%（P＜0.01）。【结论】体外合成的四对特异性针对Hsp72基因的siRNA中,靶位点在Hsp72 mRNA二级结构表面位置的siRNA3和siRNA4对Hsp72基因具有显著的抑制作用,靶位点在Hsp72 mRNA二级结构复杂处的siRNA1和siRNA2对Hsp72基因的抑制作用不明显。 相似文献
4.
目的探讨诱导PC12细胞分化的神经细胞靶向沉默Smad7基因特性,同时进行沉默效果检测．方法以Smad7基因为靶目标,设计合成3条siRNA序列,进行细胞转染,利用Rea1time—PCR和Westernblot技术检测沉默效果,筛选出最有效的干扰序列,同时检测出最佳的转染浓度和转染时间．结果针对Smad7基因设计合成及筛选出靶向沉默Smad7基因的干扰序列（siRNA1）;siRNA1的最佳转染浓度是4μg／mL;siRNA1的最佳转染时间是24h;siRNA1对Smad7的抑制效果优于其他干扰序列．结论siRNA1能有效沉默Smad7基因;lipofecta—mineTM2000可成功将siRNA1转染至神经细胞,转染效率较高;利用siRNA技术能有效抑制神经细胞． 相似文献
5.
siRNA抑制口蹄疫病毒在BHK-21细胞中复制的研究 总被引：1，自引：0，他引：1
选取口蹄疫病毒(FMDV)的VP1、IRES、2B、3D和L基因保守序列,设计、合成siRNA,并成功构建表达siRNA的穿梭载体,通过脂质体2000在BHK-21细胞上转染6个重组siRNA表达质粒,观察其对FMDV S72毒株复制的抑制效果.结果发现:病毒对照和空载体对照细胞死亡脱落,脂质体2000对照和细胞对照细胞状态良好; 6个siRNA转染孔细胞状态明显优于病毒对照孔,表明6个重组质粒转染后均可以显著抑制FMDV S72毒株的复制,其中靶向IRES1基因的siRNA对FMDV的复制抑制最为明显. 相似文献
6.
《扬州大学学报(农业与生命科学版)》2017,(1)
根据猪肌肉斯钙素(STC)mRNA序列设计3对小干扰RNA(siRNA)、阴性对照siRNA,转染PK15细胞后,通过荧光观察转染效率和基因表达效率,利用实时荧光定量PCR(QRT-PCR)及Western blot测定细胞内siRNA基因沉默后STC-1siRNA及蛋白的表达水平。结果表明:3个STC-1siRNA转染细胞后均有较高的荧光信号;STC-132细胞组STC-1mRNA和STC-1蛋白相对表达水平都最低,该组与其他组差异极显著。结果说明成功设计出STC-1siRNA序列,为后续通过调控STC-1表达研究其在肌肉发育中的功能奠定了基础。 相似文献
7.
8.
RNA干扰用siRNA的体外转录合成 总被引：4，自引：0，他引：4
RNA干扰(RNA interference，RNAi)作为一种特异性沉默基因表达的方法，正在成为研究基因功能、胚胎发育及病毒性疾病治疗的重要工具，而获得符合干扰要求的短双链干扰RNA(small interference RNA，siRNA)是进行RNA；研究的首要步骤。本研究建立了体外转录合成siRNA方法。并用其生成的siRNA干扰鸡成纤维细胞外源绿荧光蛋白(GFP)基因和内源3—磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)基因的表达。结果显示，siRNA能特异性降低鸡成纤维细胞中内外源基因的表达。本实验认为这种以DNA为模板体外转录合成siRNA方法操作简单、成本低、产物得率高，值得从事RNA研究者参考借鉴。 相似文献
9.
以免疫印迹法检测不同浓度香烟烟雾提取物(CSE)作用下气道平滑肌细胞(ASMCs)中CCAAT增强子结合蛋白α(C/EBPα)、细胞周期蛋白激酶2(CDK2)、细胞周期蛋白激酶4(CDK4)的蛋白水平。以MTT法、流式细胞术分析不同浓度CSE作用下ASMCs的增殖及细胞周期分布。分别以阴性对照siRNA、C/EBPαsiRNA进行ASMCs的细胞转染,比较阴性对照siRNA组与C/EBPαsiRNA组中ASMCs的C/EBPα、CDK2、CDK4的表达及细胞增殖、细胞周期分布的差异。结果表明:1随CSE浓度的增高,C/EBPα的表达逐渐降低,而CDK2、CDK4的表达及细胞增殖程度逐渐增高(P0.05);C/EBPα蛋白的表达与细胞增殖程度、CDK2、CDK4的表达均呈负相关,其相关系数(r)分别为0.813、0.862、0.784(P0.05);2 C/EBPαsiRNA组AMSCs中C/EBPα的表达低于阴性对照siRNA组(P0.05),而CDK2、CDK4的表达及细胞增殖程度高于阴性对照siRNA组(P0.05)。C/EBPαsiRNA组AMSC中G0/G1比例低于阴性对照siRNA组;而S期、G2/M期比例高于阴性对照siRNA组(P0.05)。研究说明在CSE作用下ASMCs中C/EBPα表达减弱,使CDK2、CDK4表达增加而加速细胞周期进程,最终促进AMSCs的增殖。 相似文献
10.
【目的】从能量代谢的角度探索罗氏沼虾生长缓慢的原因,为分析和解决罗氏沼虾生长缓慢问题提供参考。【方法】利用合适浓度的siRNA抑制罗氏沼虾肝胰腺和肌肉中COX2基因的表达,分析肝胰腺和肌肉中线粒体呼吸链相关基因表达量和酶活性以及ATP含量的变化;通过持续抑制罗氏沼虾COX2基因的表达,分析其对罗氏沼虾生长的影响。【结果】siRNA对罗氏沼虾线粒体编码的COX2基因表达有抑制作用,在一定浓度范围内,随着siRNA浓度的增加抑制的作用越明显,超过一定的浓度范围的siRNA抑制作用不明显,浓度为2.0μg/g的siRNA与0.8、1.5、3.0μg/g的siRNA的抑制作用相比效果最好。罗氏沼虾注射siRNA后,肝胰腺和肌肉中的COX2基因表达量下调,ND1和ATP6基因表达量随之下调,COX、ATP合酶、CCR和ND的酶活性显著下降（P<0.05,下同）,ATP含量降低。连续注射siRNA能持续抑制罗氏沼虾肝胰腺和肌肉中COX2基因的表达,随着siRNA注射次数的增加,抑制COX2基因表达的作用时间也增加,在注射4次2.0μg/g siRNA虾的肝胰腺和肌肉中,COX2、ND1和ATP6的基因表达量持续下调的时间最长,COX、ATP合酶、CCR和ND的酶活性能长期保持在显著低于对照组的水平,ATP含量也显著低于对照组。随着肝胰腺和肌肉中COX2基因表达被抑制时间的增加,罗氏沼虾的体长与体重增加量越小,养殖28d后,注射1次siRNA和注射4次siRNA的虾的体重净增长分别为0.59和0.34g。【结论】当参与ATP合成的酶的基因表达量和酶活性长时间受到抑制时,会抑制罗氏沼虾的生长。 相似文献
11.
通过对贵州省8个主植烟区的384个土壤样品进行分析,旨在了解各主植烟区的土壤肥力状况,为各烟区科学施肥提供合理的建议。分析结果认为,贵州省各主植烟区的氮含量丰富。其中,铜仁铵态氮含量最高,为21.41mg/kg;贵阳最低,仅为17.06mg/kg。贵阳硝态氮含量最高,为23.47mg/kg;铜仁最低,为17.99mg/kg。黔南速效磷含量最高,达到18.07mg/kg;黔西南最低,为8.29mg/kg。遵义速效钾含量最高,为178.29mg/kg;黔东南最低,仅为137.36mg/kg。有机质含量以六盘水最多,为34.36g/kg;铜仁最低,为22.53g/kg。各烟区的土壤均表现偏酸性。综合比较,遵义、毕节、黔南三个地区土壤肥力的综合表现最佳,满足优质烟草的生长条件。 相似文献
12.
[目的]为热带、亚热带玉米种质利用提供参考与依据。[方法]选择改良苏湾群体的46个株系。收获前调查农艺性状,收获后考察穗部性状。[结果]在46个株系中,平均株高为249cm,最高为300cm,最低为195cm。穗位最高为124cm,最低为89cm,平均为108cm。叶片最多为22片,最少为18片,平均为20片。茎杆最粗为3．0cm,最细为1．6cm,平均粗度为1．9cm。穗长最长为19．2cm,最短为11．3cm,平均穗长15．6cm。穗行数最多为17行,最少为13行,平均穗行数为14．5。行粒数最多是38粒,最少是17粒,平均行粒数是30．5粒。最重穗重为190．8g,最轻为68．5g,平均穗重为143．2g。穗重变异系数最大,为19.8％。硬粒型占样本总数的89．1％,籽粒颜色以黄色和橙黄色为主。[结论]苏湾群体株系的多数性状符合育种要求。 相似文献
13.
超声提取天麻中天麻素优化工艺研究 总被引：7，自引：2，他引：5
[目的]探索超声波提取天麻中天麻素的最佳工艺。[方法]以天麻素含量为指标,通过L9（34）正交试验对天麻素的提取工艺进行优选。[结果]天麻素的标准曲线回归方程为：Y=14.549X＋21.925,R2=0.999 8。在0.053 5-2.140 0μg范围内,天麻素的进样量与峰面积呈良好线性关系。甲醇体积分数在70%以下时,随着甲醇浓度的增加,天麻素的提取率逐渐增加;甲醇体积分数超过80%时,天麻素的提取率下降。超声波功率低于350 W时,随着超声波功率的增加提取率增大;功率超过350 W时,提取率降低。超声提取5-30 m in时,提取率逐渐增加;超声提取30-40 m in时,提取率减少。溶剂体积为50 m l时提取率最高。[结论]提取天麻中天麻素的最佳条件为：甲醇体积分数为70%、溶剂体积为50 m l、超声功率为300 W、超声提取温度为55℃、超声时间为30 m in。 相似文献
14.
北京市八达岭林场水源涵养林空间结构特征研究 总被引：1，自引：0，他引：1
研究北京市八达岭林场水源涵养林主要森林类型（油松人工林、元宝枫人工林、黄栌人工林和辽东栎天然林）混交度、角尺度和大小比数等结构参数,分析其空间结构特征,以期为研究区水源涵养林经营提供依据。结果表明,油松人工林混交度为0.207,介于零度和弱度混交之间;角尺度为0.496,为随机分布;大小比数为0.506,处于劣势到中庸状态。元宝枫人工林混交度为0.053,介于零度和弱度混交之间;角尺度为0.523,为聚集分布;大小比数为0.503,处于劣势到中庸状态。黄栌人工林混交度为0.310,介于弱度和中度混交之间;角尺度为0.499,为随机分布;大小比数为0.420,处于中庸到亚优势状态。辽东栎天然林混交度为0.442,介于弱度和中度混交之间;角尺度为0.494,为随机分布;大小比数为0.512,处于劣势到中庸状态。可见,北京市八达岭林场水源涵养林空间稳定性较差,天然林空间结构稍优于人工林。 相似文献
15.
[目的]观察5种动物纤维的微观结构。[方法]以旱獭、青根貂、玛瑙、黄？、猸子为试验材料,利用扫描电镜法比较其鳞片层结构特征。[结果]旱獭针毛翘角平均值为37.0°,鳞片高度平均值为7.76μm,鳞片厚度平均值为0.43μm,绒毛翘角平均值为25.4°,鳞片高度平均值为14.57μm,鳞片厚度平均值为0.68μm;针毛鳞片高度平均值为4.58μm,鳞片厚度平均值为0.22μm,绒毛翘角平均值为24.7°,鳞片高度平均值为11.14μm,鳞片厚度平均值为0.40μm;针毛翘角平均值为31.9°,鳞片高度平均值为10.65μm,鳞片厚度平均值为0.52μm,绒毛翘角平均值为24.8°,鳞片高度平均值为9.30μm,鳞片厚度平均值为0.46μm;黄？针毛翘角平均值为37.8°,鳞片高度平均值为4.33μm,鳞片厚度平均值为0.24μm,绒毛鳞片高度平均值为13.88μm,鳞片厚度平均值为0.65μm;猸子针毛鳞片高度平均值为8.66μm,鳞片厚度平均值为0.36μm,绒毛翘角平均值为23.6°,鳞片高度平均值为11.13μm,鳞片厚度平均值为0.56μm。[结论]不同种的动物纤维具有独特的形态特征,在内部超微结构上存在明显的差别。 相似文献
16.
利用滨州市1971~2000年降水、气温、湿度等资料,解析滨州市(鲁北地区)干旱化趋势。结果表明,滨州市降水量每10年减少26mm。升温达0.03℃/a,夏秋季温度升高,其中20世纪90年代比70年代高出0.5℃以上,特别是冬季竟高出了1.4℃。这与全国乃至全球变暖趋势一致。通过对滨州1971~2000年观测资料中有关数据的计算,滨州市近30年气候变化已呈现出年降水量总体上持续降低、气温总体上持续升高,且当地水热平衡已明显呈现出新的关系和规律的状况。滨州市年湿润指数呈明显下降趋势,气候干旱化。湿润指数平均10年减少0.057,主要原因是降水量逐年减少,气温逐年上升。受其影响,蒸散量平均每10年增加26.85 mm。滨州市这种干旱化趋势与副高综合指数、副高面积和强度指数的年代际变化与极涡中心平均纬度和平均经度的年代际变化有直接关系。 相似文献
17.
[目的]为推进湖南省砂梨种植结构的合理化。[方法]对砂梨品种翠冠、清香、雪英、雪峰的田间生长性状、丰产性和果实品质进行测定,筛选适合湖南栽培的早熟砂梨品种。[结果]4个品种的生长性状在湖南的表现为雪峰>清香>雪英>翠冠。雪英的可溶性固形物含量最多,糖酸比最高,故品质最佳,翠冠、雪峰一般,清香最差。雪英的果数最多,丰产性表现最好,翠冠较好,清香一般,雪峰最差。方差分析表明雪英综合表现最佳,翠冠表现次之,清香表现一般,雪峰表现最差。采用多维价值理论进行合成"合理-满意度"的定性分析表明雪英表现最佳,复合合意度最高为0.72,翠冠表现较好,清香表现一般,雪峰表现较差。[结论]定量和定性分析均表明雪英综合表现最好,可以成为湖南早熟砂梨主栽品种。 相似文献
18.
[目的]建立毛细管气相色谱（GC）-石墨炉原子吸收（GFAAS）联用测定甲基汞的方法。[方法]用正已烷萃取土壤样品中氯化甲基汞（MMC）,以OV-17毛细管柱分离,于500℃检测氯化甲基汞的含量。[结果]用温度传感器测定管内温度并以自制电路系统将转移线温度控制在（120．0±0．5）℃。正已烷的背景吸收小,萃取效果较好,且沸点较低,毒性较小。价格便宜,故选用正已烷作萃取剂。加入EDTA消除了金属离子的干扰。原子化温度为500℃。标准工作曲线的方程为y=0．0109＋0．0024x。线性范围为8～50ng,相关系数为0．9972。MMC的检测限为0．6ng。污水处理池的淤泥中MMC的平均含量为28．7ng／g,其RSD与加标回收率分别为3．38％和90．8％。未从农田土壤样品中检测出MMC。[结论]该方法简便、快速、准确,可用于土壤样品中有机汞的分离测定。 相似文献
19.
从长白猪肝脏细胞中提取总RNA,通过RT-PCR法扩增pMBL-A基因,与pMD18-T载体连接进行TA克隆,得到猪甘露聚糖结合凝集素A(poreine mannan-binding lectin A,pMBL-A)基因.再亚克隆到pPROEXHTb表达载体上,构建重组表达质粒.将阳性重组表达质粒转化到大肠杆菌中诱导表达重组pMBL-A蛋白,通过SDS-PAGE检测蛋白的表达情况.结果成功扩增得到包括完整开放读码框长为875bp的全长cDNA片段,并原核表达了重组蛋白,为进一步研究该蛋白的遗传特征以及为猪遗传育种方面的研究提供依据. 相似文献